البروتياز بشكل محكم التنظيم الإنزيمات المشاركة في العمليات البيولوجية الأساسية، ومبطلات dysregulated النشاط محركات تطور الأمراض المعقدة مثل السرطان. هذا الأسلوب يهدف إلى إنشاء nanosensors التي تقيس حوزتي النشاط في فيفو بإنتاج إشارة انقسام وأن قابلاً للاكتشاف من البول المضيف وتميز المرض.
البروتياز هي إنزيمات متعددة الوظائف التي تتخصص في التحلل المائي للسندات ببتيد والتحكم بالعمليات البيولوجية واسعة النطاق بما في ذلك التوازن واللوستاسيس. وعلاوة على ذلك، يدفع المرضية dysregulated حوزتي النشاط وهو العلامات البيولوجية وظيفية من الأمراض مثل السرطان؛ ولذلك، قد توفر القدرة على الكشف عن حوزتي النشاط في فيفو المعلومات ذات الصلة سريرياً للتشخيصات الطبية الحيوية. والهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء nanosensors التحقيق مبطلات النشاط في فيفو بإنتاج إشارة قابلة للقياس في البول. Nanosensors مبطلات هذه تتكون من عنصرين هما: نانوحبيبات والركيزة. وظائف نانوحبيبات لزيادة تعميم التسليم نصف العمر والركيزة لمواقع الأمراض المستهدفة. الركيزة هو سلسلة ببتيد قصيرة (أ أ 6-8)، التي صممت لتكون محددة بحوزتي الهدف أو مجموعة من البروتياز. الركيزة هو مترافق على السطح نانوحبيبات وأنهى أحد الصحفيين، مثل علامة نيون، للكشف. كما البروتياز dysregulated تنشق الركيزة الببتيد، يتم تصفية المراسل في البول للتقدير الكمي كالعلامات البيولوجية لنشاط البروتياز. وهنا يصف لنا بناء نانوسينسور لمصفوفة أية 9 (MMP9)، الذي يرتبط بتقدم وتطور ورم خبيث، للكشف عن سرطان القولون والمستقيم في طراز ماوس.
البروتياز هي إنزيمات متعددة الوظائف التي تتخصص في التحلل المائي للسندات ببتيد وسيطرة كبيرة على العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التوازن، اللوستاسيس، والمرض1. وقد تم يرتبط تغيير حالة نشاط البروتياز لمجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية، مما يجعل المرشحين البروتياز جذابة للتنمية إلى المؤشرات الحيوية السريرية2،3. وعلاوة على ذلك، هو نشاط البروتياز باثوجينيسيس مرتبطة وظيفيا متميزة ونتائج المرضى وتشخيص المرض4. على نطاق واسع، وقد وضعت هذه الأجهزة للكشف عن مختلف الظواهر البيولوجية والأمراض، مثل السرطان وأمراض الأعصاب، ونقل الإلكترون العمليات5،،من67،8 , 9-وبشكل أكثر تحديداً، قد وضعت للكشف عن نشاط البروتياز، وتشمل تحقيقات فلوروجينيك للتشخيص التصوير10 أجهزة استشعار حوزتي المستندة إلى الركيزة ونظير المسمى الببتيد ركائز المختبر في الكشف بواسطة الكتلي11. وباﻹضافة إلى ذلك، وضعت التحقيقات على أساس النشاط، التي تحتوي على مناطق مثل الركيزة التي تربط أو تعديلها حوزتي الهدف12. باستخدام هذا الأسلوب، لا رجعة فيه تحول دون البروتياز الهدف عندما يتم تعديل الموقع النشط، ويتطلب تحليل الحصاد من الأنسجة، مما يحد من التطبيقات في فيفو . ومع ذلك، من المهم الشعور بحوزتي النشاط في فيفو، نظراً لتنظيم نشاط البروتياز يعتمد اعتماداً كبيرا على سياق الأنشطة البيولوجية الأخرى مثل وجود مثبطات الذاتية.
والهدف من هذا العمل هو لوصف وضع nanosensors على أساس النشاط التي تكشف عن حوزتي النشاط في فيفو بإنتاج إشارة قابلة لقياس في البول. هذا المنهاج كتشخيص موسع لتميز أمراض معقدة مثل السرطان باستخدام dysregulated حوزتي النشاط كالعلامات البيولوجية وظيفية. برنامجنا نانوسينسور يتكون من أكسيد الحديد جسيمات نانوية (إيونب) مترافق بحوزتي ركائز. يتم إنهاء هذه ركائز حسب مراسل فلورسنت الذي صدر عند البروتياز تنشق الركازة. هذه إيونبس تعمم في فيفو، ترجمة لمواقع المرض، وفضح ركائز لنشاط البروتياز المرتبط بالمرض. بعد انشقاق، الصحفيين الفلورسنت يتم إصدارها، ونظرا لصغر حجمها، يتم تصفيتها في البول، بينما تبقى ركائز أونكليافيد على إيونب في الجسم. ولذلك، سيؤدي إلى زيادة في حوزتي الأنشطة في فيفو في تركيزات أعلى من مراسل في البول (الشكل 1). أن برنامجنا اختبار بول، لا منصة التصوير مطلوب ويتم إثراء إشارات تشخيصية في البول.
يمكن تصميم هذا المنهاج للكشف عن مجموعة متنوعة من الأمراض بما فيها السرطان والتليف وتجلط الدم13،14. هنا يمكننا وصف تصميم nanosensors للكشف عن الارتفاعات في مصفوفة ميتالوبيبتيداسي 9 (MMP9) النشاط كالعلامات البيولوجية لسرطان القولون والمستقيم. سرطان القولون والمستقيم هو السبب الرئيسي الثاني للوفاة من السرطان في الولايات المتحدة، مع حدوث حالات جديدة 136,800 المقدرة والوفيات 50,300 في 2014 وحدها15. تنتج الخلايا السرطانية القولون MMP9، التي أظهرت أن محرك التقدم الخبيث، وتدهور مصفوفة، فضلا عن ورم خبيث16. بالإضافة إلى ذلك، حددنا الركازة ببتيد مناسبة (بلجفرجك) ل MMP9 من الأدب17. يمكن استخدام هذا البرنامج للكشف المبكر عن السرطان وتشخيص نقطة الرعاية المنخفضة التكلفة13،14،18،19،،من2021.
رقم 1: التخطيطي “النشاط نانوسينسور” في فيفو. Nanosensors تعمم عن طريق الهيئة وتعريب لمواقع مرض. ثم تنشق البروتياز المتعلقة بالمرض ركائز الببتيد التي قدمها إيونبس. حجم الشظايا ملصوق يسمح لتطهير الكلي، مما أدى إلى حصر في البول. بعد التبول الحيوان، يمكن تحليل هذه الشظايا الببتيد من جزيء مراسل بهم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ويصف هذا الأسلوب تطور nanosensors على أساس النشاط تتكون من ركائز حوزتي مترافق لنواة نانوحبيبات. حدث انشقاق بروتيوليتيك أطلق عليها اسم “التبديل الحرائك الدوائية”، نظراً لأن المنتجات الببتيد ملصوق أصغر من حد الحجم الكلي الترشيح من 5 نانومتر23 والتصفية في البول لإنتاج إشارة موسع. ولذل…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا العمل “جائزة ابتكار جديدة” لمدير المعاهد الوطنية للصحة (رقم الجائزة DP2HD091793). Q.D.M. معتمد من قبل “جبهة الخلاص الوطني الدراسات العليا البحوث برنامج الزمالات” (رقم المنحة DGE-1650044). B.A.H معتمد من قبل الوطنية معاهد للصحة GT BioMAT التدريب المنحة تحت “رقم جائزة” 5T32EB006343 فضلا عن الزمالات لرئيس جورجيا تك. G.A.K. حاصل على جائزة الوظيفي الواجهة العلمية من “صندوق بوروز الترحيب”. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية “المعاهد الوطنية للصحة”.
0.2 µm syringe filters | VWR | 4652 | |
18G needle | VWR | 89134-024 | |
15 mL conicals | VWR | 89039-670 | |
250 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89000-362 | |
Stir bar | VWR | 58949-006 | |
Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-634 | |
Glacial acetic acid | VWR | 97064-482 | |
Albumin from Bovine Serum (BSA) | Thermo Fisher | A13100 | |
Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma | 236489 | |
Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 44939 | |
Epichlorohydrin | Sigma | 45340-500ML-F | |
DMF | Sigma | D4551 | |
Ammonium Hydroxide | Sigma | 320145-500ML | |
Sodium Hydroxide pellets | Sigma | 221465-500G | |
EDTA | Sigma | E9884 | |
Sodium Borate | Sigma | B9876 | |
L-Cysteine | Sigma | 168149-100G | |
Tris-HCl | Sigma | T5941 | |
Tris base | Sigma | T6066 | |
PBS tablets | Sigma | P4417 | |
Dextran | Pharmacosmos | 5510 0020 9006 | |
Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk | Millipore | UFC901024 | |
Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk | Millipore | UFC903024 | |
Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk | Millipore | UFC910024 | |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | NanoZS | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | LifeTech | 66130 | |
Dynabeads MyOne Tosylactivated | LifeTech | 65501 | |
SIA | Life Tech | 22349 | |
PEG 20k | Laysan Bio | MPEG-SH-20K-1g | |
Fluorescein Antibody [2A3] | GeneTex | GTX10257 | |
Hiload 16/600 superdex 200 | GE Healthcare | 45-002-490 | |
Plate Reader | Fisher | BTCYT5M | |
BD Insulin Syringes | Fisher | NC0872854 |