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Neuroscience

Un análisis de gradiente de temperatura para determinar las preferencias térmicas de larvas de Drosophila

doi: 10.3791/57963 Published: June 25, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para determinar la temperatura ambiente preferida de larvas de Drosophila usando un gradiente térmico continuo.

Abstract

Muchos animales, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, son capaces de discriminantes diferencias minutos en temperatura ambiente, que les permite buscar su paisaje termal preferido. Para definir las preferencias de la temperatura de las larvas sobre un rango lineal definido, hemos desarrollado un ensayo utilizando un gradiente de temperatura. Para establecer un gradiente solo bidireccional, dos bloques de aluminio están conectados con baños independientes, cada una de ellas controla la temperatura de bloques individuales. Los dos bloques establece los límites inferiores y superiores del gradiente. El gradiente de temperatura se establece mediante la colocación de una placa de aluminio recubierto de agarosa sobre los dos bloques de agua controlada para que la placa extiende la distancia entre ellos. Los extremos de la placa de aluminio que se encuentra en la parte superior de los bloques de agua define las temperaturas mínimas y máximas, y las regiones entre los dos bloques forman un gradiente lineal de la temperatura. El análisis de gradiente puede ser aplicado a las larvas de diferentes edades y puede ser usado para identificar a mutantes que exhiben fenotipos, como aquellas con mutaciones que afectan a genes que codifican los canales TRP y opsins, que se requieren para la discriminación de temperatura.

Introduction

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Thermotaxis es empleado por los animales móviles para seleccionar un entorno con las condiciones más favorables1,2,3. Si el clima es excesivamente frío o caliente, este comportamiento es vital para la supervivencia. Además, muchos animales son sensibles a diferencias muy pequeñas de temperatura en la gama cómoda y buscan un entorno con una temperatura ideal. Esto es de particular importancia para los organismos poiquilotérmicas como moscas de la fruta, que equilibre su temperatura corporal con el medio ambiente. Ensayos para controlar larvas thermotaxis han sido instrumentales en identificar y clarificar las funciones de sensores moleculares tales como Drosophila potencial Receptor transitorio (TRP) canales4,5,6, rodopsinas7,8e ionotrópicos del receptor receptores (IRs)9, que dotan a estos animales con sensibilidad de temperatura sobre rangos de temperaturas diferentes.

Una prueba de selección bidireccional proporciona un método para estudiar las preferencias térmicas en larvas6,7. El ensayo consiste en establecer dos zonas de distinta temperatura y permite a los animales seleccionar un lado sobre el otro. Los resultados de pruebas de dos vías de elección pueden ser sólidos, especialmente si son grandes las diferencias de temperatura entre las dos opciones. Además, puesto que cada ensayo implica tabular sólo dos grupos, los datos pueden expresarse como un índice simple preferencia. La facilidad y sencillez de los análisis de dos vías de elección son también susceptibles a las pantallas de la genéticas. Sin embargo, una limitación importante es que muchos experimentos se necesitan para establecer la temperatura preferida de los animales de tipo silvestre o mutantes.

Un análisis de gradiente ofrece la oportunidad de establecer la temperatura preferida en un solo análisis8. Además, a diferencia de la prueba de selección bidireccional, permite la evaluación de la distribución de un grupo de animales, cuando se enfrentan a un rango continuo de temperaturas. Un análisis de gradiente utiliza una placa de Petri y solos animales y es adecuado para caracterizar el comportamiento detallado de animales individuales10. Sin embargo, desde platos de Petri son redondos, los tamaños de las zonas de temperatura varían y son progresivamente más pequeños dependiendo de la distancia desde el centro. Por lo tanto, esta configuración no es ideal para el monitoreo de las selecciones de temperatura de las poblaciones de animales.

Un aparato de gradiente térmico continuo que es adecuado para evaluar las preferencias de la temperatura de los grupos de larvas emplea una arena rectangular y se describe aquí. El aparato es fácil de construir y montar. Además, el gradiente es lineal y es flexible, ya que puede ser utilizado evaluar thermotaxis sobre grandes temperatura oscila entre 10 ° C a 42 ° C. El ensayo es rápido y sencillo de realizar y da datos reproducibles. Además de reportar la temperatura favorecida de larvas, revela las preferencias de la población de animales sobre toda una gama linear en un solo experimento. Debido a estas ventajas, es una excelente opción para la identificación de genes necesarios para thermotaxis.

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Protocol

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1. equipo fabricación y montaje aparatos para ensayos de gradiente

  1. Fabricar las placas de ensayo de aluminio para el análisis de gradiente direccional solo.
    1. Cortar y moler cada placa de ensayo de aluminio (figura 1A) de una sola pieza de aluminio con una sierra de banda y sharp molino vertical con las siguientes dimensiones: el tamaño exterior es de 140 x 100 x 9 mm y el tamaño interior es de 130 x 90 x 8 mm (figura 1B). Anodice el interior de cada placa de análisis con pintura negra para que sea más fácil visualizar las larvas y evitar que se oxiden.
      Nota: Fabricación de las placas de ensayo de aluminio para el gradiente direccional solo se hace por una tienda de máquina. La anodización es realizada por un proveedor comercial.
    2. Marcar los bordes superiores e inferiores de cada placa de análisis con 13 demarcaciones, separados por 10 mm utilizando un marcador permanente. Coloque el primeras y el últimas las demarcaciones 5 mm desde el borde interior de las placas de ensayo (figura 1A, B).
  2. Para fabricar la placa de ensayo de aluminio para el gradiente bidireccional, cortar una placa de aluminio con las siguientes dimensiones usando tijeras de chapa: 250 x 220 x 2 mm. anodizado las placas de ensayo con pintura negra.
    Nota: La fabricación de las placas de ensayo de aluminio para los gradientes bidireccional se realiza por una tienda de máquina. La anodización se realiza por un proveedor comercial.
  3. Fabricar los bloques de aluminio.
    Nota: Dos bloques se necesitan para el gradiente direccional solo y tres bloques son necesarios para el gradiente bidireccional.
    1. Corte los bloques de aluminio (figura 1) de una sola pieza de aluminio con una sierra de banda (dimensiones de 50 x 255 x 14 mm) (figura 1, D).
    2. Taladro el canal de agua dentro del bloque (7 mm de diámetro) utilizando un molino vertical y el hilo de ranuras en los extremos abiertos de un lado (figura 1). Cerrar los agujeros ranurados con tornillos y cinta del sello del hilo de rosca para formar un canal de agua en forma de U (figura 1, D).
      Nota: La fabricación de los bloques de ensayo de aluminio se realiza por una tienda de máquina.
    3. Fije el conector del bloque de aluminio (figura 1) con rosca y sello de hilo cinta en un extremo. Coloque el otro extremo con múltiples púas en silicona tubo (1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" pared).
  4. Obtener dos baños de circulación refrigerado, calefacción.
  5. Armar bloques de control de temperatura para el sistema de análisis de gradiente.
    1. Para el gradiente direccional único, Conecte cada uno de los dos bloques de aluminio en un baño de agua separado para que la temperatura de cada bloque es controlada por un agua independiente de sistema (figura 2A) de circulación. Utilice tubo de silicona (1/4" ID x 3/8" OD x pared de 1/16") para conectar la salida de la bañera de agua al conector en la parte interior del bloque de aluminio (figura 2A). También, use tubería para conectar el lado externo en el bloque de aluminio a la entrada del baño.
    2. Para el gradiente bidireccional, coloque dos de los tres bloques de la izquierda y derecha de la placa y conecte al mismo baño de agua con la tubería (figura 2B). Conectar el tercer bloque de aluminio con un segundo baño de agua y debajo del centro de la placa (figura 2B).
      Nota: Este aparato y el análisis son necesarias sólo si las larvas se acumulan en la zona en un extremo u otro del gradiente direccional solo. Si es así, es importante evaluar si hay un efecto de borde o no. Para probar esta posibilidad, establecer un gradiente de bidireccional en el que la temperatura de la zona de borde preferida por las larvas mediante el gradiente direccional solo (p. ej. 18 ° C) es la temperatura en el centro de la placa del gradiente bidireccional (figura 3E , F).

2. larva sincronización

  1. Moscas para utilizarse para puesta de huevos se alimentan.
    1. Mezcla gránulos de levadura y agua destilada con un mortero para hacer levadura pasta. Bien molido y revolver hasta que la consistencia de la pasta es similar a la mantequilla de maní. Evitar pasta excesivamente seco, que puede desprenderse al transferir moscas a frascos frescos o moje la pasta, que podría atrapar las moscas.
    2. Con un mortero, agregue la pasta de levadura cerca de las paredes internas de viales estándar de Drosophila , justo por encima de la superficie de los alimentos.
    3. Cuenta 12-35 hembras y hasta la mitad como muchos varones (pero no más de 10) en una plataforma de CO2 y añadir las hembras y los machos a cada frasco que contiene la pasta de levadura.
    4. Para mantener la mosca comida con la pasta de levadura húmeda, mientras que la alimentación de las moscas, combinar estos frascos en una bandeja que contiene hasta 100 frascos con 20 frascos abiertos que contiene sólo agua destilación. Coloque la bandeja en una bolsa de plástico y selle.
    5. Incubar la bandeja en una incubadora de 25 ° C durante 48 h para que las hembras se alimentan adecuadamente, lo que les permite poner gran cantidad de huevos.
  2. Configurar viales para puesta de huevos.
    1. Transferir las moscas alimentadas en nuevos frascos de alimentos para la recolección de huevo tocando encima. No use el CO2, que puede causar las moscas a poner menos huevos en la siguiente ventana de corto plazo.
      Nota: Estándar Drosophila alimentos viales se utilizan sin pasta de levadura para la recolección del huevo.
    2. Deje que las moscas a poner huevos durante 3 horas a 25 ° C para que todos los huevos son recogidos en una ventana relativamente estrecha.
      Nota: Esto permitirá a las larvas que se sincronizarán en la misma etapa del desarrollo.
    3. Coloque los frascos que contienen los huevos en la bandeja que contiene los frascos de agua y apriete la bolsa. Incubar a 25 ° C 12 h luz: 12 hs ciclos oscuros.
    4. Edad de las larvas de un número determinado de horas después de puesta de huevos (AEL) dependiendo de la etapa larval deseado.
      Nota: La tabla 1 es una estimación de la relación entre las AEL y la fase larvaria, que variará dependiendo de la población de moscas, alimento utilizado, temperatura etc. la relación precisa entre AEL y etapa de desarrollo tiene que ser de cría verificado por cada investigador utilizando criterios físicos, como la morfología de la boca ganchos y espiráculos11.

3. gradiente de temperatura de instalación

  1. Preparar solo direccional gradiente
    1. Para crear un ambiente húmedo durante los ensayos, coloque los dos bloques de aluminio conectados a dos baños en toallas de papel húmedas, separados por 10 cm (figura 2A).
    2. Encienda los dos baños de agua ~ 2 h antes de iniciar el ensayo para permitir tiempo suficiente para que la temperatura de los bloques de aluminio se equilibren.
      Nota: Se recomienda llevar a cabo un experimento simulado para determinar la temperatura de cada baño de agua que se necesita para alcanzar el gradiente de temperatura lineal deseado. Algunos pares de temperatura típico para configurar los baños de agua figuran en la tabla 2. Sin embargo, tenga en cuenta que las temperaturas superficiales se ven afectadas por la temperatura ambiente. La longitud de la tubería también afecta a las temperaturas ya que es enfriamiento en los tubos. La longitud de la tubería en la instalación es 1,5 m.
    3. Microondas 100 mL de agarosa al 1% en el ajuste de alta potencia de 500 mL redondo botella de boca ancha, verter 25 mL y ensayo de placa de un banco de nivel. Preparar dos placas de ensayo, que pueden colocarse en los bloques de aluminio al mismo tiempo (figura 2A).
    4. Después de la agarosa ha solidificado (10-20 min), frote suavemente cada superficie de agarosa con una esponja de cocina estándar o con una esponja de melamina para hacer la superficie de agarosa ligeramente grueso, para que al rociar agua en el gel de agarosa, se crea una membrana de agua fina lisa, y no gotas de agua se forman.
    5. Sumerja completamente las placas en un recipiente con agua destilada hasta que el ensayo está listo para llevar a cabo para evitar que las placas que desecado.
  2. Preparar un gradiente bidireccional (opcional)
    1. Para crear un ambiente húmedo durante los ensayos, colocar tres bloques de aluminio 8 cm de separación (figura 2B) sobre toallas de papel mojadas.
    2. Encienda los dos baños de agua ~ 2 h antes de iniciar el ensayo para permitir tiempo suficiente para que la temperatura de los bloques de aluminio se equilibren.
      Nota: Se recomienda llevar a cabo un experimento simulado para determinar la temperatura de cada baño de agua para el gradiente bidireccional. Algunos pares de temperatura típico para configurar los baños de agua figuran en la tabla 3. Sin embargo, tenga en cuenta que las temperaturas superficiales se ven afectadas por la temperatura ambiente. La longitud de la tubería también afecta a las temperaturas ya que es enfriamiento en los tubos. La longitud de la tubería en la instalación es 1,5 m.
    3. Para evitar que la agarosa se derrame fuera de la placa, envolver los bordes de la placa de aluminio con etiquetas cinta para formar un muro 10 de mm de alto (figura 2B).
    4. Utilizando la configuración de alta potencia, microondas 200 mL de agarosa al 1% en 500 mL botella de boca ancha redonda y verter 120 mL en una placa de ensayo.
    5. Después de la agarosa ha solidificado (~ 30 min), frote suavemente cada superficie de agarosa con una esponja de cocina estándar o con una esponja de melamina para hacer la superficie de agarosa ligeramente grueso, para que cuando vaya a rociar agua en el gel de agarosa, se crea una membrana de agua fina lisa y no forma de gotitas de agua.
    6. Sumerja completamente las placas de ensayo en un recipiente con agua destilada hasta que el ensayo está listo para llevar a cabo para evitar que seque.
  3. Configurar solo direccional gradiente
    1. Preparar los reactivos y productos en un banco al lado del aparato de ensayo de degradado (véase la Tabla de materiales).
    2. Para promover la transferencia eficiente de temperatura, llenar los huecos entre los bloques de aluminio y las placas de ensayo rociando agua en la interfase entre la placa y de bloques.
    3. Usando guantes, retire las placas de ensayo del envase del agua. Si agua invade entre el gel de agarosa y la placa y provoca golpes a la forma en la superficie, retire el agua con una micropipeta P1000.
    4. Coloque las placas de ensayo en los bloques de aluminio de forma que las demarcaciones que son 2 cm de cada borde exactamente los bordes de los bloques de aluminio (figura 2A, C).
    5. Rocíe agua sobre la superficie de la placa (una membrana delgada de agua que cubre la superficie de agarosa es suficiente) para evitar que el gel de agarosa se seque. Asegúrese de que la membrana de agua es continuo y libre de gotas de agua ya que las larvas pueden quedar atrapadas en gotas de agua.
    6. Cubra el sistema de gradiente con una caja de cartón para reducir la evaporación del agua y ayudar a estabilizar la temperatura de la superficie del gel. Espere 5-10 minutos permitir que la temperatura se equilibre.
    7. Compruebe la temperatura de la superficie a 12 puntos en la placa (figura 2). Tomar dos mediciones en cada zona para establecer si existe o no la variabilidad dentro de una zona. Asegúrese de que la temperatura en ambos puntos es de ± 0,2 ° C de la temperatura deseada.
      Nota: Variabilidad dentro de una zona generalmente se produce porque las distancias exactas de los dos puntos en el borde de los bloques de aluminio no son idénticas. Ajustar la posición de la placa en los bloques de aluminio para asegurarse de que las demarcaciones que son 2 cm de cada borde exactamente coinciden con los bordes de los bloques de aluminio.
    8. Si el gradiente de la temperatura medida se desvía de la gradiente deseada, aumentar o disminuir las selecciones de temperatura de baño de agua y vuelva a verificar la temperatura de la superficie después de que la temperatura del baño de agua (s) stabilize(s).
    9. Cubre el sistema de gradiente con una caja de cartón hasta comenzar el ensayo.
  4. Configurar gradiente bidireccional (opcional)
    1. Preparar los reactivos y productos en un banco al lado del aparato de ensayo de degradado (véase la Tabla de materiales).
    2. Chorro de agua sobre las superficies de los tres bloques de aluminio para promover la transferencia eficiente de temperatura de los bloques de aluminio para las placas de ensayo rellenando los huecos entre las superficies.
    3. Retire las placas de ensayo con cuidado el recipiente de agua y colocar sobre los bloques de aluminio. Si invade de agua entre el gel de agarosa y la placa, que puede causar golpes a la forma en la superficie, quite el agua con una micropipeta P1000.
    4. Coloque la placa de ensayo en los bloques de aluminio para que la nuestra de las zonas primeras y últimas de cualquier borde coincida exactamente con los bordes de los bloques de aluminio de dos laterales (figura 2B, D).
    5. Rocíe agua sobre la superficie de la placa (una membrana delgada de agua que cubre la superficie de agarosa es suficiente) para evitar que el gel de agarosa se seque. Asegúrese de que la membrana de agua es continuo y libre de gotas de agua, ya que las larvas pueden quedar atrapadas en gotas de agua.
    6. Cubra el sistema de gradiente con una caja de cartón para reducir la evaporación del agua y ayudar a estabilizar la temperatura de la superficie del gel. Espere 5-10 minutos para permitir que la temperatura se equilibre.
    7. Compruebe la temperatura de la superficie en dos puntos a lo largo de la línea media de cada una de las 10 zonas (Figura 2D). Tomar dos mediciones en cada zona para establecer si existe o no la variabilidad dentro de una zona. Asegúrese de que la temperatura en ambos puntos es de ± 0,2 ° C de la temperatura deseada.
      Nota: Variabilidad dentro de una zona generalmente se produce porque las distancias exactas de los dos puntos en el borde de los bloques de aluminio no son idénticas. Ajustar la posición de la placa en los bloques de aluminio para asegurarse de que la nuestra de las zonas primeras y la últimas más cercano a cada borde coinciden exactamente con los bordes de los bloques de aluminio de dos laterales.
    8. Si el gradiente de la temperatura medida se desvía de la gradiente deseada, ajuste las selecciones de temperatura de baño de agua y vuelva a verificar la temperatura de la superficie después de que la temperatura del baño de agua (s) stabilize(s).
    9. Cubrir los bloques con una caja de cartón hasta el comienzo del ensayo.

4. colección larva y lavado

  1. Aislar las larvas limpias (opción 1)
    1. Añadir solución de sacarosa de 18% de ~ 40 mL a un tubo de ensayo de 50 mL. Sacar todas las larvas de los frascos de alimentos con scoopula y transferencia a la solución de sacarosa de 18%.
    2. Mezclar bien pero con la ayuda de un scoopula para separar las larvas de los residuos de comida. Espere 30-60 s hasta que el flotador de las larvas a la capa superior del tubo. Vierta la capa superior que contiene las larvas (~ 10 mL) a otro tubo de 50 mL y llenar el tubo con solución de sacarosa de 18% fresca. Espere 30-60 s hasta que el flotador de las larvas a la capa superior otra vez.
      Nota: Partículas grandes de alimentos a veces transferir junto con larvas y pueden afectar larvas thermotaxis si no se quitan. Si las partículas grandes de alimentos permanecen en la capa superior, repita pasos 4.1.1-4.1.2 o quitar manualmente utilizando un scoopula.
    3. Transferir la capa superior de larvas (~ 10 mL) a dos otros tubos de 50 mL y llenar los dos tubos con agua destilada para reducir la concentración de sacarosa, por lo que las larvas se hunden rápidamente en agua. Espere 30-60 s hasta que las larvas se hunden hasta el fondo. Realizar esto y lo siguiente lo antes posible para evitar que las larvas de ahogarse.
    4. Deseche tanto del agua como sea posible inclinando suavemente los tubos. Larvas se combinan en un tubo por verter las larvas con el agua restante y llenar el tubo con agua destilada.
    5. Espere 30-60 s hasta que todas las larvas se hunden y eliminar tanta agua como sea posible inclinando suavemente los tubos. Repita este paso de lavado 2 - 4 veces para completamente eliminar sacarosa y visible todos los alimentos.
    6. Desechar tanto el agua como sea posible y la transferencia de las larvas a un plato de Petri vacío de 35 mm por decantación. El tubo de aerosol con agua y utilizar un pincel pequeño para ayudar a la transferencia de las larvas.
    7. Eliminar el exceso de agua de la placa de Petri utilizando una micropipeta P1000. Salir de ~0.5 mL de agua para evitar deshidratación de las larvas.
    8. Coloque la tapa sobre el plato para impedir que escape de las larvas. Gire la tapa hacia abajo para reducir la capacidad de las larvas para escapar por el pequeño espacio entre la tapa y plato. Permitir que las larvas recuperar para 10-20 minutos.
  2. Aislar las larvas limpias (opción 2)
    Nota: Este método alternativo para la limpieza de larvas mitiga la posibilidad de asfixia las larvas durante el procedimiento de lavado. Para utilizar este método, siga los siguientes pasos después de realizar los anteriores pasos 4.1.1-4.1.2.
    1. Coloque un colador celular (300 μm, retiene larvas 72 h AEL o mayores) en la parte superior un tubo de 50 mL.
    2. Después de confirmar que no hay cuerpos adultos o residuos de comida flotando en la superficie de la solución de sacarosa, verter la capa superior que contiene las larvas a través de la coladera para retener todas las larvas en la malla. Lave las larvas con agua destilada hasta llena el tubo de 50 mL.
    3. Quitar el colador de célula con las larvas y deseche el agua del tubo. Colocar el filtro que contiene las larvas en la parte superior del tubo vacío y lavar las larvas nuevamente con agua destilada hasta llena el tubo de 50 mL.
    4. Gire el filtro hacia abajo sobre un plato de Petri vacío de 35 mm y rociar el agua de la parte superior de la coladera del celular para transferir las larvas a la caja Petri. La transferencia de las larvas restantes usando una pequeña brocha.
    5. Siga al paso 4.1.7 arriba antes de proceder al paso 5.

5. Análisis y cálculo

  1. Retire la caja de cartón y Compruebe la temperatura de la superficie de gel inmediatamente antes de transferir las larvas a la placa. Minimizar el tiempo que la caja de cartón abierta para evitar perturbar el equilibrio de la temperatura. Si la superficie está seca, rocíe una pequeña cantidad de agua en la superficie.
  2. Distribución de 150 ± 50 larvas cerca del centro de cada placa (entre las zonas 3 y 4 de las 6 zonas) por el gradiente direccional solo (zona de liberación; Figura 2).
    Nota: Para el gradiente bidireccional, distribuir 200-400 larvas a lo largo de la zona media de cada mitad (Figura 2D).
  3. Coloque una tapa de microplacas sobre cada placa de análisis para evitar que las larvas arrastrándose hacia fuera. Cubrir la configuración con una caja de cartón para evitar la exposición a la luz, que podría afectar la elección de larvas en el gel de agarosa.
    Nota: Para el gradiente bidireccional, no debe necesario cubrir el plato con una tapa, porque la placa es más grande, y la temperatura preferida de las larvas es en la zona media. En consecuencia, algunas larvas se acumulan en los bordes y tienen la oportunidad de salir gateando.
  4. Permite el análisis proceder para 10-30 min para el gradiente direccional único y de 15-35 min para el gradiente bidireccional, dependiendo de la edad de las larvas (cuadro 4).
  5. Retire la caja de cartón y la tapa de la microplaca. Las placas de arriba con una cámara digital de la fotografía. Tomar dos fotografías de cada placa de análisis para que el investigador puede elegir el con mejor contraste y brillo para el análisis.
  6. Quitar todas las larvas de las placas de ensayo y en cualquier lugar fuera de las placas por la aspiración.
  7. Limpie las placas de ensayo, los tubos y el filtro de la célula con agua destilada. Vuelva a utilizar las placas de ensayo preparadas ese día a menos que la superficie de la agarosa está dañada.
  8. Calcular la distribución del porcentaje de larvas en cada zona.
    1. Abra la imagen fotográfica de los resultados del ensayo utilizando un software que permite agregar marcadores a la imagen. Para indicar las zonas de ensayo, dibuje líneas verticales cada 2 cm basado en las demarcaciones en la placa de ensayo.
    2. Contar el número de larvas en cada zona y registre los números. No cuentan las larvas en las regiones de 0,5 cm de cualquiera de las paredes. El gel es más grueso cerca de las murallas, y las temperaturas superficiales no son lineales en estas regiones.
    3. Para el gradiente direccional único, calcule la distribución de porcentaje en cada zona de la siguiente manera:
      (número de larvas en una zona determinada de 2 cm) / (número total de larvas en 6 zonas) x 100.
    4. Para el gradiente bidireccional, calcule la distribución de porcentaje en cada zona de la siguiente manera:
      (número de larvas en una zona determinada de 2 cm) / (número total de larvas en 5 zonas a cada lado del gradiente) x 100.

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Representative Results

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Para establecer un solo-direccionales de 18 ° C - 28 ° C gradiente, fijamos las temperaturas de los dos baños de agua a 16,8 ° C y 31 ° C. Obtenemos las temperaturas a 13 puntos por la medición de la temperatura en 26 posiciones dentro de las porciones superiores e inferiores de todas las 6 zonas, las líneas de frontera entre las zonas y en los extremos de la superficie del gel de agarosa (figura 2, 2E). La distribución de temperaturas a lo largo del gradiente fue casi lineal (Y = 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (Figura 2E).

Analizan las preferencias de temperatura de larvas control (w1118) a diferentes edades. 1st (24 ± 1,5 h AEL), 2nd (48 ± 1,5 h AEL) y larvas de primeros 3rd (72 ± 1,5 h) mostró picos en la zona de 24 ° C (Figura 3A, B). Las preferencias de temperatura cambiadas durante 3rd instar el desarrollo larvario. El mayor porcentaje de mediados-3rd estadio (96 ± 1,5 h AEL) acumulado en la zona de 18 ° C (Figura 3A, B), y esta tendencia aumenta con la edad. Entre finales de 3rd larvas de estadio (la escalada; 120 ± 1,5 h AEL), ~ 50% agrupado en la zona de 18 ° C, y la selección de esta temperatura fue ~ 4 superior de la zona adyacente de 20 ° C (18 ° C zona, de 50,2%; 20 ° C zona, de 15.1%; Figura 3A Y , B). La tendencia a acumularse en la zona de 18 ° C en w1118 no fue debido a un efecto de borde ya que la tarde-3rd instar larvas todavía acumuladas en la zona de 18 ° C, utilizando un gradiente de temperatura bidireccional (figura 3E, F ).

También probamos finales 3rd instar larvas (120 ± 1,5 h AEL) con mutaciones en los genes necesarios para discriminar las diferencias de temperatura en la gama cómoda. Estos incluyen trpA1, que es necesaria para la selección de la temperatura en el rango de 18 ° C - 24 ° C5,7,8. Larvas con una mutación nula en trpA1 (trpA11) distribuyen igualmente sobre la totalidad de 18 ° C-28 ° C gradiente (figura 3). Las larvas que falta sólo las A y B isoformas (AB trpA1G4) o las isoformas C y D (CD de trpA1G4) también muestran deficiencias severas (figura 3). Vuela codifica dos isoformas de la fosfolipasa Cβ (PLC21C y NORPA), y las mutaciones que afectan norpA (norpAP24) pero no plc21c (plc21cP319) también interrumpen la acumulación en el rango de 18 ° C ( Figura 3D).

Figure 1
Figura 1. Aparato para realizar el análisis de gradiente de temperatura solo bidireccional. (A) un aluminio prueba placa utilizada para el análisis de la conducta larval thermotaxis. Las 13 líneas negras en la parte superior e inferior demarcan 12 zonas (10 mm). La parte inferior de la placa es anodizada con pintura negra para que sea más fácil visualizar las larvas. (B) dimensiones de la placa de aluminio (indicada en mm). El tamaño externo de la placa de aluminio es 140 x 100 x 9 mm. El tamaño interno de la placa de aluminio es de 130 x 90 x 8 mm. Las demarcaciones están separadas por 10 mm. La primera y la última demarcación es 5 mm de los bordes de la parte interna de la placa. (C) superior y vistas laterales de uno de los bloques de aluminio utilizan para controlar la temperatura del gradiente. El bloque tiene dos conectores que se utilizan para sujetar a los tubos del silicio, que conectan con un baño de agua. (D) dimensiones de un bloque de aluminio. El tamaño exterior del bloque de aluminio es 255 x 50 x 14 milímetros. El diámetro de la trayectoria interna del agua es 7 mm. Dos conectores de 30 mm a la izquierda conectan con un tubo de silicona que se extiende hasta el baño de agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Configuraciones de gradiente ensayo simple y bidireccional. (A) configuración gradiente direccional solo con dos placas de ensayo de aluminio en dos bloques de aluminio. Las temperaturas de los bloques de aluminio se controlan mediante circulación de agua de los dos baños de agua. (B) el arreglo de los tres bloques de aluminio, baños de agua y una placa de aluminio (250 x 220 mm) para un gradiente de bidireccional. Los bloques de izquierda y derecho están conectados al mismo baño de agua y el bloque central está conectado con el otro baño de agua. La placa de ensayo de aluminio se envuelve con cinta para formar un muro de 10 m m para contener la agarosa al 1%. Posiciones (C) Revise la temperatura (indicada por puntos) y liberan las larvas en la placa. Antes de iniciar un experimento, verifique la temperatura en dos puntos dentro de cada zona para confirmar que se establece el gradiente de temperatura lineal deseado. Las larvas se liberan en el área indicada cerca de la línea media. Las larvas son contadas dentro de cada una de las zonas de 2 cm. (D) posiciones para comprobar temperaturas (indicadas por puntos) y las zonas de lanzamiento para las larvas en un gradiente de bidireccional. Igual número de larvas se lanzan a lo largo de la línea media de cada mitad del gradiente bidireccional. El número de larvas se cuenta en cada uno de los 10 (2 cm) zonas. Un sistema típico de temperaturas (18 ° C - 26 ° C) en la superficie de la agarosa se indica. (E) temperaturas medidas a lo largo de las líneas de frontera y nuestra de cada zona en un gradiente direccional solo de muestra. Los datos representan las temperaturas medias ± SD. n = 8 ensayos (150 ± 50 larvas/ensayo). Piezas de esta figura se reproducen de Sokabe et al. 8 con ligeras modificaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Resultados representativos usando análisis de gradiente solo direccional y bidireccional. (A, B) Porcentajes promedios de larvas en 6 zonas en el gradiente direccional solo. Los datos incluyen 3 larvas de estadio de lard en las horas indicadas de postura (AEL). n = 6-7. Las barras de error en un represente ±SEM. (C) térmica distribuciones de la pre-escalada de finales de 3rd instar larvas de control (w1118) y trpA1 mutantes en el gradiente direccional solo. n = 3-4. Las barras de error representan ±SEM. (D) distribuciones térmicas de las larvas de estadio tardío 3rd de control (w1118) y PLCβ mutantes en el gradiente direccional solo. n = 4-6. Las barras de error representan ±SEM. (E) distribución representativa de la escalada, finales de 3rd larvas de estadio (w1118) en el gradiente de bidireccional. Las zonas izquierda y derecha el análisis indicadas por líneas punteadas y separadas por la zona no cuenta en el centro (región sombreada). (F) porcentaje de la escalada de finales de 3rd instar larvas (w1118) en cada zona a lo largo del gradiente térmico. Las larvas se colocaron en la izquierda y la derecha liberar zonas. Las zonas de ensayo están separadas por una zona de 3 cm no cuenta en el centro y las distribuciones se calculan independientemente. Las barras de error representan SEMs. n = 3 ensayos (200-400 larvas/ensayo). Piezas de esta figura se reproducen de Sokabe et al. 8 con ligeras modificaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Horas AEL Etapa larval
24 1 estadio dest
48 Estadio 2nd
72 Estadio temprano 3rd
96 Estadio de mediados-3rd
120 Finales de 3rd estadio, justo antes de subir a escenario

Tabla 1. La relación entre las horas de postura (AEL) y fases larvarias.

Gradiente de temperatura en placa de agarosa (pendiente) Temperaturas de los baños de agua Temperaturas de los bloques de aluminio
10.0-25,0 ° C (1,5 ° C/cm) ~6.5-7°C/~28.5°C ~8.5°C/~26.8°C
18.0-28,0 ° C (1° C/cm) ~16.8°C/~31.0°C ~17.8°C/~29.7°C
14.0-34,0 ° C (2° C/cm) ~10.0°C/~40.0°C ~11.8°C/~36.8°C
12.5-42,0 ° C (2,95 ° C/cm) ~7.0°C/~55.0°C ~9.4°C/~49.4°C

Tabla 2. Gradientes de temperatura típicos y las correspondientes temperaturas de los baños de agua y bloques de aluminio para gradientes direccionales individuales.

Gradiente de temperatura en placa de agarosa Temperaturas de los baños de agua Temperaturas de los bloques de aluminio
22/10/22 ° C (1,5 ° C/cm) ~5.0°C /~25.0°C ~7.5°C/~24.0°C
26-18-26 ° C (1° C/cm) ~15.8°C /~30.6°C ~16.9°C/~28.4°C
30-14-30 ° C (2° C/cm) ~8.5°C /~36.4°C ~10.9°C/~32.8°C
36-12.5-36 ° C (2,95 ° C/cm) ~5.0°C /~47.2°C ~7.9°C/~40.9°C

Tabla 3. Gradientes de temperatura típicos y las correspondientes temperaturas de los baños de agua y bloques de aluminio para gradientes bidireccional.

Edad larvaria (AEL) Tiempo de ensayo (única dirección) Tiempo de ensayo (bidireccional)
24 h 30 min 35 min
48 h 22 min min 27
72 h 16 min 21 min
96 h 13 min. 18 min.
120 h 10 min 15 min

Tabla 4. Diferentes edades larvarias (AEL) y los correspondientes tiempos de ensayo.

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Discussion

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Para asegurar el éxito de este protocolo, es importante que tome medidas para obtener el número suficiente de larvas para realizar los experimentos. Estos incluyen la alimentación de las moscas en viales que contienen pasta de levadura para 2-3 d mejorar la puesta de huevos. Los viales necesitan ser colocados en una bandeja que contiene frascos de agua y dentro de una bolsa de plástico transparente, que mantiene la humedad de los alimentos y promueve la efectiva de alimentación por las larvas permitiendo la exposición a ciclos luz-oscuridad normales. Sin embargo, la pasta de levadura no debe ser tan suave que las moscas atrapadas. El número de hembras por vial depende del genotipo. En el caso de w1118, es generalmente adecuada permitir ~ 12 ~ 6 hombres y a poner huevos durante 3 horas. Dos frascos normalmente proporcionan suficientes larvas (100-200 larvas) para colocar en una placa para el ensayo solo bidireccional. Si la población de mosca pone menos huevos que tipo salvaje o se reduce la proporción de larvas que eclosionan, añadir machos y hembras adicionales (hasta 30-35/vial).

Hay muchas causas de variabilidad no deseada al realizar estos ensayos. La etapa de desarrollo afecta la preferencia de la temperatura de las larvas. Por lo tanto, es imperativo utilizar cuidadosamente las larvas de una etapa definida. Para ello, recoger las larvas en un estrecho marco de tiempo (por ejemplo, 3 h). Puesto que la cría las condiciones (temperatura, humedad, luz-oscuridad y tipo de alimento) y algunas mutaciones afectan el ritmo de desarrollo, no dependen estrictamente el tiempo después de ponedora para analizar comparable entre larvas. También es importante examinar los rasgos físicos, como el tamaño de la boca ganchos y espiráculos el7 para determinar si son larvas de diferentes genotipos en el mismo escenario del desarrollo. Los tiempos para 1st, 2nd y 3 larvas de estadio derd para el desarrollo (tabla 1) se basan en el uso de alimentos a base de harina de maíz e incubación a 25 ° C 12 h luz: 12 hs ciclos oscuros. Las larvas crecen más lento en alimentos a base de melaza. Adecuada hidratación y alimentos frescura también afecta el crecimiento de las larvas. La cantidad de agua en la comida debe dejar los alimentos ni demasiado seca a la cáscara de la ampolla ni demasiado flojo debido al exceso de agua. Idealmente, la capa de ~ 5 m m más cercano a la superficie de los alimentos está condicionada por el crecimiento de larvas y se mueve fácilmente cuando el frasco es inclinado o girado. Esta condición puede lograrse usando la comida recién hecha con 50-100 larvas.

Es esencial para establecer un gradiente de temperatura estable antes de iniciar el ensayo. Por lo tanto, encender el baño de agua 1-2 h antes de iniciar el ensayo, como los baños de agua producen calor y pueden cambiar la temperatura ambiente, que a su vez tienen el potencial de afectar el gradiente. Después de 1-2 h, equilibra la temperatura ambiente de más habitaciones. Sin embargo, esto debe ser determinado en cada ambiente. Además, al generar un gradiente con una gama de temperaturas grande (> 3,0 ° C/cm), puede ser difícil obtener un gradiente estable. Un pequeño movimiento de la placa de ensayo más perceptiblemente cambia el gradiente de temperatura cuando el rango es grande (por ejemplo, > 3,0 ° C/cm). Encontramos que un gradiente de 1-2 ° C/cm produce los gradientes más estables.

Hay varias consideraciones adicionales que deben ser controlados para limitar la variabilidad en los ensayos de thermotaxis. Lavado de las larvas es fundamental, como la presencia de partículas de alimentos o sacarosa en las larvas puede afectar el ensayo. Los pasos de lavado deben realizarse cuidadosamente, pero rápidamente, porque limitar su suministro de oxígeno excesivamente mientras están sumergidas en agua puede afectar su salud. Por lo tanto, le recomendamos usar el colador de la célula (opción 2) para limpiar las larvas. Un filtro con un tamaño de poro de 300 μm funciona bien para las larvas en los primeros 3rd instar etapa (72 h AEL) o mayores. Además, es importante realizar experimentos en la misma hora del día, tales como de Zeitgeber ZT4 (ZT) a ZT8 (ZT = 0 es cuando se encienden las luces), para limitar la variabilidad debido a los impactos de los ritmos circadianos en la selección de la temperatura. El nivel de humedad en la placa de agarosa también puede causar variabilidad en los resultados. Mientras que la superficie de las placas tiene que estar húmeda, las gotas de agua podrían atrapar las larvas y por lo tanto deben evitarse.

Limitación de la variabilidad en los ensayos permitirá obtener resultados robustos sin realizar gran número de experimentos independientes. Por lo general, 3-8 experimentos independientes son suficientes para obtener un resultado confiable. También es crítico para el éxito de los ensayos thermotaxis adecuada tabulación de los resultados. No cuentan las larvas distribuidas en las regiones dentro de 0.5 cm de las paredes de aluminio, ya que las temperaturas no son lineales en estas regiones. Algunas larvas se colocará en la frontera entre dos zonas, en el momento que concluye el ensayo. Si más del 50% de la longitud del cuerpo se encuentra en una zona, entonces incluya la larva en la tabulación para esa zona. Si una larva es precisamente el 50% en cada uno de dos zonas, entonces contar el animal como 0,5 larvas en cada zona.

Mientras que el análisis de gradiente permite a las larvas discriminar una amplia gama de diferencias de la temperatura, existen limitaciones para las temperaturas inferiores y superiores que pueden ser probadas con eficacia. No es factible probar temperaturas < 10 ° C desde la movilidad de las larvas disminuye considerablemente a temperaturas más bajas. Aunque pueden establecer gradientes de la temperatura superior a 42 ° C, casi no hay larvas de control alojarte en cualquier zona > 28 ° C. Por lo tanto, no se puede utilizar análisis de gradiente continuo para discriminar preferencias de temperatura entre distintas zonas > 28 ° C. Sin embargo, análisis de gradiente a estas elevadas temperaturas pueden utilizar para caracterizar a mutantes si cambiaron muy preferencias de temperatura tibia.

Si un mutante tiene un defecto locomotor, puede ser necesario llevar a cabo experimentos adicionales para asegurarse de que la preferencia de temperatura aparente no es inexacta debido a un impedimento de movimiento. Para solucionar este problema, puede ser necesario establecer el tiempo de ensayo para permitir que los animales adicionales mover a sus zonas de deseado. El análisis de gradiente bidireccional se puede también emplear para probar si los animales seleccione la zona preferida, sin importar a donde se colocan inicialmente en la placa.

En conclusión, los análisis de gradiente descritos aquí tienen ventajas sobre otros ensayos thermotaxis. Mientras que el análisis de dos vías de elección son útiles, ya que pueden producir resultados robustos, especialmente cuando las diferencias de temperatura entre las dos zonas son grandes, no son eficaces en revelar la temperatura ideal preferida por las larvas en un solo experimento. Para ello requiere realizar muchas combinaciones dos vías de elección para determinar la temperatura preferida5,6,7. En contraste, el análisis gradiente proporciona al animal la oportunidad de seleccionar su zona de temperatura preferida en un entorno con un paisaje único temperatura continua. Por lo tanto, es necesario elaborar una gran combinación de dos opciones para determinar el ambiente térmico recomendado:. Estudiar thermotaxis usando una placa de Petri redonda se ha empleado para evaluar los efectos de la temperatura sobre la dinámica de movimiento de una larva de10. Sin embargo, es menos útil para discriminar entre preferencias entre diferentes temperaturas, ya que cada zona es un tamaño diferente. Por último, debido a la sencillez de lo análisis y su utilidad en discriminar las preferencias de temperatura en un solo análisis, puede ser empleado a decenas de pantalla de los genes candidatos potencialmente implicados en preferencia larval de temperatura que podrían de lo contrario ser pasada por alto con otros ensayos

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

C.M. es apoyado por fondos de la NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) y el NIAID (1DP1AI124453).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath Thomas Scientific 9106 This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient) Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient) 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing McMaster-Carr 91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing Tygon 57296 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name Company Catalog Number Comments
Items and reagents for assay
Pestle USA Scientific 17361 Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer Fluke 51II
Thermocouple Fluke K type
Universal microplate lid Corning 6980A77
35 mm dish Corning 9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient) Fisher Scientific 15-951 Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose Invitrogen 16500500 Prepare 1% solution
Sucrose Sigma S0389-5KG Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush Fisher Scientific 11860
50 mL centrifuge tubes Denville C1062-P
Scoopula Fisher Scientific 14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle Pyrex 1395-500
Cell strainer (300 mm pore) PluriSelect 43-50300 Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray) Genesee Scientific FS32-124
Name Company Catalog Number Comments
Drosophila food
Distilled water 22,400 mL
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg LabScientific Inc. NC0535320 1,609 g
Brewers yeast 100 lbs MP Biomedicals ICN90331280 379 g
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) Genesee Scientific 62-115 221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg) Genesee Scientific 66-103 190 g
Karo light corn syrup Karo 1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) Sigma Aldrich H5501-5KG 72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) Sigma Aldrich 81910-1 L 108 mL
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O Sigma Aldrich 438081-500 mL 8.5 mL

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References

  1. Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
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  6. Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30, (31), 10465-10471 (2010).
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Un análisis de gradiente de temperatura para determinar las preferencias térmicas de larvas de <em>Drosophila</em>
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Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57963, doi:10.3791/57963 (2018).More

Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57963, doi:10.3791/57963 (2018).

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