Summary
Vi etablera en ny kirurgisk teknik för en genomblödning i vivo enda lever LOB modell råtta som en förutsättning för att ytterligare studera i vivo partiell levern engineering i framtiden.
Abstract
Orgel engineering är en ny strategi för att generera levern orgel substitut som potentiellt kan användas vid transplantation. Nyligen, i vivo lever ingenjörsvetenskap, inklusive in-vivo orgel decellularization följt av återinsättning, har vuxit fram som en lovande strategi över ex vivo lever engineering. Däremot uppnåddes inte postoperativ överlevnad. Syftet med denna studie är att utveckla en ny kirurgisk teknik av i vivo selektiv lever LOB perfusion hos råttor som en förutsättning för i vivo lever engineering. Vi genererar en krets bypass endast genom den vänstra laterala loben. Sedan, är den vänstra laterala loben perfusion med hepariniserad saltlösning. Experimentet utförs med 4 grupper (n = 3 råttor per grupp) baserat på olika perfusion gånger 20 min, 2 h, 3 h och 4 h. överlevnad, liksom den makroskopiskt synliga förändringen av färg och histologiskt beslutsamma avsaknad av blodkroppar i den portalen triad och sinusoider, tas som en indikator för en framgångsrik modell etablering. Efter selektiv perfusionen i den vänstra laterala loben observerar vi att den vänstra laterala loben, faktiskt vände från röda till svagt gul. En histologisk utvärdering syns inga blodkroppar inom grenen av portalen ven, central ven och sinusoider. Den vänstra laterala loben röd efter nyöppningen de blockerade fartyg. 12/12 råttor överlevde förfarandet för mer än en vecka. Vi är först att rapportera en kirurgisk modell för i vivo enda lever LOB perfusion med en lång överlevnad period av mer än en vecka. I motsats till den tidigare publicerade rapporten, den viktigaste fördelen med tekniken presenteras här är att perfusionen i 70% av levern upprätthålls under hela förfarandet. Inrättandet av denna teknik ger en grund för i vivo delvis lever engineering hos råttor, inklusive decellularization och recellularization.
Introduction
Indikationerna för organtransplantation är ständigt växande. Däremot minskar organ donation priser och kvaliteten hos organ, vilket leder till en ökad efterfrågan på transplantat. Antalet kandidater till levertransplantation väntelistan fortsatte att öka (t.ex., i USA, 11,340 patienter lades under 2016, jämfört med 10,636 2015)1. Trots stora ansträngningar uppfyller antalet tillgängliga organ inte kliniska behov. På grund av den ökade förekomsten av leversjukdom, många patienter med slutstadiet leversjukdomar die på väntelistan innan en givare organ transplantation blir tillgänglig. För att möta den stora efterfrågan på givare levern ympkvistar, eftersträvas alternativa metoder med hjälp av levervävnad tekniska principer att aktivt2. Nuförtiden, kunde en nyutvecklad biologiska teknik lever högskola potentiellt övervinna denna brist.
Lever engineering består av två steg: generering av ett acellulärt schavotten, följt av en återinsättning av ställningen. För att erhålla en biologisk acellulärt lever byggnadsställning, är explanterad levern perfunderade via kärlsystemet med jonisk eller Nonjonaktivt rengöringsmedel, som kan ta bort det cellulära materialet från levern. I de flesta tidigare studier uppnåddes en biologisk acellulärt lever byggnadsställning av perfusionen i levern med en kombination av sodium dodecyl sulfate och TritonX100. Som ett resultat, togs alla celler bort, medan strukturen i den extracellulära matrixen bibehölls. De orgel ställningar var sådd med mogna celler, hepatocellulär, samt endothelial cellinjer och primära hepatocyter med eller utan samtidig tillämpning av endotelceller eller mesenkymala stamceller (MSC). De flesta forskare fokus på ex vivo lever engineering3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. I de flesta tidigare studier transplanterade dock bara små bitar av nyinsatta byggnadsställning kuber i olika heterotopisk implantationsställen. I några studier transplanterades partiell nyinsatta ställningar som extra transplantat. Maximal rapporterade överlevnadstiden var dock endast 72 h8,14. Såvitt vi vet, har ortotop transplantation av en nyinsatta full lever transplantat ännu inte utfört eller publicerats om. Den långsiktiga funktion och konstruerade organtransplantation är fortfarande i sin linda. Därför behövs en alternativ strategi för ex vivo lever engineering.
In vivo lever engineering kan utgöra ett alternativ till att studera nedsatt återinsättning under fysiologiska betingelser. Fördelarna med i vivo lever engineering jämfört med ex vivo lever engineering är mångfaldiga. I vivo nyinsatta delvis lever schavotten betvingas till fysiologiska blodgenomströmning med rätt temperatur, tillräcklig syre, näringsämnen och tillväxtfaktorer i motsats till ex vivo perfusion med artificiellt odlingsmedium. Dessutom upprätthåller återstående delvis normala levern nedsatt funktion, att främst tillåta långsiktiga överlevnad. Eftersom en inopererad ex vivo konstruerad lever transplantat är fortfarande oförmögen att upprätthålla långsiktiga överlevnad försöksdjur av dess leverfunktionen8, föreställer vi att in-vivo delvis lever engineeringwould i slutändan bli en lovande modell för att ytterligare studera utvecklingen av bakåtkompilerade lever med längre överlevnad iakttagelser än ex vivo.
Nyligen presenterade en forskargrupp (panorera och kollegor), för första gången, en teknik i vivo levern engineering15. De uppnått den isolerad perfusionen av just sämre lever LOB på levande råttor trots anatomiska och tekniska utmaningar. De rapporterade första intraoperativ resultaten av i vivo återinsättning använder en råtta primära hepatocyte cellinje. Dock i vivo kirurgiska perfusion modell Pan et al. har nackdelar. De uppnått enda lever LOB perfusion hos råttor på bekostnad av helt blockerar den portalen ven och sämre vena cava, vilket kan orsaka allvarlig skada för djuret. Experimentell råttorna offrades efter bara 6 timmar av intraoperativ observationstid. Därför behöver i vivo lever LOB perfusion tekniken förbättras att uppnå postoperativ överlevnad.
Vi utvecklat en roman överlevnad modell för i vivo lever LOB perfusion, baserat på tidigare studier av råtta16, portalen ven kanylering tekniken för hemodynamisk övervakning i möss17och levern bioengineering nedsatt anatomi 18 , 19. de viktigaste stegen för förfarandet illustreras i figur 1A - 1E.
Denna teknik är lämplig för dem som vill använda denna experimentella i vivo perfusion modell för grundforskning om partiell orgel behandling av infusion med droger, i vivo decellularization som en kemisk resektion för orgel sjukdomar (t.ex. , levercancer), in-vivo cellkultur i en cell-lösa matris jämföra ex vivo tvådimensionell och tredimensionell cell kultur system20,21,22,23 , 24 , 25 , 26och i vivo lever engineering av decellularization och återinsättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bostäder och alla procedurer utförs var enligt tysk djurskyddslagstiftning. Alla gasväv, täckande kläder och kirurgiska instrument är autoklaveras och förberedda före operationen. Alla procedurer utförs under sterila förhållanden.
1. beredning av tjalla för det kirurgiska ingreppet
- Placera råtta i en induktion kammare och söva råtta med 4% förångas isofluran och 100% syrgas vid 0,5 L/min för ca 3 min, tills råttan är helt sövd.
- Ta råtta ur induktion kammaren och mäta dess kroppsvikt.
- Raka päls av kirurgiska regionen på buken.
- Placera djur baksida in i isofluran kammaren för en ytterligare 2 min att fördjupa anestesi.
- Placera råtta på tabellen drift i ryggläge.
- Fixa anestesi masken till regionen mun i råtta och hålla djuret bedövas med en kontinuerlig gasflödet av 2% förångas isofluran och 100% syrgas vid ett flöde av 0,5 L/min.
- Fixa benen med bitar av tejp.
- Applicera vet salva på båda ögonen att förhindra torrhet.
- Administrerar buprenorfin 0,05 mg/kg subkutant, att lindra smärta under drift.
- Desinfektera operationsområdet av buken med 3 rundor av jod tinktur följt av 2 omgångar med 70% alkohol.
- Plats steriliseras gasbinda runt området där snittet kommer att göras endast lämna fältet operation i buken som exponeras.
- Fortsätt att utföra operationen när tå-nypa tillbakadragande reflexen av råtta är frånvarande.
2. laparotomi råttans
- Göra ett tvärgående mage hud och muskler snitt med sax och en elektrisk coagulator.
- Fixa och dra den xiphoid processen mot huvudet med en 4-0 polypropylen sutur.
Obs: Var uppmärksam att lyfta upp den xiphoid processen vertikalt till bättre exponera levern, men fortsätt med försiktighet för att undvika allvarlig respiratorisk begränsning och kvävning. - Öppna bukhålan genom att dra båda sidor av buken väggarna mot huvudet med två subcostal krokar att exponera levern.
- Täcka tolvfingertarmen och tunntarmen i bukhålan med en fuktad kompress att undvika uttorkning.
- Lyft vänster och höger median lober med hjälp av en fuktad kompress och håll dem mot bröstkorgen att bättre exponera hilum för levern.
- Placera råtta under ett stereomikroskop (8 X förstoring).
- Släpp lite varm saltlösning in i buken och på ytan av lever och tarmar varje flera minuter, för att förhindra uttorkning under hela förfarandet.
3. inrättandet av en Bypass Passage inom den vänstra laterala loben
- Dissekera vänster portalen ven och ligera det med en 6-0 silk sutur vid basen (figur 2A).
- Blockera den vänstra hepatiska artären, vänster gallgången samt vänster median portalen ven, den vänstra median nedsatt artären och vänster median gallgången med micro klämmor att förhindra ett flöde av perfusatet på vänster median lob (figur 2B).
- Separera den vänstra laterala loben genom att skära av de omgivande ligament av LOB med micro sax.
- Blockera den vänstra laterala nedsatt ven genom fastspänning vid basen av den vänstra laterala loben med micro klämmor (figur 2 c).
Obs: Se till att inte klämma vänster portalen ven samt av misstag. - Använd mygga klämmor att hålla ligatur av vänster portalen ven och hålla ven med korrekt spänning för senare kanylering.
- Noggrant gör ett snitt i den främre väggen av vänster portalen ven genom att punktera det med en 24-G nål-bostad kateter ( figur 3A).
Obs: Om du vill skapa en bypass, vaskulär accesspunkter på vänster portalen ven och den vänster nedsatt ven behövs. För det här steget, det är att föredra att skapa kärlaccessen genom att punktera fartyg med en nål i stället för att göra ett större snitt med sax. Detta minskar risken för blödningar och senare stenos. - Ta ut katetern och ta ut nålen ur katetern att erhålla en nålfri 24-G kateter.
- Koppla katetern till en perfusion röret, av som den andra slutpunkten ansluter till en 20 mL spruta med 15 mL 40 U/mL hepariniserad koksaltlösning på en perfusion pump.
- Slå på pumpen för startas röret att utvisa luften ut från röret och nålfri katetern.
- Stäng av pumpen perfusion.
- Igen, infoga nålfri katetern i den vänstra portal ven via punkterad snittet på venen (figur 3B).
Obs: Grund av mycket begränsat utrymme finns för fastställande katetern, det är inte fast på denna punkt. Kirurgen bör därför använda vård att undvika förskjutning av kanylerade katetern. - Noggrant gör ett annat snitt på marginalen i regionen utsatt av vänster laterala nedsatt ven genom att punktera det med en 22 - eller 24-G nål-bostad kateter (figur 3 c).
Obs: Det rekommenderas att katetern vara något mindre än fartyget. - Ta ut katetern och ta ut nålen ur katetern att erhålla en nålfri 22-G kateter.
- Slå på perfusion pumpen att BEGJUTA hepariniserad saltlösning in i den vänstra laterala LOB via 24-G kanylerade nålfri katetern av vänster portalen ven med en flödeshastighet på 0,5 mL/min.
- Använd torr gasbinda för att absorbera ut strömmande avfall vätska runt området snitt i vänster laterala nedsatt venen.
- Hål till vänster laterala nedsatt ven via punkterad snittet av ven med 22-G nålfri katetern, att generera en vätska utlopp för att minimera intraabdominella kontaminering (figur 3D).
Obs: Det är tekniskt svårt att fixa kanylerade katetern på levern LOB. Kirurgen bör därför uppmärksamma att undvika förskjutning av katetern. Utan kanylering av vänster laterala nedsatt ven med en kateter, kan alternativt avfall vätska också absorberas på regionen snitt av ven endast med en torr kompress. - Hålla startas den vänstra laterala loben med hepariniserad saltlösning för ca 20 min (grupp 1) och då endast med koksaltlösning för 2 h, 3 h eller 4 h (grupp 2, grupp 3 och grupp 4, respektive).
- Stäng av pumpen för att stoppa perfusionen.
4. fysiologiska Reperfusion av den vänstra laterala loben
- Ta bort båda katetrar från vänster portalen ven och vänster laterala nedsatt venen.
- Nära snittet av vänster portalen ven med en 11-0 polyamid sutur.
- Nära snittet i den vänstra laterala nedsatt ven med en 11-0 polyamid sutur samt.
- Klämbygeln vänster laterala nedsatt venen.
- Transportera den vänstra median portvenen, vänster gallgången och vänster nedsatt artär.
- Avskurna ligatur på vänster portalen ven att återuppta venen.
5. avslutande av bukväggen
- Avbrutna suturering med en 4-0 resorberbar polyglactin 910 sutur i närheten muskellagrar av bukväggen.
- Avbrutna suturering med en 4-0 resorberbar Polydioxanon sutur i närheten hudlagret av bukväggen.
- Efter stängning buken, desinficera huden snitt med 70% alkohol.
6. postoperativ behandling av råtta
- Placera djuret på en värmande pad för återupplivning i ca 10 min och sedan sätta det i en ny bur.
- Administrerar buprenorfin 0,05 mg/kg subkutant 2 x per dag för en rad 3 d postoperativt att släppa smärta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tolv hane (åldern 12 - 13 veckor) Lewis råttor användes för att bedöma effekten av selektiv lever LOB perfusion. Experimentet utfördes i fyra grupper (n = 3 råttor per grupp). Använder olika perfusion perioder om 20 minuter, uppnått 2 timmar, 3 timmar och 4 timmar, följa stegen som beskrivs ovan, vi framgångsrikt i vivo enda LOB perfusion.
In Vivo Perfusionen i den vänstra laterala loben:
Korrekta anatomiska identifiering av vänster portalen ven och den vänstra laterala nedsatt ven och framgångsrik vänster portalen ven och vänster laterala nedsatt ven kanylering kan bekräftas efter perfusion med hepariniserad saltlösning. Den första indikatorn på en framgångsrik identifiering och kanylering var observationen att blod blandat med perfusatet rann ur den vänstra laterala LOB via utloppet vätska (figur 4A). Den framgångsrika kirurgiska perfusion modellen bekräftades ytterligare genom att Observera ändringen av den vänstra laterala lobes färg efter perfusionen med hepariniserad saltlösning. Färgen på den vänstra laterala loben ändrats från ljust rött till svagt gul, som anger borttagning av blod från den vänstra laterala loben. För att bekräfta underhåll av fysiologiska perfusionen av återstående loberna, observerades färgen på resterande lever loberna ständigt under perfusionen i den vänstra laterala loben. Rätt perfusionen i den vänstra laterala loben resulterade i den LOB som slå svag gul medan resterande lever loberna underhålls deras klarröd färg genom hela processen (figur 4B).
Fysiologiska Reperfusion av den vänstra laterala loben:
För att bedöma patency kanylerade fartyg efter stängning snitt av fartyg och Nyöppning fartygen, observerades färgaändringen av den vänstra laterala loben. Några röda fläckar dök upp på ytan av den perfunderade svag gul vänster laterala loben efter nyöppningen den vänstra laterala nedsatt ven, som anger första retrograd perfusion i den vänstra laterala loben (figur 5A). Ytan av den rikta loben senare visade ännu mer röda prickar efter släppa micro klämmorna av vänster nedsatt artär, lämnade gallgången, och median portvenen, vilket innebär ytterligare fysiologiska perfusionen i den vänstra laterala LOB via den återöppnade fartyg (figur 5B). Ytan av den rikta lever loben vände mörkröd efter nyöppningen vänster portalen ven, bekräftar att den rikta lever loben återfått sin fulla fysiologiska perfusion via vänster portalen ven (figur 5 c).
Histologi av den perfunderade vänstra laterala loben:
Efter efterbehandling hepariniserad saltlösning eller salthaltigt perfusion, den selektivt perfunderade vänstra laterala loben (som experimentell) och den normala sämre caudatus lob (som kontroll) var resected och fast med formaldehyd och sedan genomgå en Histologisk undersökning (H & Estaining). I den vänstra laterala loben finns det inga uppenbara blodkroppar synliga i grenen av portalen ven, sinusoider och central ven. Som förväntat, syntes röda blodkroppar i grenen av den hepatiska artären (figur 6A och 6 C). I den normala sämre caudatus lob (som kontroll) observerades signifikant blodkroppar i grenen i portalen ven, sinusoider och central ven (figur 6B och 6 D).
Överlevnad:
Tolv av tolv experimentella råttor resulterade i en 1-veckas överlevnad av 100%. Men 3 experimentella råttor som genomgick 4 timmars perfusion lidit tillfälligt av diarré och flytningar blodiga från ögonen på den andra eller tredje dagen efter operationen.
Figur 1 : Systemet av de kirurgiska i vivo enda lever LOB perfusion modell. (A) Detta är en schematisk ritning av råtta lever anatomi. ()B) i denna panel visas blockeringen av vänster portalen ven, den vänstra hepatiska artären, vänster gallgången, vänster median portalen ven och vänster laterala nedsatt venen. (C), denna panel visar kanylering av vänster portalen ven och den vänstra laterala nedsatt ven med katetrar för flytande inlopp och utlopp. (D), denna panel visar perfusionen i den vänstra laterala loben med hepariniserad saltlösning av en perfusion pump. (E), denna panel visar den fysiologiska reperfusion av den vänstra laterala loben efter nyöppningen de blockerade fartyg på LOB. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Intraoperativ bilder visar blockeringen av fartygen leverera och dränerar den vänstra laterala loben. (A) denna panel visar ligering av vänster portalen ven. (B) denna panel visar blockeringen av den vänstra hepatiska artären, vänster gallgången och vänster median portalen ven/nedsatt artär/gallgången med micro klämmor. (C), denna panel visar blockeringen av den vänstra laterala nedsatt ven med micro klämmor (vit pil). Skala barerna är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Intraoperativ bilder visar bypass cirkulationen genom den vänstra laterala loben. (A) denna panel visar snittet i vänster portalen ven (vit pil) genom att punktera det med en 24-G nål-bostad kateter. (B) denna panel visar kanylering av vänster portalen ven för en vätska inlopp med en 24-G nålfri kateter (vit pil). (C), denna panel visar snittet i den vänstra laterala nedsatt ven (vit pil) genom att punktera det med en 22-G nål-bostad kateter. (D), denna panel visar kanylering av vänster laterala nedsatt ven för en vätska utlopp med en 22-G nålfri kateter (vit pil). Skala barerna är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Intraoperativ bilder visar perfusionen i den vänstra laterala loben. (A) denna panel visar perfusatet flyter in i den vänstra laterala LOB via inloppet (gula kateter) och rinner ut ur den vänstra laterala LOB via utloppet (blå kateter). Den vänstra laterala loben var, faktiskt, selektivt perfusion, vilket framgår av den färg byte av LOB (vit pil). (B) OBS färgaändringen av vänster laterala loben till svagt gul efter perfusionen med hepariniserad saltlösning, medan de återstående lever loberna förbli ljust röd (vita pilar). Skala barerna är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Fysiologiska reperfusion av den vänstra laterala loben. (A) denna panel visar retrograd perfusionen i den vänstra laterala loben efter nyöppningen den vänstra laterala nedsatt ven (vit pil). (B) denna panel visar fysiologiska reperfusion vänster laterala loben (vit pil) efter att ha släppt mikro klämmor på vänster median portalen ven och vänster nedsatt artär. (C), denna panel visar komplett reperfusion av den vänstra laterala loben (röd pil) efter nyöppningen vänster portalen ven och ischemi av vänster median lob (blå pil). Skala barerna är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6 : Histologiska bedömningar (H & E färgning). (A och C) dessa paneler visar en histologisk bedömning av heparin-saltlösning-perfusion vänstra laterala lob (experimental LOB) visar avsaknad av blodkroppar i ()A) i portalen ven och sinusoider, och (C) central ven. (A) dock erytrocyter är synliga i den hepatiska artären (svart pil) som förväntat. (B och D) dessa paneler visar en histologisk bedömning av den normala sämre caudatus lob (kontroll) avslöja förekomsten av blodkroppar i alla vaskulära strukturer: (B) portvenen, hepatiska artären och sinusoider (svarta pilar), och (D) central ven (svart pil). Skala barerna är 250 µm.
| Parametrar | Resultat | |
| Forskargrupp | Pan et al 2016 [15] | Egna gruppen |
| In vivo- | Ja | Ja |
| Mål lever LOB | Just underlägsen LOB
|
Vänstra laterala loben
|
| Blockering av vena cava och huvudsakliga portalen ven | Ja
|
Nej
|
| Ischemi av återstående loberna | Ja | Endast vänster median LOB |
| Kanylering av vena cava | Ja | Nej |
| Kanylering av huvudsakliga portalen ven | Ja | Nej |
| Portal hypertension | Ja | Nej |
| 1 vecka överlevnaden | Offrade intraoperatively | 100% |
Tabell 1. Jämförelse mellan olika modeller av i vivo lever engineering. Denna tabell visar kritiska skillnader i de två modell anläggningarna mellan Pan et al. 15 och vår forskargrupp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genom att blockera och cannulating vänstra portalen ven med en kateter som en flytande inlopp och den vänstra laterala nedsatt ven med en annan kateter som en flytande utlopp, genererade framgångsrikt vi en in-vivo vätska bypass inom den vänstra laterala loben, som anger att även om tekniken är mycket utmanande på grund av den lilla storleken på fartygen för kanylering och en hög risk för orsakar blödning, är det möjligt. Även de råttor som genomgår en lång perfusion 4 timmar överlevde minst 1 vecka, visar att råttorna kunde tolerera detta kirurgiska ingrepp.
I följande avsnitt beskriver vi de tre tekniskt svåraste och kritiska steg och hur man framgångsrikt behärska dem. För det första håller på separation och ligering av den vänstra portvenen, på grund av det nära rumsliga sambandet av riktade portalen ven med omgivande levern parenkymet, har isolering av fartyget en hög risk att orsaka blödningar. Vi rekommenderar att du använder micro tången i stället för sax till separata vänster portalen ven, genom att försiktigt riva isär den anslutna avaskulär vävnad som omger vänster portalen ven. För det andra, när det gäller snittet på den främre väggen av vänster portalen ven, ett överdimensionerade snitt på den främre väggen av vänster portalen ven kan öka svårigheten att snitt reparation och chansen att orsakar stenos efter vaskulär anastomos. Vi rekommenderar att du använder en nål-bostad-kateter i stället för sax för att göra ett snitt för rätt storlek. För det tredje, angående blockeringen av vänster laterala nedsatt ven, om regionen exponerade i den vänstra laterala nedsatt ven blockeras felaktigt, kommer det inte finnas tillräckligt utsatt utrymme på den vänstra laterala nedsatt ven för senare kanylering. Vi föreslår att den fastspänning bör utföras nära den vänstra median LOB i stället för i mitten av regionen exponerade i den vänstra laterala nedsatt ven.
Vi jämför de två modellerna av selektiv i vivo lever perfusion mellan Pan et al. 15 och vår (tabell 1). För det första anses urvalet av den rikta lever loben en mest kritiska steg för modell etableringen. Vi valde en ganska isolerad LOB, den vänstra laterala loben, som den rikta LOB i vivo kirurgiska perfusion modell inrättas. Däremot utvalda gruppen av Pan på just underlägsen LOB för modell14. Brister i att välja på just underlägsen LOB är som följande: för det första, de var tvungna att kompromissa genom att helt blockera och cannulating vena cava för en vätska outlet, som negativt kan påverka blodcirkulationen av djuret. För det andra, de hade att blockera och cannulate huvudsakliga portalen ven för ett inlopp, som orsakade ischemi av återstående lever lober och portal hypertension. Jämfört med den LOB som riktade här, den vänstra laterala loben, vi blockerade och kanylerade vänster laterala nedsatt ven istället för vena cava för en vätska utlopp. Genererade vi en flytande inlopp genom att välja vänster portalen ven, som har en ganska stor diameter, underlätta dissektion, blockering och kanylering. Därför undviks direkt blockera blodflödet till vena cava och huvudsakliga portalen ven i den modell som presenteras här, vilket är avgörande för överlevnaden av råtta.
Trots den stora potentialen för i vivo lever LOB perfusion har denna teknik vissa begränsningar. För det första, ischemi av vänster mediala LOB är oundvikliga, på grund av blockering av vänster median portalen ven under processen. För det andra, baserat på den tillfälliga blockeringen vid basen av den vänstra laterala loben använder micro klämmor, detta kan leda till skador på levern parenkymet kring lobära basen och oundvikligen leda till en smärre läckage under perfusionen med hepariniserad saltlösning. Tre experimentella råttor som utsattes för perfusion under 4 timmar är tillfälligt lidit av diarré och blodiga okulär urladdning, vilket tyder på att 4 timmar kan vara maximalt perfusion perioden för en råtta utan att drabbas av fler komplikationer. Till vår kunskap krävs minst 3 timmar för decellularization en hel råtta lever ex vivo18. Därför skulle de 4 timmarna perfusion tid vi avsåg att uppnå räcka för ytterligare lever LOB decellularization, vilket är en förutsättning för levern engineering av cell återinsättning av en lever byggnadsställning.
I framtiden, kan denna nya teknik för en in-vivo perfusion modell potentiellt användas i experimentell forskning för partiell orgel behandling av infusion med droger, i i vivo partiell orgel decellularization som kemiska resektion, som en ” invivo cell kultur system ”, och, kanske viktigast av allt, för in vivo partiell orgel engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Jens Geiling från Institutet av anatomin I, Jena universitetssjukhus, för att producera de schematiska ritningarna av råtta lever anatomi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon |
References
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
