Hier presenteren we een protocol om te bepalen van de gewenste omgevingstemperatuur van Drosophila larven met behulp van een continu thermisch verloop.
Veel dieren, met inbegrip van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, zijn geschikt voor discriminerende minieme verschillen in omgevingstemperatuur, die hen toelaat om te zoeken naar hun voorkeur thermische landschap. Om de voorkeuren van de temperatuur van larven via een gedefinieerd bereik van de lineaire gedefinieerd, ontwikkelden we een bepaling met behulp van een temperatuurgradiënt. Om vast te stellen een single-directionele verloop, zijn twee aluminium blokken verbonden met onafhankelijke waterbaden, elk waarvan de temperatuur van de afzonderlijke blokken regelt. De twee blokken Stel de boven- en ondergrenzen van het verloop. De temperatuurgradiënt is opgericht door het plaatsen van een agarose-coated aluminiumplaat over de twee water-gecontroleerde blokken, zodat de plaat de afstand tussen hen overspant. De uiteinden van de aluminiumplaat die is ingesteld op de bovenkant van de water-blokken definieert de minimale en maximale temperaturen en de regio’s tussen de twee blokken vormen een lineair verloop van de temperatuur. De kleurovergang bepaling kan worden toegepast op de larven van verschillende leeftijden en kan worden gebruikt voor het identificeren van mutanten die vertonen fenotypen, zoals die met mutaties die genen coderend voor TRP channels en opsins, die nodig voor de discriminatie van de temperatuur zijn.
Thermotaxis is werkzaam bij mobiele dieren te selecteren van een omgeving met de meest gunstige voorwaarden1,2,3. Als het klimaat is extreem warm of koud, dit probleem is van vitaal belang voor het voortbestaan. Daarnaast veel dieren zijn gevoelig voor zeer kleine verschillen in temperatuur in het comfortabele bereik en omgeving met een ideale temperatuur uitzoeken. Dit is van bijzonder belang voor poikilothermic organismen zoals fruitvliegjes, die equilibreer hun lichaamstemperatuur met het milieu. Testen om te controleren van larvale thermotaxis hebben bijgedragen in de identificatie en verduidelijking van de rol van moleculaire sensoren zoals Drosophila voorbijgaande Receptor potentiële (TRP) kanalen4,5,6, rhodopsins7,8, en ionotropic receptor receptoren (IRs)9, die deze dieren met temperatuur gevoeligheden begiftigen over verschillende temperatuurbereiken.
Een tweeweg multiple-choice test biedt een aanpak om te bestuderen van thermische voorkeuren in larven6,7. De bepaling brengt met zich mee tot de oprichting van twee verschillende temperatuurzones en laat de dieren om te selecteren van de ene kant boven de andere. De resultaten van twee richtingen keuze tests kunnen robuust, vooral als de temperatuurverschillen tussen de twee opties groot zijn. Bovendien, aangezien elke bepaling classificatie van slechts twee groepen impliceert, kan de gegevens worden uitgedrukt als een eenvoudige voorkeur-index. Het gemak en de eenvoud van twee richtingen keuze tests zijn ook vatbaar voor genetische schermen. Een belangrijk minpunt is echter dat veel experimenten nodig om de gewenste temperatuur van de wild-type of mutant dieren zijn.
Een kleurovergang assay biedt de mogelijkheid om de gewenste temperatuur in een enkele assay-8. Bovendien, in tegenstelling tot de twee richtingen multiple-choice test, het maakt het mogelijk de evaluatie van de verdeling van een groep dieren, wanneer geconfronteerd met een doorlopend bereik van temperaturen. Een kleurovergang assay gebruikt een petrischaal en enkele dieren en is geschikt voor het karakteriseren van de gedetailleerde gedrag van individuele dieren10. Echter, aangezien petrischaaltjes ronde zijn, de grootte van de temperatuurzones variëren en geleidelijk kleiner zijn afhankelijk van de afstand van het centrum. Dus, deze setup is niet ideaal voor het toezicht op de selecties van de temperatuur van de populaties van dieren.
Een continu thermisch kleurovergang apparaat dat is geschikt voor het beoordelen van de voorkeuren van de temperatuur van groepen van larven maakt gebruik van een rechthoekige arena en hier wordt beschreven. Het apparaat is eenvoudig te construeren en te assembleren. Bovendien, het verloop is lineair, en is flexibel, aangezien het kan worden gebruikt om te beoordelen van thermotaxis over grote temperatuur variëren van 10 ° C tot 42 ° C. De bepaling is snel en eenvoudig uit te voeren en reproduceerbare gegevens levert. Naast de rapportage van de favoriete temperatuur van larven, blijkt het de voorkeuren van de bevolking van dieren over een gehele lineaire bereik in een enkele experiment. Als gevolg van deze voordelen is het een uitstekende keuze voor de identificatie van genen die nodig zijn voor thermotaxis.
Om het welslagen van dit protocol, is het belangrijk maatregelen te nemen voor het verkrijgen van voldoende aantal larven uit te voeren van de experimenten. Deze omvatten vooraf voeden de vliegen in gist plakken-bevattende flesjes voor 2-3 d te verbeteren met het leggen van eieren. De flesjes moeten worden geplaatst in een lade met flesjes water en ingesloten in een doorzichtige plastic zak, die houdt het vocht van het levensmiddel en bevordert effectief voeden door de larven terwijl blootstelling aan normale licht-donke…
The authors have nothing to disclose.
C.M. wordt ondersteund door de financiering van de NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) en de NIAID (1DP1AI124453).
Gradient assay apparatus | |||
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Items and reagents for assay | |||
Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
Thermometer | Fluke | 51II | |
Thermocouple | Fluke | K type | |
Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Drosophila food | |||
Distilled water | 22,400 mL | ||
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |