Summary
אנו להקים טכניקה כירורגית חדשניים עבור מודל זלוף יחיד בכבד באונה ויוו בשנת החולדה כתנאי נוספת ללמוד ויוו הכבד חלקית הנדסה בעתיד.
Abstract
אורגן הנדסה היא אסטרטגיה הרומן לייצר תחליפים איבר הכבד יכול באופן פוטנציאלי לשמש השתלת. לאחרונה, ויוו הכבד הנדסה, כולל ויוו איברים decellularization ואחריו איכלוס, התפתחה גישה מבטיחה מעל שמחוץ לכבד הנדסה. עם זאת, הישרדות לאחר הניתוח לא הושגה. מטרת המחקר היא לפתח טכניקה כירורגית הרומן של ויוו סלקטיבי בכבד באונה זלוף בחולדות כתנאי ויוו הכבד הנדסה. נוכל ליצור מעקף מעגל רק דרך האונה השמאלית לרוחב. לאחר מכן, לרוחב האונה השמאלית היא perfused עם heparinized מלוחים. הניסוי מבוצעת עם ארבע קבוצות (n = 3 חולדות לכל קבוצה) המבוסס על פעמים זלוף שונים של 20 דקות, 2 h. 3 h ו 4 h הישרדות, כמו גם השינוי בעין בלתי מזוינת גלוי של צבע ועל חוסר כדוריות הדם בהיסטולוגיה נחוש פורטל שילוש ו- sinusoids את, נלקח כמחוון עבור מוסד מודל מוצלח. לאחר זלוף סלקטיבי של האונה השמאלית לרוחב, אנו מבחינים כי לרוחב האונה השמאלית, ואכן, הפך מאדום לצהוב עמום. בהערכה היסטולוגית, אין תאי דם גלויים בענף של וריד שער הכבד, את וריד מרכזי ו- sinusoids. האונה הלטראלי השמאלי הופך לאדום לאחר פתיחה מחדש את כלי-הדם החסומים. 12/12 חולדות שרד ההליך במשך יותר משבוע. אנחנו הראשונים לדווח למודל כירורגי ויוו זלוף אונה בכבד יחיד עם תקופת ההישרדות ארוך יותר משבוע. בניגוד ח שפורסמו בעבר, היתרון החשוב ביותר של הטכניקה המובאת כאן זה זלוף 70% של הכבד נשמר לאורך כל התהליך. הקמתה של טכניקה זו מספק בסיס ויוו חלקי הכבד הנדסה בחולדות, כולל decellularization ו- recellularization.
Introduction
הסימנים של השתלת איברים ללא הרף מתרחבים. לעומת זאת, המחירים תרומת איברים, האיכות הכוללת של איברים הולכים ופוחתים, שמוביל לדרישה גוברת על השתלים. מספר המועמדים נוספו לרשימת הממתינים להשתלה כבד המשיכו להגדיל (למשל, בארצות הברית, חולים 11,340 נוספו בשנת 2016, לעומת 10,636 בשנת 2015)1. למרות מאמצים ניכרים, מספר האיברים זמין אינו עונה לצרכים קליניים. בשל שכיחות מוגברת של מחלת כבד, חולים רבים עם מחלות כבד סופנית תמותי לרשימת הממתינים להשתלה לפני איברים הופכת לזמינה. כדי לענות על הביקוש תורם כבד שתלי ענק, גישות חלופיות באמצעות רקמת הכבד עקרונות הנדסיים מתבצעת באופן פעיל רדף2. בימינו, פיתח טכניקה ביולוגי להנדסה הכבד יכול פוטנציאל להתגבר על המחסור הזה.
הנדסה הכבד מורכבת משני שלבים: הדור של לגרדום acellular, ואחריו איכלוס של לגרדום. כדי להשיג לפיגום הביולוגי הכבד acellular, הכבד explanted הוא perfused דרך מערכת כלי הדם עם דטרגנטים יוניים או nonionic, אשר ניתן להסיר את החומר הסלולר מן הכבד. במחקרים קודמים רוב, לפיגום הביולוגי הכבד acellular הושגה על ידי זלוף של הכבד, עם שילוב של נתרן גופרתי dodecyl ו- TritonX100. כתוצאה מכך, כל התאים הוסרו, ואילו המבנה של מטריצות נשמר. פיגומים איברים היו reseeded עם התאים בוגרים, hepatocellular, כמו גם קווי תא אנדותל hepatocytes ראשי עם או בלי היישום בו זמנית של תאי אנדותל או גזע mesenchymal (MSC). רוב החוקרים להתמקד, שמחוץ לכבד הנדסה3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. עם זאת, במחקרים קודמים רוב, רק חתיכות קטנות של קוביות לגרדום הנידונה היו מושתלים לתוך ההשתלה הטרוטופי שונים. במחקרים אחדים, חלקי פיגומים הנידונה היו מושתלים כמו שתל עזר. אולם, הפעם מקסימלי הישרדות המדווחת היה 72 h רק8,בת14. עד כמה שידוע לנו, השתלת orthotopic של השתלה כבד מלא הנידונה טרם שבוצעה שבוצעה או שהתפרסמו על. תפקוד לטווח ארוך ואת השתלת איברים מהונדסים הם בחיתוליהם. לכן, נדרשת גישה חלופית שמחוץ לכבד הנדסה.
הנדסה in vivo הכבד עשוי לייצג חלופה ללמוד איכלוס הכבד בתנאים פיזיולוגיים. היתרונות של ויוו הכבד הנדסה בהשוואה ל- ex-vivo הכבד הנדסה הן מגוונות. אין ויוו אוכלס מחדש חלקי הכבד לגרדום נענשים פיזיולוגיים הדם זלוף עם טמפרטורה נכונה, מספיק חמצן, חומרים מזינים, גורמי גדילה בניגוד שמחוץ זלוף בינונית תרבות מלאכותיים. יתר על כן, הכבד נורמלי חלקיים שנותרו שומרת על הפונקציה הכבד, בעיקר ומאפשר ההישרדות לטווח ארוך. מאז מושתל שמחוץ מהונדסים הכבד שתל הוא עדיין מסוגל לקיים את ההישרדות לטווח ארוך של חיות ניסוי על ידי תפקוד הכבד8, נוכל לדמות את ויוו חלקי הכבד engineeringwould בסופו של דבר להיות מודל מבטיח ללמוד עוד יותר על האבולוציה של הנדסה כבדים עם תצפיות הישרדות ארוך יותר מאשר ex-vivo.
לאחרונה, קבוצת מחקר אחת (פאן ועמיתיו) הציג, בפעם הראשונה, טכניקה של ויוו הכבד הנדסה15. הם השיגו את זלוף מבודד של האונה הכבד נכון נחות בחולדות חיים למרות האתגרים אנטומיים וטכניים. הם דיווחו תוצאות פוסט ניתוחית הראשון ויוו איכלוס באמצעות קו תא hepatocyte הראשית עכברוש. עם זאת, הדגם זלוף כירורגי ויוו של פן. et al. יש חסרונות. הם השיגו יחיד בכבד באונה זלוף בחולדות על חשבון חוסמת לחלוטין את וריד שער הכבד ואת הכלילי, דבר העלול לגרום נזק חמור לחיה. העכברושים ניסיוני הוקרבו אחרי רק 6 שעות של זמן התבוננות פוסט ניתוחית. לכן, הטכניקה זלוף בכבד באונה ויוו דורשת עוד שיפור להשגת הישרדות לאחר הניתוח.
פיתחנו מודל הישרדות הרומן ויוו בכבד באונה זלוף, בהתבסס על מחקרים קודמים של האנטומיה הכבד של עכברוש16, הטכניקה תעלות וריד שער הכבד לניטור והמודינמיקה עכברים17, ואת הכבד בביו-הנדסה 18 , 19. השלבים המפתח לקבלת ההליך מומחשים איור 1A - 1E.
טכניקה זו מתאימה עבור אלה שרוצים להשתמש המודל זלוף ניסיוני ויוו למחקר בסיסי על טיפול חלקי איברים על ידי אינפוזיה עם סמים, אין ויוו decellularization כמו כריתה כימי למחלות איברים (למשל , סרטן הכבד), ויוו תרבית תאים במטריצה decellularized השוואת שמחוץ דו מימדי ותלת ממדית תא תרבות מערכות20,21,22,23 , 24 , 25 , 26, ויוו הכבד הנדסה על-ידי decellularization ולאחר איכלוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הדיור בכל ההליכים שבוצעו היו על פי תחיקת בטחון גרמני רווחת בעלי חיים. כל גזה כיסוי בגדים, כלי ניתוח הן בלוק מוכן לפני הניתוח. כל הפרוצדורות מתבצעות בתנאים סטריליים.
1. הכנה של העכברוש הליך כירורגי
- הכנס את החולדה תא אינדוקציה, עזים ומתנגד העכברוש עם 4% מתאדה איזופלוריין ו 100% חמצן בחצי ליטר/דקה בערך 3 דקות, עד העכברוש הוא מורדם לחלוטין.
- להוציא את החולדה התא אינדוקציה ולמדוד את משקל הגוף שלו.
- לגלח את הפרווה של האזור הכירורגי על הבטן.
- מקום מאחור בעלי חיים אל החדר איזופלוריין למשך 2 דקות נוספות להעמיק הרדמה.
- מקם את החולדה על השולחן מבצע במצב פרקדן.
- לתקן את המסכה הרדמה לאזור הפה של העכברוש ולשמור את החיה מרדימים עם זרם הגז רציף של 2% מתאדה איזופלוריין ו 100% חמצן בספיקה של חצי ליטר/דקה.
- לתקן את הגפיים עם חתיכות של הקלטת.
- הוטרינר משחה למרוח את שתי העיניים למניעת יובש.
- לנהל הבופרנורפין 0.05 מ"ג/ק"ג. subcutaneously, כדי להקל על כאב במהלך תקופת המבצע.
- לחטא את השדה הכירורגי של הבטן עם 3 סיבובים של תמיסת יוד ואחריו 2 סיבובים של אלכוהול 70%.
- המקום מעוקר גזה באזור שבו החתך ייעשה רק להשאיר בשטח הפעולה של הבטן חשופה.
- המשך לבצע את הפעולה, כאשר רפלקס הנסיגה הבוהן-קמצוץ של העכברוש הוא נעדר.
2. פתיחת בטן של העכברוש
- עושים רוחבי בטן העור והשריר חתך באמצעות מספריים של coagulator חשמל.
- לתקן ולמשוך הסרעפת לכיוון הראש באמצעות בתפר פוליפרופילן 4-0.
הערה: לב להרים הסרעפת אנכית כדי לחשוף יותר את הכבד, אבל בזהירות כדי להימנע בהגבלות חמורות בדרכי הנשימה, מחנק. - פתח חלל הצפק על ידי משיכת בשני הצדדים של דפנות הבטן לכיוון הראש עם שני ווים subcostal לחשוף את הכבד.
- מכסים את התריסריון והמעי הדק בחלל הבטן עם גזה בטעימת כדי למנוע ייבוש.
- הרם החציוני ישר ושמאלה אונות באמצעות גזה בטעימת והחזיקו אותם נגד בית החזה כדי לחשוף יותר hilum של הכבד.
- מקם את החולדה תחת stereomicroscope (8 X הגדלה).
- ירידה קצת מלוחים חמים לתוך. חלל הבטן, על גבי המשטח של הכבד, המעיים כל כמה דקות, כדי למנוע התייבשות במהלך כל התהליך.
3. הקמת המעבר העוקף בתוך האונה השמאלית לרוחב
- לנתח את וריד שער הכבד השמאלי, מאתרים ומפסיקים את זה 6-0 בתפר משי בבסיס (איור 2 א).
- לחסום עורק הכבד השמאלי, המרה השמאלי לצד השמאלי החציוני וריד שער הכבד, עורק הכבד החציוני שמאל ו המרה החציוני השמאלי עם תופסנים מיקרו כדי למנוע זרימה של perfusate האונה השמאלית החציוני (איור 2B).
- הפרד בין האונה השמאלית לרוחב שתורידו הרצועות שמסביב של האונה במספריים מיקרו.
- לחסום את וריד הכבד השמאלי לרוחב על ידי מחבר חובק למעקה בבסיס האונה השמאלית לרוחב עם תופסנים מיקרו (איור 2C).
הערה: הקפד לא תהדק את וריד שער שמאל גם בטעות. - שימוש מלחציים נגד יתושים כדי להחזיק את הקשירה של וריד שער הכבד השמאלי ולשמור את הווריד עם מתח תקין בשביל תעלות מאוחר יותר.
- בזהירות לעשות חתך בדופן וריד שער הכבד השמאלי הקדמי על ידי ניקוב זה עם קטטר מחט-דיור 24-G ( איור 3 א).
הערה: כדי ליצור מעקף, נקודות גישה לכלי הדם על וריד שער הכבד השמאלי, את וריד הכבד השמאלי נחוצים. בשלב זה, זה הוא העדיף ליצור את הגישה לכלי הדם על ידי ניקב את כלי עם מחט במקום לבצע חתך גדול יותר באמצעות מספריים. זה מפחית את הסיכון של דימום, ומאוחר יותר היצרות. - לסגת הקטטר ולקחת את המחט החוצה הצנתר להשיג קטטר ללא מחט 24-G.
- להתחבר הקטטר צינור זלוף, של המחבר נקודת הקצה האחרת כדי מזרק מ 20-ל 15 מ של 40 U/mL heparinized מלוחים על משאבה זלוף.
- להפעיל את המשאבה עבור פרפוזיה הצינור לגרש את האוויר החוצה מן הצינור הקטטר ללא מחט.
- כבה את המשאבה זלוף.
- שוב, להוסיף את הצנתר ללא מחט לתוך וריד שער הכבד השמאלי דרך החתך מנוקבת הווריד (איור 3B).
הערה: בשל העובדה שיש מקום מוגבל מאוד לתיקון הקטטר, לא תתוקן בשלב זה. לכן, המנתח צריך להשתמש טיפול כדי למנוע העקירה של הקטטר cannulated. - בזהירות לבצע חיתוך נוסף על השוליים של האזור החשוף של וריד הכבד הלטראלי השמאלי באמצעות ניקוב זה עם קטטר מחט-דיור 22 או 24-G (איור 3C).
הערה: מומלץ כי הצנתר יהיה מעט קטנה יותר כלי הקיבול. - לסגת הקטטר ולקחת את המחט החוצה הצנתר להשיג קטטר ללא מחט 22-G.
- להפעיל המשאבה זלוף כדי perfuse heparinized מלוחים לתוך האונה השמאלית לרוחב דרך 24-G cannulated ללא מחט הקטטר של וריד שער הכבד השמאלי בספיקה של 0.5 mL/min.
- השתמש יבשה גאזה לספוג יותר זורם נוזל פסולת בשטח החתך וריד הכבד הלטראלי השמאלי.
- נקרר את וריד הכבד הלטראלי השמאלי דרך החתך מנוקבת של הווריד עם 22-G ללא מחט הצנתר, כדי ליצור שקע נוזלים כדי לצמצם זיהום אינטרה-בטן (דמות תלת-ממד).
הערה: קשה מבחינה טכנית לתקן את הצנתר cannulated עד האונה בכבד. לכן, המנתח צריך לשים לב כדי למנוע תזוזה של הקטטר. לחלופין, ללא תעלות של וריד הכבד הלטראלי השמאלי עם קטטר, נוזל פסולת יכול גם להיקלט בבית אזור החתך הווריד רק עם גזה יבשה. - לשמור על פרפוזיה האונה השמאלית לרוחב עם מלוחים heparinized בסביבות 20 דקות (קבוצה 1) ולאחר מכן רק עם תמיסת מלח 2 h, 3 h או 4 h (קבוצה 2, קבוצה 3, והקבוצה 4, בהתאמה).
- כבה את המשאבה כדי לעצור את זלוף.
4. פיזיולוגית פגיעה Reperfusion של האונה השמאלית לרוחב
- תוריד את שניהם קטטרים וריד שער הכבד השמאלי, את וריד הכבד הלטראלי השמאלי
- סגור את החתך של וריד שער הכבד השמאלי בתפר פוליאמיד 11-0.
- סגור את החתך של וריד הכבד הלטראלי השמאלי 11-0 בתפר פוליאמיד גם כן.
- Unclamp את וריד הכבד הלטראלי השמאלי.
- Unclamp את וריד שער החציוני שמאל שמאל צינור המרה, עורק הכבד השמאלי.
- חתוך את הקשירה על וריד שער הכבד השמאלי כדי לפתוח מחדש את הווריד.
5. סגירת לקיר הבטן
- לסגור את שכבת השריר לקיר הבטן על ידי תפירת קטעה בתפר שנספג polyglactin 910 4-0.
- לסגור את שכבת העור של קיר הבטן על ידי תפירת קטעה בתפר שנספג polydioxanone 4-0.
- לאחר סגירת בבטן, לחטא את החתך בעור עם אלכוהול 70%.
6. לאחר הניתוח טיפול של העכברוש
- במקום החיה על כרית חימום עבור החייאה במשך כ 10 דקות, אז את זה לתוך כלוב חדש.
- לנהל הבופרנורפין 0.05 מ"ג/ק"ג של subcutaneously 2 x יום d 3 ברציפות במשככי לשחרר את הכאב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
12 זכר (בגילאי 12 - 13 שבועות) לואיס חולדות שימשו להערכת השפעת האונה הכבד סלקטיבי זלוף. הניסוי בוצע בארבע קבוצות (n = 3 חולדות לכל קבוצה). משתמש זלוף שונים בתקופות של 20 דקות, שעתיים, 3 שעות, 4 שעות, השלבים המתוארים לעיל, בהצלחה שהשגנו ויוו באונה אחת זלוף.
אין ויוו זלוף של האונה השמאלית לרוחב:
זיהוי אנטומי מדויק של וריד שער הכבד השמאלי, את וריד הכבד הלטראלי השמאלי ואת מוצלח וריד שער שמאל שמאל תעלות לרוחב וריד הכבד יכול להיות אישרו לאחר זלוף עם heparinized מלוחים. מחוון הראשונה של זיהוי מוצלח וכן תעלות היה התצפית כי דם עם perfusate היה זורם האונה השמאלית לרוחב דרך שקע נוזלים (איור 4A). המודל המוצלח זלוף כירורגי אושר עוד יותר על ידי התבוננות השינוי של הצבע של האונה הלטראלי השמאלי לאחר זלוף עם heparinized מלוחים. הצבע של האונה השמאלית לרוחב משתנה מאדום בהיר לצהוב עמום, המציין את ההסרה של דם מן האונה השמאלית לרוחב. כדי לוודא קיום זלוף פיזיולוגיים של האונות הנותרים, הצבע של האונות הכבד הנותרים נצפתה כל הזמן במהלך זלוף של האונה השמאלית לרוחב. זלוף הנכון של האונה השמאלית לרוחב הביא האונה מסובבים צהוב להתעלף בזמן האונות הכבד הנותרים מתוחזק שלהם צבע אדום בהיר לאורך כל התהליך כולו (איור 4B).
פגיעה Reperfusion פיזיולוגיים של האונה השמאלית לרוחב:
כדי להעריך את patency של כלי cannulated לאחר סגירת החתכים של כלי ופתיחה כלי, שינוי הצבע של האונה השמאלית הלטראלי נצפתה. כמה נקודות אדומות הופיע על פני השטח של perfused חלש צהוב השמאלי לרוחב האונה לאחר פתיחה מחדש של שמאל לרוחב וריד הכבד, המציין זלוף רטרוגרדית הראשונית באונה הלטראלי השמאלי (איור 5A). פני השטח של האונה יישוב מאוחר יותר הראה עוד יותר כתמים אדומים לאחר משחררת את התפסים מיקרו של עורק הכבד השמאלי, עזב את צינור המרה, והשאיר החציוני וריד שער הכבד, רומז נוסף זלוף פיזיולוגיים של האונה השמאלית לרוחב דרך את נפתח מחדש כלי (איור 5B). פני השטח של האונה הכבד יישוב הפך אדום כהה לאחר פתיחה מחדש של שמאל וריד שער הכבד, המאשר כי האונה הכבד יישוב חזרה שלה זלוף פיזיולוגיים מלא דרך וריד שער שמאל (איור 5C).
היסטולוגיה של האונה Perfused הלטראלי השמאלי:
לאחר גמר heparinized מלוחים או מלוחים זלוף, האונה באופן סלקטיבי perfused הלטראלי השמאלי (כמו ניסיוני) ו באונה המזונבת נחות רגילה (כמו פקד) היו resected קבועה עם פורמלין ואת נתון אז בדיקה היסטולוגית (H & Estaining). . באונה השמאלית לרוחב, ישנם אין תאי דם ברור לעין בענף של וריד שער הכבד, sinusoids, וריד מרכזי. כצפוי, תאי דם אדומים היו גלויות בענף של עורק הכבד (איור 6A ו ג 6). ב נורמלי נחות באונה המזונבת (כמו שליטה), תאי דם נצפו באופן משמעותי בענף של וריד שער הכבד, את sinusoids את הווריד המרכזי (איור 6B וד' 6).
שיעור הישרדות:
12 מתוך 12 חולדות הניסוי הביא שיעור הישרדות 1-שבוע של 100%. עם זאת, חולדות הניסוי 3 אשר עברו 4 שעות זלוף סבלה באופן זמני של שלשול ובספיקה הדמים העיניים ביום השני או השלישי במשככי.
איור 1 : בסכמה ניתוח אין ויוו יחיד בכבד באונה זלוף דגם- (א) זהו שרטוט ציור של האנטומיה עכברוש בכבד. (B) לוח זה מראה את החסימה של וריד שער הכבד השמאלי, עורק הכבד השמאלי, המרה שמאלה, שמאלה החציוני וריד שער הכבד של וריד הכבד הלטראלי השמאלי. (ג) לוח זה מראה את תעלות של וריד שער הכבד השמאלי, את וריד הכבד הלטראלי השמאלי עם קטטר ועבור כניסת נוזלים עודפים. (ד) לוח זה מראה את זלוף של האונה השמאלית לרוחב עם heparinized מלוחים על ידי משאבה זלוף. (E) לוח זה מראה את פגיעה reperfusion פיזיולוגיים של האונה השמאלית לרוחב לאחר פתיחה מחדש את כלי-הדם החסומים על האונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : פוסט תמונות מציג את החסימה של כלי ויישם וניקוז לרוחב האונה השמאלית. (א) לוח זה מראה את מצדו של וריד שער הכבד השמאלי. (B) לוח זה מציג החסימה של עורק הכבד השמאלי המרה השמאלי, עורק וריד שער הכבד השמאלי חציון/ולשננו/המרה עם תופסנים מיקרו. (ג) לוח זה מציג חסימת וריד הכבד הלטראלי השמאלי עם תופסנים מיקרו (חץ לבן). פסי בקנה מידה הם 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : פוסט תמונות מציג את זרימת הדם מעקפים דרך האונה השמאלית לרוחב. (A) לוח זה מראה את החתך בווריד השער השמאלי (חץ לבן) על ידי ניקוב זה עם קטטר מחט-דיור 24-G. (B) לוח זה מראה את תעלות של וריד שער הכבד השמאלי עבור כניסת נוזלים עם 24-G ללא מחט קטטר (חץ לבן). (ג) לוח זה מציג את החתך השמאלי וריד הכבד לרוחב (חץ לבן) על ידי ניקוב זה עם קטטר מחט-דיור 22-G. (ד) לוח זה מראה את תעלות של וריד הכבד הלטראלי השמאלי בשביל פורקן נוזלים עם 22-G ללא מחט קטטר (חץ לבן). פסי בקנה מידה הם 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : פוסט תמונות מציג זלוף של האונה השמאלית לרוחב. (א) לוח זה מראה perfusate זורם לתוך האונה השמאלית לרוחב דרך הים (קטטר צהוב), זורם האונה השמאלית לרוחב דרך השקע (קטטר כחול). האונה הלטראלי השמאלי היה, אכן, באופן סלקטיבי perfused, כפי שמוצג על-ידי שינוי צבע של האונה (חץ לבן). (B) הערה שינוי הצבע של האונות שמאל לרוחב האונה לצהוב עמום לאחר זלוף עם heparinized מלוחים, בעוד שאר הכבד נשארים אדום בהיר (החצים הלבנים). פסי בקנה מידה הם 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : פגיעה reperfusion פיזיולוגיים של האונה השמאלית לרוחב. (א) לוח זה מראה את זלוף רטרוגרדית של האונה השמאלית לרוחב לאחר פתיחה מחדש של שמאל וריד הכבד לרוחב (חץ לבן). (B) לוח זה מראה את פגיעה reperfusion פיזיולוגיים של השמאל לרוחב האונה (חץ לבן) לאחר שחרור המיקרו מלחציים על שמאל החציוני וריד שער הכבד, עורק הכבד השמאלי. (ג) לוח זה מראה את פגיעה reperfusion מלאה של האונה השמאלית לרוחב (חץ אדום) לאחר פתיחה מחדש של וריד שער הכבד השמאלי ו של איסכמיה של האונה השמאלית החציוני (חץ כחול). פסי בקנה מידה הם 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : הערכות היסטולוגית (צביעת המטוקסילין). (A ו- C) הלוחות הללו להראות הערכה היסטולוגית של הפארין-תמיסת מלח-perfused שמאל לרוחב האונה (lobe ניסיוני) הוכחת העדר של כדוריות הדם (A) וריד שער הכבד, sinusoids. (ג) הווריד המרכזי. (A) לעומת זאת, תאי דם אדומים גלויים בעורק הכבד (חץ שחור) כצפוי. (B ו- D) הלוחות הללו להראות הערכה היסטולוגית של נורמלי נחות באונה המזונבת (בקרה) גילוי הנוכחות של תאי דם במבנים כל כלי הדם: וריד שער הכבד, עורק הכבד sinusoids (חיצים שחורים), ו (B) וריד מרכזי (D) (חץ שחור). פסי בקנה מידה הם 250 מיקרומטר.
| פרמטרים | תוצאות | |
| קבוצת המחקר | פאן ואח 2016 [15] | קבוצה משלי |
| ב- vivo | כן | כן |
| היעד בכבד באונה | האונה נחות.
|
האונה השמאלית לרוחב
|
| חסימה של הווריד הנבוב, וריד שער ראשי | כן
|
לא
|
| איסכמיה של האונות הנותרים | כן | נשארו רק באונה חציון |
| תעלות של הווריד הנבוב | כן | לא |
| תעלות של וריד שער ראשי | כן | לא |
| פורטל יתר לחץ דם | כן | לא |
| שיעור הישרדות 1 שבוע | . הקרבת intraoperatively | 100% |
טבלה 1- השוואה בין דגמים שונים של אין ויוו הנדסה הכבד. השולחן הזה מדגים הבדלים קריטיים במתקנים דגם שני בין הפאן. et al. 15 , קבוצת המחקר שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על-ידי חסימת cannulating וריד שער הכבד השמאלי עם קטטר כמו כניסת נוזלים, את וריד הכבד הלטראלי השמאלי עם עוד קטטר כמו פורקן נוזלים, בהצלחה יצרנו ויוו נוזלים מעקף בתוך האונה השמאלית לרוחב, המציין למרות השיטה הוא מאוד מאתגר בשל גודלו הקטן של כלי עבור תעלות סיכון גבוה של גרימת דימום, זה ריאלי. אפילו לעכברושים עוברת תקופה ארוכה זלוף של 4 שעות שרדו לפחות שבוע אחד, מציג החולדות שאוכל. לסבול הליך כירורגי.
בסעיף הבא, אנו מתארים את שלושת הצעדים טכנית קשה ביותר הקריטיים וכיצד לשלוט בהם בהצלחה. ראשית, בתהליך ההפרדה מצדו של שמאל וריד שער הכבד, בשל הקשר ההדוק המרחבי של יישוב וריד שער הכבד עם הכבד parenchyma שמסביב, בידוד של כלי השיט יש סיכון גבוה של גרימת דימום. אנו ממליצים להשתמש מלקחיים מיקרו במקום במספריים כדי להפריד את השמאלי וריד שער הכבד, על ידי בקפידה קורע מחוברים avascular רקמות המקיפים את וריד שער הכבד השמאלי. שנית, מבחינת החתך על הקיר הקדמי של וריד שער הכבד השמאלי, חתך ענקיות על הקיר הקדמי של וריד שער הכבד השמאלי עשוי להגביר את הקושי של תיקון החתך ואת הסיכוי גורמת היצרות לאחר ההשקה כלי הדם. אנו ממליצים להשתמש צנתר מחט-המגורים במקום מספריים עבור ביצוע חתך בגודל תקין. שלישית, לגבי חסימת וריד הכבד הלטראלי השמאלי, אם האזור החשוף של וריד הכבד הלטראלי השמאלי נחסם באופן לא תקין, לא יהיו חשופים מספיק שטח פנוי וריד הכבד הלטראלי השמאלי על תעלות מאוחר יותר. אנו ממליצים שלבצע את חסימת העורקים צריכה להתבצע קרוב החציוני האונה השמאלית, ולא באמצע האזור החשוף של וריד הכבד הלטראלי השמאלי...
אנו משווים את שני מודלים של סלקטיבי ויוו הכבד זלוף בין הפאן. et al. 15 ושלנו (טבלה 1). ראשית, הבחירה של האונה הכבד יישוב נחשב שלב קריטי ביותר להקמת הדגם. אנחנו נבחר של האונה מבודד למדי, לרוחב האונה השמאלית, האונה יישוב של ויוו זלוף כירורגי דגם הממסד. לעומת זאת, קבוצת המחקר של פאן נבחרת האונה נחות נכון עבור דגם14. חסרונות של בחירת האונה נחות נכון הם כ שמקיפים: ראשית, הם נאלצו להתפשר על ידי חסימת לחלוטין, cannulating את הווריד הנבוב בשביל פורקן נוזלים, אשר עלול להשפיע לרעה על מחזור הדם של החיה. שנית, הם היו צריכים לחסום, נקרר את וריד שער הכבד העיקרי עבור כניסת, מה שגרם איסכמיה של הנותרים אונות הכבד, וכן פורטל יתר לחץ דם. לעומת האונה כמטרה, לרוחב האונה השמאלית, אנחנו חסומים, לצינוריות וריד הכבד הלטראלי השמאלי במקום הווריד הנבוב בשביל פורקן נוזלים. אנחנו שנוצר עם כניסת נוזלים על-ידי בחירת השמאלי וריד שער הכבד, אשר בעלת קוטר גדול למדי, הקלת לנתיחה, חסימה, תעלות. לכן, ישירות חוסם את זרימת הדם את הווריד הנבוב, וריד שער הכבד העיקרי הוא נמנע במודל המובאים כאן, שהוא קריטי להישרדותה של החולדה.
למרות הפוטנציאל הגדול עבור ויוו בכבד באונה זלוף, טכניקה זו יש מספר מגבלות. ראשית, איסכמיה של האונה השמאלית המדיאלי הוא בלתי נמנע, עקב החסימה של שמאל החציוני וריד שער הכבד בתהליך. שנית, בהתבסס על הסתימה הזמנית בבסיס האונה השמאלית לרוחב באמצעות מלחציים מיקרו, זה עשוי להוביל לנזק של parenchyma הכבד סביב בסיס אוני ולגרום באופן בלתי נמנע של דליפה קלה במהלך זלוף עם heparinized מלוחים. שלושה עכברים ניסיוני אשר נחשפו תקופה זלוף של 4 שעות באופן זמני סבלה שלשול והפטר הדמים עינית, רומז שאולי 4 שעות תקופת זלוף המרבי של עכברוש ללא סבל יותר סיבוכים. לידע שלנו, לפחות 3 שעות נדרש decellularization הכבד כל עכברוש שמחוץ18. לכן, 4 שעות של זמן זלוף שלנו נועד להשיג יהיה מספיק עבור נוספת בכבד באונה decellularization, אשר הוא תנאי מוקדם הנדסי כבד על ידי תא איכלוס של לפיגום בכבד.
בעתיד, טכניקה זו חדשניים עבור מודל זלוף ויוו עשוי פוטנציאל לשמש במחקר ניסיוני לטיפול חלקי איברים על ידי אינפוזיה עם תרופות, בויוו decellularization חלקי איברים כמו כריתה כימיים, כמו " אין ויוו תא מערכת תרבות ", וההנדסה, ואולי הכי חשוב, עבור ויוו חלקי איברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות Jens Geiling מן המכון של האנטומיה הראשון, בית החולים האוניברסיטאי יינה, להפקת הציורים סכמטי של עכברוש הכבד אנטומיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon |
References
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
