Summary
Vi etablere en ny kirurgisk teknik for en i vivo single lever lap perfusion model i rotte som en forudsætning for videre studier i vivo delvis leveren engineering i fremtiden.
Abstract
Orgel engineering er en roman strategi til at generere leveren orgel erstatninger, der potentielt kan bruges i transplantation. For nylig, i vivo lever engineering, herunder i vivo orgel decellularization efterfulgt af genindsættelse, er der opstået som en lovende tilgang over ex vivo lever engineering. Postoperative overlevelse var dog ikke nået. Formålet med denne undersøgelse er at udvikle en roman kirurgisk teknik, i vivo selektiv lever lap perfusion i rotter som en forudsætning for i vivo lever engineering. Vi skaber et kredsløb bypass kun gennem den venstre laterale lap. Derefter, venstre lateral lap er perfunderet med heparinized saltvand. Eksperimentet udføres med 4 grupper (n = 3 rotter pr. gruppe) baseret på forskellige perfusion gange 20 min, 2 h, 3 h og 4 h. overlevelse samt makroskopisk synlig ændring af farve og histologisk bestemt fraværet af blodlegemer i den portalen triad og sinusoids, er taget som en indikator for en vellykket model etablering. Efter selektiv perfusion af venstre laterale lap observerer vi, at venstre laterale lap, faktisk, vendte fra rød til svagt gul. I en histologisk vurdering er ingen blod celler synlige i grenen af Vena, central venen og sinusoids. Den venstre laterale lap bliver rødt efter genåbningen de blokerede fartøjer. 12/12 rotter overlevede proceduren for mere end en uge. Vi er de første til at rapportere en kirurgisk model for i vivo single lever lap perfusion med en lang overlevelse periode på mere end en uge. I modsætning til den tidligere offentliggjorte rapport, de vigtigste fordel af teknikken præsenteret her er der perfusion af 70% af leveren fastholdes under hele proceduren. Oprettelsen af denne teknik giver et fundament for i vivo delvis lever engineering i rotter, herunder decellularization og recellularization.
Introduction
Indikationer for organtransplantation konstant ekspanderende. Derimod er orgel donation priser og generelle kvalitet af organer faldende, hvilket fører til en stigende efterspørgsel efter podninger. Antallet af ansøgere, der er føjet til levertransplantation venteliste fortsatte med at stige (f.eks.i USA, 11,340 patienter blev tilføjet i 2016, sammenlignet med 10,636 i 2015)1. Trods betydelige bestræbelser opfylder antallet af tilgængelige organer ikke kliniske behov. På grund af den øgede forekomst af leversygdom, mange patienter med slutstadiet leversygdomme dø på hårtransplantation venter liste før en donor organ bliver tilgængelig. For at imødekomme den store efterspørgsel efter donor lever grafts, forfulgt alternative metoder ved hjælp af levervævet engineering principper bliver aktivt2. I dag, kunne en nyudviklet biologiske teknik af leveren engineering potentielt overvinde denne mangel.
Leveren engineering består af to trin: generation af en acellulær stillads, efterfulgt af en genindsættelse af skafottet. For at opnå en biologisk acellulær lever stillads, er eksplanterede leveren perfunderet via det vaskulære system med ioniske eller nonionisk vaskemidler, der kan fjerne det cellulære materiale fra leveren. I de fleste tidligere undersøgelser, blev en biologisk acellulær lever stillads opnået ved perfusion af leveren med en kombination af dodecyl natriumsulfat og TritonX100. Som et resultat, blev alle celler fjernet, mens strukturen i den ekstracellulære matrix blev opretholdt. Orgel stilladser var tilsås med modne celler, hepatocellulært, samt endotel cellelinjer og primære hepatocytter med eller uden samtidige anvendelse i endothelial celler eller mesenchymale stamceller (MSC). De fleste forskere fokus på ex vivo lever engineering3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Men i de fleste tidligere undersøgelser, kun små stykker af genopbyggede stillads kuber blev transplanteret ind i forskellige heterotopisk implantation websteder. I et par undersøgelser, blev delvis genopbyggede stilladser transplanteret som hjælpeansatte transplantat. Maksimal indberettet overlevelsestid var dog kun 72 h8,14. Så vidt vi ved, har orthotopic transplantation af en genopbyggede fuld lever graft endnu ikke er udført eller offentliggjort om. Den langsigtede funktion og transplantation af manipuleret organer er stadig i deres vorden. Derfor, en alternativ tilgang til ex vivo lever engineering er nødvendig.
In vivo lever engineering kan udgøre et alternativ til at studere hepatisk genindsættelse fysiologiske betingelser. Fordelene i vivo lever engineering i forhold til ex vivo lever teknik er mangfoldige. I vivo genbefolket delvis lever stillads er udsat for fysiologiske blod perfusion med rette temperatur, tilstrækkelig ilt, næringsstoffer og vækstfaktorer i modsætning til ex vivo perfusion med kunstige næringssubstratet. Desuden fastholder resterende delvis normale leveren den hepatiske funktion, hovedsagelig tillader langsigtede overlevelse. Da en indopererede ex vivo manipuleret lever graft er stadig ikke i stand til at opretholde den langsigtede overlevelse af forsøgsdyr ved sin leverfunktionen8, vi forestiller at i vivo delvis lever engineeringwould i sidste ende blive en lovende model til yderligere undersøge udviklingen af manipuleret lever med længere overlevelse observationer end ex vivo.
En forskningsgruppe (Pan og kolleger) fremlagde for nylig, for første gang, en teknik, i vivo leveren engineering15. De opnåede den isolerede perfusion af lige ringere lever lap i levende rotter trods anatomiske og tekniske udfordringer. De rapporterede de første intraoperativ resultater af i vivo genindsættelse ved hjælp af en rotte primære hepatocyt cellelinje. Men, i vivo kirurgisk perfusion model af Pan et al. har ulemper. De opnåede single lever lap perfusion i rotter på bekostning af helt blokere portalen vene og ringere vena cava, som kan forårsage alvorlig skade for dyret. De eksperimentelle rotter blev ofret efter kun 6 timers intraoperativ observationstidspunkt. Derfor, i vivo lever lap perfusion teknik skal yderligere forbedring at opnå postoperative overlevelse.
Vi udviklede en roman overlevelse model for i vivo lever lap perfusion, baseret på tidligere undersøgelser af hepatisk anatomi af rotte16, Vena cannulation teknik til hæmodynamiske overvågning i mus17, og leveren bioteknologi 18 , 19. de vigtigste skridt under proceduren er illustreret i figur 1A - 1E.
Denne teknik egner sig til dem, der ønsker at bruge denne eksperimentelle i vivo perfusion model til grundforskning på delvis orgel behandling af infusion med narkotika, i vivo decellularization som en kemisk resektion for orgel sygdomme (f.eks. , leverkræft), i vivo cellekultur i en decellularized matrix sammenligne ex vivo todimensional og tredimensional celle kultur systemer20,21,22,23 , 24 , 25 , 26og i vivo lever engineering af decellularization og genoprettelse af bestanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Boliger og alle procedurer udføres var i overensstemmelse med tyske dyrevelfærdslovgivningen. Alle gaze, dækker tøj og kirurgiske instrumenter er autoklaveres og forberedt før operationen. Alle procedurer udføres under sterile forhold.
1. forberedelse af Rat til den kirurgiske Procedure
- Placere rotten i en induktion kammer og bedøver rotte med 4% fordampet isofluran og 100% ilt på 0,5 L/min i ca 3 min., indtil rotten er helt bedøvede.
- Tage rotten ud af induktion kammer og måle sin kropsvægt.
- Barbere pels af den kirurgisk område på maven.
- Placere den animalske tilbage ind i isofluran salen for en yderligere 2 min til at uddybe anæstesi.
- Placere rotten på driften tabellen i liggende stilling.
- Fix anæstesi maske i munden området af rotte og holde dyret bedøvede med en kontinuerlig gasflow af 2% fordampet isofluran og 100% ilt på en flow-hastighed på 0,5 L/min.
- Løse lemmer med stykker tape.
- Anvende vet salve på begge øjne til at forhindre tørhed.
- Administrere buprenorphin 0,05 mg/kg subkutant, til at lindre smerter i perioden operation.
- Desinficere kirurgiske inden for maven med 3 runder af jod tinktur efterfulgt af 2 runder 70% alkohol.
- Sted steriliseret gaze rundt om det område, hvor indsnittet vil blive gjort til kun lade feltet operation i underlivet udsat.
- Gå videre til at udføre operationen, når tå-knivspids tilbagetrækning refleks af rotten er fraværende.
2. laparotomi af rotte
- Foretage en tværgående abdominal hud og muskel indsnit ved hjælp af saks og en elektrisk coagulator.
- Fix og trække formet som et sværd proces mod hovedet ved hjælp af en 4-0 polypropylen sutur.
Bemærk: Vær opmærksom opløfte formet som et sværd proces lodret til bedre eksponere leveren, men gå videre med forsigtighed for at undgå alvorlige luftvejssygdomme begrænsning og kvælning. - Åbn bughulen ved at trække begge sider af de abdominale vægge mod hovedet med to subcostal kroge til at eksponere leveren.
- Dække duodenum og tyndtarmen i bughulen med en fugtet gaze til at undgå udtørring.
- Løft venstre og højre median lapper ved hjælp af en fugtet gaze og holde dem mod brystkassen til bedre eksponere hilum af leveren.
- Placere rotten under et stereomikroskop (8 X forstørrelse).
- Drop nogle varmt saltvand i maven og på overfladen af lever og tarme hver flere minutter, for at forhindre udtørring under hele proceduren.
3. etablering af en Bypass Passage i venstre laterale lap
- Dissekere venstre Vena og ligate det med et 6-0 silke sutur i bunden (figur 2A).
- Blokere den venstre hepatiske arterie, den venstre galdegang venstre median portal vene, den venstre median hepatiske arterie og venstre median galdegang med micro klemmer til at forhindre en strøm af perfusate til venstre median lap (figur 2B).
- Adskille den venstre laterale lap ved at afskære de omkringliggende ledbånd af lap med micro saks.
- Blokere venstre lateral leverens vene af fastspænding i bunden af venstre laterale lap med micro klemmer (figur 2 c).
Bemærk: Sørg for ikke at klemme den venstre portåren samt ved en fejltagelse. - Brug myg klemmer til at holde ligatur af den venstre portåren og holde vene med korrekt spænding for senere cannulation.
- Omhyggeligt gøre et snit i den forreste væg af venstre Vena ved punktering det med en 24-G kanyle-bolig kateter ( figur 3A).
Bemærk: Hvis du vil oprette en bypass, vaskulære adgangspunkter på venstre Vena og venstre leverens vene er nødvendig. For dette trin, er det foretrukket at oprette vaskulær adgang ved punktering af fartøjer med en nål i stedet for at gøre et større indsnit ved hjælp af saks. Dette reducerer risikoen for blødning og senere stenose. - Trække kateteret og tag nålen ud af kateter til at opnå en nål-gratis 24-G kateter.
- Tilsluttes en perfusion tube kateteret, af hvilket andet slutpunktet tilknyttet en 20-mL sprøjte med 15 mL 40 heparinized U/mL saltvand på en perfusion pumpe.
- Tænde pumpen til perfusing røret for at udvise luften ud af røret og nål-fri kateteret.
- Slukke perfusion pumpe.
- Igen, indsætte nålen-fri kateteret i den venstre portåren via den punkteret indsnit på vene (figur 3B).
Bemærk: Da der er meget begrænset plads til fastsættelse af kateteret, det er ikke fast på dette punkt. Kirurgen skal derfor bruge pleje at undgå fortrængning af kanylerede kateteret. - Omhyggeligt gøre et andet snit på margenen af de udsatte region af venstre lateral leverens vene af punktering det med en 22 - eller 24-G kanyle-bolig kateter (figur 3 c).
Bemærk: Det anbefales, at kateteret er lidt mindre end fartøjet. - Trække kateteret og tag nålen ud af kateter til at opnå en nål-gratis 22-G kateter.
- Tænde perfusion pumpe til perfuse heparinized saltvand ind i venstre laterale lap via 24-G kanylerede nål-fri kateteret af venstre portal vene med en væskehastighed på 0,5 mL/min.
- Bruge tør gaze til at absorbere ud flydende affald væske omkring indsnit området af venstre lateral leverens vene.
- Kanyleres af venstre lateral leverens vene via den punkteret indsnit i vene med den 22-G kanyle-fri kateter, til at generere en væske outlet for at minimere intra-abdominal forurening (figur 3D).
Bemærk: Det er teknisk vanskeligt at fastsætte den kanylerede kateter til lever-lap. Derfor bør kirurgen være opmærksom på undgå fortrængning af kateteret. Alternativt, uden cannulation af venstre lateral leverens vene med et kateter, affald væske kan også optages på regionen indsnit i vene kun med en tør gaze. - Holde perfusing venstre laterale lap med heparinized saltvand i ca 20 min. (gruppe 1) og derefter kun med saltvand for 2 h, 3 h og 4 h (gruppe 2, gruppe 3 og gruppe 4, henholdsvis).
- Slukke pumpen til at stoppe perfusion.
4. fysiologiske Reperfusion af venstre laterale lap
- Tag begge katetre fra venstre Vena og venstre lateral leverens vene.
- Luk indsnit i venstre portal vene med en 11-0 polyamid sutur.
- Luk indsnit i venstre lateral leverens vene med en 11-0 polyamid sutur så godt.
- Udspænding venstre lateral leverens vene.
- Udspænding venstre median portal vene, venstre galdegang og venstre hepatisk arterie.
- Afbrød ligatur på venstre portåren til at genåbne venen.
5. lukning af bugvæggen
- Lukke muskel lag af bugvæggen ved afbrudt suturering med en 4-0 resorberbar polyglactin 910 sutur.
- Lukke huden lag i bugvæggen ved afbrudt suturering med en 4-0 resorberbar polydioxanone sutur.
- Efter lukketid i maven, desinficere huden snit med 70% alkohol.
6. postoperativ behandling af rotte
- Placere dyret på en opvarmning pad for genoplivning i ca 10 min og derefter sætte det ind i et nyt bur.
- Administrere buprenorphin 0,05 mg/kg subkutant 2 x en dag for et fortløbende 3 d efter operationen at frigive smerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tolv mand (alderen 12 - 13 uger) Lewis rotter blev brugt til at vurdere effekten af selektiv lever lap perfusion. Eksperimentet blev udført i fire grupper (n = 3 rotter pr. gruppe). Bruger forskellige perfusion perioder på 20 minutter, opnået 2 timer, 3 timer og 4 timer, efter de trin, der beskrives ovenfor, vi med held i vivo enkelt lap perfusion.
In Vivo Perfusion af venstre laterale lap:
Præcise anatomiske identifikation af venstre Vena og venstre lateral leverens vene og vellykket venstre portal vene og venstre lateral leverens vene cannulation kan bekræftes efter perfusion med heparinized saltvand. Den første indikator for en succesfulde identifikation og cannulation var den observation, at blod blandet med perfusate flød ud af venstre laterale lap via væske stikkontakten (figur 4A). Vellykket kirurgisk perfusion model blev yderligere bekræftet ved at observere ændringen af den venstre laterale lap farve efter perfusion med heparinized saltvand. Farven på den venstre laterale lap ændret fra rød til svag gul, med angivelse af fjernelse af blod fra venstre laterale lap. For at bekræfte vedligeholdelsen af den fysiologiske perfusion af de resterende fliger, var farven på de resterende lever kamre konstant observeret under perfusion af venstre laterale lap. Den korrekte perfusion af venstre laterale lap resulterede i lobe dreje svag gul, mens de resterende lever kamre fastholdt deres lyse røde farve under hele processen (figur 4B).
Fysiologiske Reperfusion af venstre laterale lap:
For at vurdere passage af de kanylerede fartøjer efter lukning snit af fartøjerne og genåbning af fartøjer, blev farveændring af venstre laterale lap observeret. Et par røde pletter dukket op på overfladen af den perfused svag gul venstre laterale lap efter genåbningen venstre lateral leverens vene, der angiver indledende retrograd perfusion i venstre laterale lap (figur 5A). Overfladen af den målrettede lap senere viste endnu mere røde pletter efter at slippe de mikro klemmer på den venstre hepatiske arterie, forlod galdegang, og forlod median Vena, hvilket indebærer yderligere fysiologiske perfusion af venstre laterale lap via den genåbnet fartøjer (figur 5B). Overfladen af den målrettede lever lap vendte mørkerød efter genåbningen venstre Vena, bekræfter, at den målrettede lever lap genvandt sin fulde fysiologiske perfusion via venstre Vena (figur 5 c).
Histologi af Perfused venstre laterale lap:
Efter efterbehandling heparinized saltvand eller saltvand perfusion, selektivt perfused venstre laterale lap (som eksperimentel) og den normale ringere spiegelske lap (som kontrol) var resektion og fast med formaldehyd og derefter underkastes en histologisk undersøgelse (Hansen & Estaining). I den venstre laterale lap er der ingen indlysende blodlegemer synlige i grenen af portalen vene, sinusoids og central vene. Som forventet, var røde blodlegemer synlige i grenen af hepatisk arterie (figur 6A og 6 C). I den normale ringere spiegelske lap (som kontrol) observeret blodlegemer betydeligt i grenen af Vena, sinusoids og den centrale vene (fig. 6B og 6 D).
Overlevelsesraten:
12 ud af tolv eksperimentelle rotter resulterede i en 1-ugers overlevelse på 100%. Dog 3 eksperimenterende rotter, som undergik 4 timer af perfusion lidt midlertidigt fra diarré og udflåd blodigt fra øjnene på den anden eller tredje dag efter operationen.
Figur 1 : Ordningen af det kirurgiske i vivo single lever lap perfusion model. (A) Dette er en skematisk tegning af rotte lever anatomi. ()B) dette panel viser blokeringen af venstre Vena, den venstre hepatiske arterie, den venstre galdegang, venstre median portal vene og venstre lateral leverens vene. (C) dette panel viser cannulation af venstre Vena og venstre lateral leverens vene med katetre til væske luftindtag og -udtag. (D) dette panel viser perfusion af venstre laterale lap med heparinized saltvand ved en perfusion pumpe. (E) dette panel viser den fysiologiske reperfusion af venstre laterale lap efter genåbningen de blokerede fartøjer til lap. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Intraoperativ billeder viser blokeringen af de fartøjer, der leverer og dræning venstre laterale lap. (A) dette panel viser ligatur af den venstre portal vene. (B) dette panel viser blokering af den venstre hepatiske arterie, den venstre galdegang og venstre median portåren/hepatisk arterie/galdegang med micro klemmer. (C) dette panel viser blokeringen af venstre lateral leverens vene med micro klemmer (hvid pil). Skala barer er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Intraoperativ billeder viser bypass omsætning gennem den venstre laterale lap. (A) dette panel viser indsnittet i venstre portal vene (hvid pil) ved punktering det med en 24-G kanyle-bolig kateter. (B) dette panel viser cannulation af venstre portal vene til en væske indtag med en 24-G kanyle-fri kateter (hvid pil). (C) dette panel viser indsnittet i venstre lateral leverens vene (hvid pil) ved punktering det med en 22-G kanyle-bolig kateter. (D) dette panel viser cannulation af venstre lateral leverens vene til en væske outlet med en 22-G kanyle-fri kateter (hvid pil). Skala barer er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Intraoperativ billeder viser perfusion af venstre laterale lap. (A) dette panel viser perfusate strømmer ind i den venstre laterale lap via inlet (gul kateter) og flyder ud af den venstre laterale lap via stikkontakt (blå kateter). Den venstre laterale lap var, ja, selektivt perfunderet, som det fremgår af farveskiftende af lap (hvid pil). (B) Bemærk farveændring af venstre laterale lap til svag gul efter perfusion med heparinized saltvand, mens de resterende lever lapper forblive lyse rødt (hvide pile). Skala barer er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Fysiologiske reperfusion af venstre laterale lap. (A) dette panel viser den retrograd perfusion af venstre laterale lap efter genåbningen venstre lateral leverens vene (hvid pil). (B) dette panel viser den fysiologiske reperfusion venstre laterale lap (hvid pil) efter at slippe mikro klemmer på den venstre median portal vene og den venstre hepatiske arterie. (C) dette panel viser den komplette reperfusion af venstre laterale lap (rød pil) efter genåbningen venstre Vena og iskæmi af venstre median lap (blå pil). Skala barer er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Histologisk vurderinger (H & E farvning). (A og C) disse paneler viser en histologisk vurdering af heparin-saltvand-perfunderet venstre laterale lap (eksperimentel lap) demonstrerer manglende blodlegemer hos (A) portalen vene og sinusoids og (C) den centrale vene. (A) men røde celler er synlige i den hepatiske arterie (sort pil) som forventet. (B og D) disse paneler viser en histologisk vurdering af den normale ringere spiegelske lap (kontrol) afslører tilstedeværelsen af blod celler i hele vaskulære strukturer: (B) portalen vene, hepatisk arterie og sinusoids (sorte pile), og (D) central vene (sort pil). Skala barer er 250 µm.
| Parametre | Resultater | |
| Forskningsgruppen | Pan mfl 2016 [15] | Egen gruppe |
| In vivo | Ja | Ja |
| Target lever lap | Lige ringere lap
|
Venstre laterale lap
|
| Blokering af vena cava og vigtigste portal vene | Ja
|
Nej
|
| Iskæmi af de resterende lapper | Ja | Kun venstre median lap |
| Cannulation af vena cava | Ja | Nej |
| Cannulation af vigtigste portal vene | Ja | Nej |
| Portal hypertension | Ja | Nej |
| 1 uge overlevelsesrate | Ofret intraoperatively | 100% |
Bord 1. Sammenligning mellem forskellige modeller af i vivo lever engineering. Denne tabel viser kritiske forskelle i to model virksomhederne mellem Pan et al. 15 og vores forskergruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved at blokere og cannulating venstre portal vene med et kateter som en væske indtag og venstre lateral leverens vene med en anden kateter som en væske outlet, genereret vi med succes en i vivo væske bypass i venstre laterale lap, der angiver, at selv om teknikken er meget udfordrende på grund af den lille størrelse af fartøjer til cannulation og en høj risiko for at forårsage blødning, er det muligt. Selv rotter gennemgår en lang perfusion periode på 4 timer overlevede mindst 1 uge, viser, at rotterne kunne tåle denne kirurgiske procedure.
I de følgende afsnit beskriver vi de tre teknisk mest vanskelige og kritiske skridt og hvordan man med held beherske dem. For det første ved at adskillelse og ligatur af den venstre portal vene, på grund af det tætte rumlige forhold af den målrettede portal vene med det omkringliggende lever parenkym, har isolation af fartøjet en høj risiko for at forårsage blødning. Vi anbefaler at bruge mikro pincet snarere end saks til at adskille venstre Vena, ved omhyggeligt at rive fra hinanden de tilsluttede avascular væv omkring venstre Vena. For det andet, med hensyn til snit på den forreste væg af venstre Vena, en oversize indsnit på den forreste væg af venstre Vena kan øge vanskeligheden ved indsnit reparation og chance for at forårsage stenose efter vaskulære anastomose. Vi anbefaler at bruge en nål-bolig kateter i stedet for at Sakse til at lave en ordentligt størrelse snit. For det tredje, hvad angår blokering af venstre lateral leverens vene, hvis regionen udsatte i venstre lateral leverens vene er blokeret forkert, vil der ikke være tilstrækkeligt udsat plads på venstre lateral leverens vene for senere cannulation. Vi foreslår klemmemekanismen bør udføres tæt på venstre median lap og ikke midt i regionen udsat af venstre lateral leverens vene.
Vi sammenligner to modeller af selektiv i vivo lever perfusion mellem Pan et al. 15 og ours (tabel 1). For det første anses udvælgelsen af den målrettede lever lap en mest kritiske trin for model oprettelse. Vi udvalgte en temmelig isoleret lap, venstre lateral lap, som den målrettede lap for i vivo kirurgisk perfusion model etablering. Derimod valgt forskningsgruppe af Pan den lige ringere lap for model14. Manglerne ved at vælge den højre ringere lap er som followings: for det første, de havde til at gå på kompromis ved fuldstændig blokering og cannulating vena cava til en væske outlet, som kan have en negativ effekt blodcirkulationen af dyret. For det andet, de havde til at blokere og kanyleres de vigtigste portal vene til en Fjord, som forårsagede iskæmi af resterende lever lapper og portal hypertension. I forhold til den lap målrettet her, venstre lateral lap, vi blokeret og kanylerede venstre lateral leverens vene i stedet for vena cava til en væske outlet. Vi genereret en væske indtag ved at vælge venstre portal vene, som har en temmelig stor diameter, lette dissektion, blokering, og cannulation. Derfor undgås direkte blokerer blodtilførslen til vena cava og vigtigste Vena i modellen præsenteres her, som er afgørende for overlevelsen af rotten.
Trods de store muligheder for i vivo lever lap perfusion har denne teknik nogle begrænsninger. For det første er iskæmi af venstre mediale lap uundgåelig, på grund af blokering af venstre median portal vene i løbet af processen. For det andet, baseret på den midlertidige blokering i bunden af venstre laterale lap ved hjælp af mikro klemmer, dette kan føre til skade af leveren parenkym omkring den lobar base og uundgåeligt medføre en lille lækage under perfusion med heparinized saltvand. Tre eksperimentelle rotter, som blev udsat for en perfusion periode på 4 timer lidt midlertidigt fra diarré og blodige okulær decharge, tyder på, at 4 timer kan være den maksimale perfusion periode for en rotte uden lider flere komplikationer. Til vores viden er i mindst 3 timer nødvendig for decellularization af en hel rotte lever ex vivo18. Derfor, 4 timerne perfusion tid vi har til formål at opnå ville være tilstrækkelig til yderligere lever lap decellularization, hvilket er en forudsætning for leveren engineering af celle genindsættelse af en lever stillads.
I fremtiden, kan denne roman teknik til en i vivo perfusion model potentielt bruges i eksperimentel forskning for delvis orgel behandling af infusion med stoffer, i vivo delvis orgel decellularization som kemiske resektion, som en " in vivo celle kultur-systemet ", og måske vigtigst, in vivo delvis orgel engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Jens Geiling af anatomisk Institut I, Jena University Hospital, til at producere de skematiske tegninger af rotte lever anatomi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon |
References
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
