Summary
हम भविष्य में vivo आंशिक जिगर इंजीनियरिंग में आगे की पढ़ाई के लिए एक शर्त के रूप में vivo में एक जिगर पालि छिड़काव मॉडल में एक के लिए एक उपंयास सर्जिकल तकनीक की स्थापना ।
Abstract
अंग इंजीनियरिंग संभवतः प्रत्यारोपण में इस्तेमाल किया जा सकता है कि जिगर अंग विकल्प उत्पन्न करने के लिए एक उपंयास रणनीति है । हाल ही में, vivo में शामिल है जिगर इंजीनियरिंग, vivo अंग decellularization में जनसंख्या के बाद सहित, पूर्व vivo जिगर इंजीनियरिंग पर एक होनहार दृष्टिकोण के रूप में उभरा है । हालांकि, पश्चात अस्तित्व प्राप्त नहीं किया गया । इस अध्ययन का उद्देश्य vivo में चुनिंदा जिगर पालि छिड़काव में vivo जिगर इंजीनियरिंग के लिए एक शर्त के रूप में चूहों में के एक उपंयास शल्य चिकित्सा तकनीक विकसित करना है । हम केवल बाएँ पार्श्व पालि के माध्यम से एक सर्किट बाईपास उत्पन्न करते हैं । फिर, वाम पार्श्व पालि heparinized खारा के साथ perfused है । प्रयोग 4 समूहों के साथ किया जाता है (n = प्रति समूह 3 चूहों) 20 मिनट, 2 एच, 3 एच, और 4 एच के विभिंन छिड़काव बार के आधार पर अस्तित्व, साथ ही रंग की macroscopically दिखाई परिवर्तन और histologically में रक्त कोशिकाओं के अभाव निर्धारित पोर्टल त्रय और sinusoids, एक सफल मॉडल स्थापना के लिए एक संकेतक के रूप में लिया जाता है । वाम पार्श्व पालि के चयनात्मक छिड़काव के बाद, हम मानते है कि वाम पार्श्व पालि, वास्तव में, लाल से पीला बेहोश हो गया । एक ऊतकवैज्ञानिक आकलन में, कोई रक्त कोशिकाओं पोर्टल नस की शाखा में दिखाई देते हैं, केंद्रीय नस, और sinusoids । वाम पार्श्व पालि अवरुद्ध जहाजों को फिर से खोलने के बाद लाल हो जाता है । 12/12 चूहों से अधिक एक सप्ताह के लिए प्रक्रिया बच । हम vivo एकल जिगर पालि छिड़काव में एक सप्ताह से अधिक की एक लंबी उत्तरजीविता अवधि के साथ के लिए एक शल्य मॉडल की रिपोर्ट करने के लिए पहली बार कर रहे हैं । पहले प्रकाशित रिपोर्ट के विपरीत, इस तकनीक का सबसे महत्वपूर्ण लाभ यहां प्रस्तुत किया है कि जिगर की ७०% की छिड़काव पूरी प्रक्रिया में बनाए रखा है । इस तकनीक की स्थापना में vivo आंशिक जिगर इंजीनियरिंग में decellularization और recellularization सहित चूहों, के लिए एक नींव प्रदान करता है ।
Introduction
अंग प्रत्यारोपण के लिए संकेत लगातार विस्तार कर रहे हैं । इसके विपरीत, अंग दान दरों और अंगों की समग्र गुणवत्ता में गिरावट आ रही है, भ्रष्टाचार के लिए एक बढ़ती मांग के लिए अग्रणी । जिगर प्रत्यारोपण प्रतीक्षा सूची में शामिल उंमीदवारों की संख्या में वृद्धि जारी (जैसे, संयुक्त राज्य अमेरिका में, ११,३४० रोगियों २०१६ में जोड़ा गया, २०१५ में १०,६३६ के साथ तुलना में)1। पर्याप्त प्रयासों के बावजूद उपलब्ध अंगों की संख्या नैदानिक जरूरतों को पूरा नहीं करती. जिगर की बीमारी की वृद्धि की घटनाओं के कारण, अंत चरण जिगर रोगों के साथ कई रोगियों प्रत्यारोपण प्रतीक्षा सूची पर मरने से पहले एक दाता अंग उपलब्ध हो जाता है । दाता जिगर भ्रष्टाचार के लिए भारी मांग को पूरा करने के लिए, वैकल्पिक जिगर ऊतक इंजीनियरिंग सिद्धांतों का उपयोग कर दृष्टिकोण सक्रिय रूप से2का पीछा किया जा रहा है । आजकल, जिगर इंजीनियरिंग के एक नए विकसित जैविक तकनीक संभवतः इस कमी को दूर कर सकता है ।
जिगर इंजीनियरिंग दो कदम होते हैं: एक acellular पाड़ की पीढ़ी, पाड़ के एक जनसंख्या के बाद । एक जैविक acellular जिगर पाड़ प्राप्त करने के लिए, explanted जिगर ईओण या ईओण डिटर्जेंट, जो जिगर से सेलुलर सामग्री को दूर कर सकते है के साथ संवहनी प्रणाली के माध्यम से perfused है । सबसे पिछले अध्ययनों में, एक जैविक acellular जिगर पाड़ सोडियम dodecyl सल्फेट और TritonX100 के संयोजन के साथ जिगर की छिड़काव द्वारा हासिल किया गया था । नतीजतन, सभी कोशिकाओं को हटा दिया गया है, जबकि extracellular मैट्रिक्स की संरचना बनाए रखा गया था । अंग पाड़ों परिपक्व कोशिकाओं, hepatocellular, साथ ही साथ endothelial सेल लाइनों, और प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के साथ या बिना endothelial कोशिकाओं या mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) के एक साथ आवेदन के साथ फिर से बीज थे । सबसे शोधकर्ताओं ने पूर्व vivo जिगर इंजीनियरिंग पर ध्यान केंद्रित3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. हालांकि, सबसे पिछले अध्ययन में, repopulateded पाड़ cubes के केवल छोटे टुकड़े अलग heterotopic आरोपण साइटों में प्रत्यारोपित किया गया । कुछ अध्ययनों में आंशिक आबाद पाड़ों एक सहायक भ्रष्टाचार के रूप में प्रत्यारोपण किया गया । हालांकि, अधिकतम रिपोर्ट जीवित रहने का समय केवल ७२ ज8,14था । जहां तक हम जानते हैं, एक repopulateded पूर्ण जिगर भ्रष्टाचार के orthotopic ट्रांसप्लांटेशन अभी तक प्रदर्शन या के बारे में प्रकाशित नहीं किया गया है । लंबी अवधि के समारोह और इंजीनियर अंगों के प्रत्यारोपण उनके शैशव में अब भी कर रहे हैं । इसलिए, पूर्व vivo जिगर इंजीनियरिंग के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण की जरूरत है ।
vivo जिगर इंजीनियरिंग में शारीरिक स्थितियों के तहत यकृत पुनर्जनसंख्या का अध्ययन करने के लिए एक विकल्प का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । vivo लीवर इंजीनियरिंग की तुलना में विवो लिवर इंजीनियरिंग के फायदों को कई गुना कर रहे हैं । में vivo repopulateded आंशिक जिगर पाड़ उचित तापमान के साथ शारीरिक रक्त छिड़काव के अधीन है, पर्याप्त ऑक्सीजन, पोषक तत्वों, और कृत्रिम संस्कृति माध्यम के साथ पूर्व vivo छिड़काव के विपरीत वृद्धि कारकों. इसके अलावा, शेष आंशिक सामांय जिगर यकृत समारोह का कहना है, मुख्य रूप से दीर्घकालिक अस्तित्व की अनुमति । के बाद से एक प्रत्यारोपित पूर्व vivo इंजीनियर जिगर भ्रष्टाचार अभी भी अपने जिगर8समारोह द्वारा प्रयोगात्मक पशुओं के दीर्घकालिक अस्तित्व को बनाए रखने में असमर्थ है, हम कल्पना है कि vivo आंशिक जिगर engineeringwould में अंततः एक हो मॉडल का वादा आगे पूर्व vivoसे अब अस्तित्व टिप्पणियों के साथ इंजीनियर जिगर के विकास का अध्ययन करने के लिए ।
हाल ही में, एक अनुसंधान समूह (पैन और सहयोगियों) प्रस्तुत किया, पहली बार के लिए, vivo जिगर इंजीनियरिंग15 में की एक तकनीक । उन्होंने शारीरिक और तकनीकी चुनौतियों के बावजूद चूहों के रहने में सम्यक अवर यकृत पालि के पृथक छिड़काव को हासिल किया. वे vivo पुनर्जनसंख्या में एक चूहे प्राथमिक hepatocyte सेल लाइन का उपयोग कर के पहले intraoperative परिणामों की सूचना दी । हालांकि, इसमें वीवो सर्जिकल छिड़काव मॉडल ऑफ पैन एट अल. नुकसान है । वे पूरी तरह से पोर्टल नस और अवर वेना कावा अवरुद्ध की कीमत पर चूहों में एकल जिगर पालि छिड़काव हासिल की है, जो पशु को गंभीर नुकसान का कारण हो सकता है । प्रायोगिक चूहों intraoperative प्रेक्षण समय के केवल 6 घंटे के बाद बलि दी गई । इसलिए, में vivo जिगर पालि छिड़काव तकनीक पश्चात अस्तित्व प्राप्त करने के लिए और अधिक सुधार की जरूरत है ।
हम vivo जिगर पालि छिड़काव में के लिए एक उपंयास अस्तित्व मॉडल विकसित,16चूहे की यकृत एनाटॉमी के पिछले अध्ययनों के आधार पर, चूहों17में hemodynamic निगरानी के लिए पोर्टल नस cannulation तकनीक, और जिगर की इंजीनियरिंग 18 , 19. प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण कदम चित्र 1a - 1Eमें सचित्र हैं ।
यह तकनीक उन लोगों के लिए उपयुक्त है जो दवाओं के साथ अर्क द्वारा आंशिक अंग उपचार पर बुनियादी शोध के लिए वीवो छिड़काव मॉडल में , vivo decellularization में अंग रोगों के लिए एक रासायनिक लकीर के रूप में उपयोग करना चाहते हैं (उदा. , लीवर कैंसर), vivo सेल संस्कृति में एक सेल् फी मैट्रिक्स की तुलना में पूर्व vivo दो आयामी और तीन आयामी सेल कल्चर सिस्टम20,21,22,23 , 24 , 25 , 26, और decellularization और पुनर्जनसंख्या द्वारा vivo लीवर इंजीनियरिंग में ।
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Protocol
आवास और सभी प्रक्रियाओं को जर्मन पशु कल्याण कानून के अनुसार किया गया । सभी धुंध, कवर कपड़े, और शल्य चिकित्सा उपकरणों autoclaved और आपरेशन से पहले तैयार कर रहे हैं । सभी प्रक्रियाओं बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है ।
1. शल्य प्रक्रिया के लिए चूहे की तैयारी
- एक प्रेरण कक्ष में चूहे प्लेस और 4% भाँप isoflurane और १००% ऑक्सीजन के साथ anesthetize के बारे में 3 मिनट के लिए ०.५ L/मिनट, जब तक चूहा पूरी तरह से anesthetized है ।
- प्रेरण कक्ष से बाहर चूहे ले लो और उसके शरीर के वजन को मापने ।
- पेट पर शल्य क्षेत्र की फर दाढ़ी.
- संज्ञाहरण गहरा करने के लिए एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए isoflurane चैंबर में वापस पशु प्लेस ।
- ऑपरेशन टेबल पर चूहे को लापरवाह पोजीशन में रखें ।
- चूहे के मुंह क्षेत्र को संज्ञाहरण मुखौटा ठीक है और 2% की एक सतत गैस प्रवाह के साथ पशु anesthetized रखने के isoflurane और १००% ऑक्सीजन की एक प्रवाह दर पर ०.५ L/
- टेप के टुकड़ों के साथ अंगों को ठीक करें ।
- दोनों आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू सूखापन को रोकने के लिए ।
- संचालन अवधि के दौरान दर्द को दूर करने के लिए, buprenorphine ०.०५ मिलीग्राम/
- ७०% अल्कोहल के 2 दौर के बाद आयोडीन मिलावट के 3 दौर के साथ पेट के सर्जिकल क्षेत्र को संक्रमित ।
- जहां चीरा ही पेट के ऑपरेशन क्षेत्र उजागर छोड़ दिया जाएगा क्षेत्र के आसपास निष्फल धुंध जगह है ।
- जब चूहे की अंगुली-चुटकी आहरण पलटा अनुपस्थित है तो कार्रवाई करने के लिए आगे बढ़ें ।
2. चूहे की Laparotomy
- कैंची और एक बिजली के coagulator का उपयोग कर एक अनुप्रस्थ उदर त्वचा और मांसपेशी चीरा बनाओ ।
- फिक्स और सिर की ओर असिरूप प्रक्रिया खींच एक 4-0
नोट: बेहतर जिगर को बेनकाब करने के लिए खड़ी असिरूप प्रक्रिया लिफ्ट करने के लिए ध्यान देना है, लेकिन गंभीर श्वसन प्रतिबंध और घुटन से बचने के लिए सावधानी के साथ आगे बढ़ना. - जिगर को बेनकाब करने के लिए दो उपलागतों हुक के साथ सिर की ओर पेट की दीवारों के दोनों किनारों खींच कर पेरिटोनियल गुहा खोलें ।
- ग्रहणी और छोटी आंत एक नम धुंध के साथ उदर गुहा में कवर करने के लिए सुखाने से बचने के ।
- एक गीला धुंध का उपयोग करके और उंहें बेहतर जिगर की hilum को बेनकाब करने के लिए छाती के खिलाफ पकड़ छोड़ दिया और सही औसत पालियों लिफ्ट ।
- एक stereomicroscope के तहत चूहे प्लेस (x इज़ाफ़ा) ।
- पेट में कुछ गर्म खारा ड्रॉप और जिगर की सतह पर और आंतों हर कई मिनट, पूरी प्रक्रिया के दौरान सुखाने को रोकने के लिए.
3. वाम पार्श्व पालि के भीतर एक बाईपास मार्ग की स्थापना
- काटना बाईं ओर पोर्टल नस और ligate यह आधार (चित्रा 2a) में एक 6-0 रेशम सीवन के साथ ।
- वामपंथी यकृत धमनी ब्लॉक, वाम माध्य पोर्टल नस के साथ छोड़ दिया पित्त नलिका, वाम माध्य यकृत धमनी, और बाईं औसत पालि (चित्रा बी) के लिए perfusate के एक प्रवाह को रोकने के लिए सूक्ष्म clamps के साथ वाम माध्य पित्त नलिका
- सूक्ष्म कैंची के साथ पालि के आसपास के बंधनों को काटने से वाम पार्श्व पालि अलग ।
- माइक्रो clamps (चित्रा 2c) के साथ बाएं पार्श्व पालि के आधार पर दबाना द्वारा वाम पार्श्व यकृत नस ब्लॉक ।
नोट: सुनिश्चित करें कि बाईं पोर्टल नस के रूप में अच्छी तरह से गलती से दबाना नहीं है । - संयुक्ताक्षर के बाईं पोर्टल की नस पकड़ और बाद में cannulation के लिए उचित तनाव के साथ नस रखने के लिए मच्छर clamps का प्रयोग करें ।
- ध्यान से यह एक 24 जी सुई निवास कैथेटर ( चित्रा 3ए) के साथ puncturing द्वारा छोड़ दिया पोर्टल नस के सामने की दीवार में एक चीरा कर.
नोट: एक बाईपास बनाने के लिए, बाईं पोर्टल नस और बाईं यकृत नस पर नाड़ी का उपयोग अंक की जरूरत है । इस कदम के लिए, यह एक सुई के साथ जहाजों puncturing द्वारा नाड़ी का उपयोग करने के बजाय एक बड़ा कैंची का उपयोग कर चीरा बनाने के लिए पसंद है. इससे रक्तस्राव और बाद में एक प्रकार का रोग का खतरा कम हो जाता है. - कैथेटर को वापस लेने और एक सुई मुक्त 24 जी कैथेटर प्राप्त करने के लिए कैथेटर से बाहर सुई ले ।
- कैथेटर एक छिड़काव ट्यूब, जिसमें से अन्य समापन बिंदु एक छिड़काव पंप पर ४० यू/एमएल heparinized खारा के 15 मिलीलीटर के साथ एक 20 मिलीलीटर सिरिंज के लिए कनेक्ट करता है करने के लिए कनेक्ट ।
- ट्यूब perfusing ट्यूब और सुई मुक्त कैथेटर से बाहर हवा को निष्कासित करने के लिए पंप पर बारी ।
- छिड़काव पंप बंद कर दें ।
- फिर, नस (चित्र बी) पर पंचर चीरा के माध्यम से बाईं पोर्टल नस में सुई मुक्त कैथेटर डालें ।
नोट: इस तथ्य के कारण कैथेटर फिक्सिंग के लिए बहुत सीमित स्थान है, यह इस बिंदु पर तय नहीं है । इसलिए, सर्जन cannulated कैथेटर के विस्थापन से बचने के लिए देखभाल का उपयोग करना चाहिए । - ध्यान से यह एक 22 या 24 जी सुई-निवास कैथेटर (आंकड़ा 3सी) के साथ puncturing द्वारा वाम पार्श्व यकृत नस के उजागर क्षेत्र के मार्जिन पर एक और चीरा बनाओ ।
नोट: यह कैथेटर पोत से थोड़ा छोटा होने की सिफारिश की है । - कैथेटर को वापस लेने और एक सुई मुक्त 22-जी कैथेटर प्राप्त करने के लिए कैथेटर से बाहर सुई ले ।
- ०.५ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर बाईं पोर्टल नस की 24-जी cannulated सुई मुक्त कैथेटर के माध्यम से वाम पार्श्व पालि में heparinized खारा perfuse करने के लिए छिड़काव पंप पर बारी/
- बाएं पार्श्व यकृत नस के चीरा क्षेत्र के आसपास बह अपशिष्ट द्रव को अवशोषित करने के लिए सूखी धुंध का प्रयोग करें ।
- Cannulate 22-जी सुई मुक्त कैथेटर के साथ नस की पंचर चीरा के माध्यम से वाम पार्श्व यकृत नस, इंट्रा-उदर प्रदूषण (चित्रा 3 डी) को कम करने के लिए एक द्रव आउटलेट उत्पन्न करने के लिए ।
नोट: यह जिगर पालि के लिए cannulated कैथेटर को ठीक करने के लिए तकनीकी रूप से मुश्किल है । इसलिए, सर्जन कैथेटर के विस्थापन से बचने के लिए ध्यान देना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, एक कैथेटर के साथ बाएँ पार्श्व यकृत नस की cannulation के बिना, अपशिष्ट द्रव भी केवल एक सूखी धुंध के साथ नस के चीरा क्षेत्र में अवशोषित किया जा सकता है. - चारों ओर 20 मिनट के लिए heparinized खारा के साथ वाम पार्श्व पालि perfusing रखो (1 समूह) और फिर केवल 2 एच, 3 एच, या 4 एच के लिए खारा के साथ (समूह 2, समूह 3, और समूह 4, क्रमशः) ।
- छिड़काव बंद करने के लिए पंप बंद कर दें ।
4. वाम पार्श्व पालि के शारीरिक Reperfusion
- वाम पोर्टल नस और बाएं पार्श्व यकृत नस से दोनों कैथेटर बंद ले लो ।
- एक 11-0 पॉलियामाइड टांका के साथ बाईं पोर्टल नस का चीरा बंद करें ।
- एक 11-0 पॉलियामाइड सीवन के साथ बाईं पार्श्व यकृत नस के चीरा के रूप में अच्छी तरह से बंद करें ।
- वाम पार्श्व यकृत नस unclamp ।
- वाम माध्य पोर्टल नस unclamp, छोड़ दिया पित्त नली, और छोड़ दिया यकृत धमनी ।
- नस को फिर से खोलने के लिए बाएं पोर्टल नस पर संयुक्ताक्षर को काट लें ।
5. पेट की दीवार का बंद होना
- एक 4-0 अवशोषित polyglactin ९१० टांका के साथ बाधित suturing द्वारा पेट की दीवार की मांसपेशी परत को बंद करें ।
- एक 4-0 अवशोषित polydioxanone टांका के साथ बाधित suturing द्वारा पेट की दीवार की त्वचा की परत को बंद करें ।
- पेट बंद करने के बाद, ७०% अल्कोहल के साथ त्वचा चीरा संक्रमित ।
6. चूहे के पश्चात उपचार
- के बारे में 10 मिनट के लिए पुनर्जीवन के लिए एक वार्मिंग पैड पर पशु प्लेस और फिर यह एक नया पिंजरे में डाल दिया ।
- प्रशासन buprenorphine ०.०५ मिलीग्राम/kg चमड़े के नीचे एक लगातार 3 डी के लिए एक दिन के बाद दर्द जारी है ।
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Representative Results
बारह पुरुष (12-13 सप्ताह की आयु) लुईस चूहों के चुनिंदा यकृत पालि छिड़काव के प्रभाव का आकलन किया गया. प्रयोग चार समूहों (n = प्रति समूह 3 चूहों) में किया गया था । ऊपर बताए गए चरणों का पालन करते हुए 20 मिनट, 2 घंटे, 3 घंटे, और 4 घंटे के विभिन्न छिड़काव पीरियड्स का उपयोग करना, हमने विवो एकल पालि छिड़काव में सफलतापूर्वक हासिल किया.
वीवो में वाम पार्श्व पालि के छिड़काव:
वाम पोर्टल नस की सटीक संरचनात्मक पहचान और वाम पार्श्व यकृत नस और सफल वाम पोर्टल नस और वाम पार्श्व यकृत नस cannulation heparinized खारा के साथ छिड़काव के बाद की पुष्टि की जा सकती है । एक सफल पहचान और cannulation का पहला संकेतक अवलोकन है कि रक्त perfusate के साथ मिश्रित द्रव आउटलेट (चित्रा 4a) के माध्यम से बाएं पार्श्व पालि से बाहर बह रहा था । सफल शल्य छिड़काव मॉडल heparinized खारा के साथ छिड़काव के बाद वाम पार्श्व पालि के रंग के परिवर्तन को देख कर आगे की पुष्टि की थी । वाम पार्श्व पालि का रंग चमकीले लाल से पीला बेहोश करने के लिए बदल दिया, बाएं पार्श्व पालि से रक्त को हटाने का संकेत है । शेष पालियों के शारीरिक छिड़काव के रखरखाव की पुष्टि करने के लिए, शेष जिगर पालियों का रंग लगातार बाईं पार्श्व पालि के छिड़काव के दौरान मनाया गया था । बाएँ पार्श्व पालि के सही छिड़काव के परिणामस्वरूप पालि में बेहोशी पीली पड़ गई जबकि शेष जिगर पालियों ने पूरी प्रक्रिया में अपने चमकीले लाल रंग को बनाए रखा (चित्रा 4B).
वाम पार्श्व पालि के शारीरिक Reperfusion:
जहाजों का चीरा बंद करने और जहाजों को फिर से खोलने के बाद cannulated वाहिकाओं के प्रत्यक्षता का आकलन करने के लिए, बाएँ पार्श्व पालि के रंग परिवर्तन मनाया गया । कुछ लाल धब्बे वाम पार्श्व यकृत नस फिर से खोलने के बाद perfused बेहोश पीले बाएँ पार्श्व पालि की सतह पर दिखाई दिया, बाएँ पार्श्व पालि में प्रारंभिक प्रतिगामी छिड़काव का संकेत (आंकड़ा 5 ए). लक्षित पालि की सतह के बाद छोड़ दिया यकृत धमनी के माइक्रो clamps जारी करने के बाद भी अधिक लाल धब्बे दिखाया, छोड़ दिया पित्त नलिका, और वाम माध्य पोर्टल नस, फिर से खोला के माध्यम से वाम पार्श्व पालि के शारीरिक छिड़काव अर्थ जहाजों (चित्रा 5B) । लक्षित जिगर पालि की सतह वाम पोर्टल नस फिर से खोलने के बाद गहरे लाल हो गया, पुष्टि की है कि लक्षित जिगर पालि वाम पोर्टल नस (चित्रा 5C) के माध्यम से अपनी पूर्ण शारीरिक छिड़काव पुनः प्राप्त ।
Perfused वाम पार्श्व पालि के प्रोटोकॉल:
heparinized खारा या खारा छिड़काव खत्म करने के बाद, चुनिंदा perfused पार्श्व पालि (प्रयोगात्मक के रूप में) और सामांय अवर caudate पालि (नियंत्रण के रूप में) और resect के साथ तय किया गया और फिर एक formaldehyde परीक्षा के अधीन (एच व Estaining). बाएं पार्श्व पालि में, वहां कोई स्पष्ट रक्त कोशिकाओं पोर्टल नस, sinusoids, और केंद्रीय नस की शाखा में दिखाई दे रहे हैं । आशा के रूप में, लाल कोशिकाओं यकृत धमनी (चित्रा 6A और 6C) की शाखा में दिखाई दे रहे थे । सामान्य अवर caudate पालि में (नियंत्रण के रूप में), रक्त कोशिकाओं काफी पोर्टल नस की शाखा में देखा गया था, sinusoids, और केंद्रीय नस (चित्रा घमण्ड और 6D).
जीवित रहने की दर:
बारह प्रयोगात्मक चूहों में से बारह १००% की एक 1 सप्ताह जीवित रहने की दर के परिणामस्वरूप । हालांकि, 3 प्रयोगात्मक चूहों जो छिड़काव के 4 घंटे से गुजरा दूसरे या तीसरे दिन पश्चात पर आंखों से दस्त और खूनी स्राव से अस्थायी रूप से सामना करना पड़ा ।
चित्रा 1 : शल्य चिकित्सा की योजना वीवो में एकल जिगर पालि छिड़काव मॉडल । (क) इस चूहे जिगर शरीर रचना विज्ञान के एक योजनाबद्ध ड्राइंग है । (ख) इस पैनल को छोड़ दिया पोर्टल नस की रुकावट से पता चलता है, छोड़ दिया यकृत धमनी, बाएं पित्त नलिका, वाम माध्य पोर्टल नस, और वाम पार्श्व यकृत नस । (ग) इस पैनल को छोड़ दिया पोर्टल नस और द्रव प्रवेश और आउटलेट के लिए कैथेटर के साथ छोड़ दिया पार्श्व यकृत नस के cannulation से पता चलता है । (घ) यह पैनल एक छिड़काव पम्प द्वारा heparinized खारा के साथ बाएँ पार्श्व पालि के छिड़काव को दिखाता है. (ङ) यह पैनल ब्लॉक किए गए जहाजों को पालि में पुनः खोलने के बाद बाएँ पार्श्व पालि के शारीरिक reperfusion को दिखाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : Intraoperative छवियों की आपूर्ति और बाएं पार्श्व पालि draining जहाजों की रुकावट दिखा । (क) यह पैनल वाम पोर्टल शिराओं के बंधाव को दिखाता है. (ख) इस पैनल को छोड़ दिया यकृत धमनी की रुकावट से पता चलता है, छोड़ दिया पित्त नलिका, और वाम माध्य पोर्टल शिरा/यकृत धमनी/ (ग) इस पैनल माइक्रो clamps (सफेद तीर) के साथ वाम पार्श्व यकृत नस की रुकावट से पता चलता है । स्केल पट्टियां 1 मिमी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 3 : Intraoperative बाईं पार्श्व पालि के माध्यम से बाईपास संचलन दिखा छवियां । (क) यह पैनल एक 24 जी सुई निवास कैथेटर के साथ puncturing द्वारा बाईं पोर्टल नस (सफेद तीर) में चीरा से पता चलता है. (ख) यह पैनल एक 24-जी सुई मुक्त कैथेटर (सफेद तीर) के साथ एक द्रव प्रवेश के लिए छोड़ दिया पोर्टल नस के cannulation से पता चलता है । (ग) इस पैनल के बाएं पार्श्व यकृत नस में चीरा (सफेद तीर) एक 22-जी सुई रहने कैथेटर के साथ puncturing द्वारा पता चलता है । (घ) यह पैनल एक 22-जी सुई मुक्त कैथेटर (सफेद तीर) के साथ एक द्रव आउटलेट के लिए बाएं पार्श्व यकृत नस के cannulation से पता चलता है । स्केल पट्टियां 1 मिमी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्र 4 : वाम पार्श्व पालि के छिड़काव दिखा Intraoperative छवियां । (एक) इस पैनल के प्रवेश (पीला कैथेटर) के माध्यम से बाएं पार्श्व पालि में बह perfusate से पता चलता है और आउटलेट (नीला कैथेटर) के माध्यम से बाएं पार्श्व पालि से बाहर बह । वाम पार्श्व पालि था, वास्तव में, चुनिंदा perfused, के रूप में पालि के बदलते रंग (सफेद तीर) द्वारा दिखाया गया है । (ख) बाएं पार्श्व पालि के रंग परिवर्तन नोट heparinized खारा के साथ छिड़काव के बाद पीले बेहोश करने के लिए, जबकि शेष जिगर पालियों चमकीले लाल (सफेद तीर) रहते हैं । स्केल पट्टियां 1 मिमी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 5 : वाम पार्श्व पालि के शारीरिक reperfusion । (एक) इस पैनल वाम पार्श्व यकृत नस (सफेद तीर) फिर से खोलना के बाद बाएं पार्श्व पालि के प्रतिगामी छिड़काव से पता चलता है । (ख) इस पैनल छोड़ माध्य पोर्टल नस और छोड़ दिया यकृत धमनी पर माइक्रो clamps जारी करने के बाद बाएं पार्श्व पालि (सफेद तीर) के शारीरिक reperfusion से पता चलता है । (ग) इस पैनल वाम पार्श्व पालि (लाल तीर) की पूरी reperfusion छोड़ दिया पोर्टल नस और वाम माध्य पालि (नीला तीर) के ischemia खोलने के बाद पता चलता है । स्केल पट्टियां 1 मिमी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 6 : ऊतकवैज्ञानिक आकलन (एच एंड ई धुंधला) । (ए और सी) इन पैनलों हेपरिन-खारा-perfused वाम पार्श्व पालि (प्रयोगात्मक पालि) में रक्त कोशिकाओं के अभाव का प्रदर्शन एक ऊतकवैज्ञानिक आकलन दिखाने के (क) पोर्टल नस और sinusoids, और (ग) मध्ये नस । (क) हालांकि, लाल कोशिकाओं यकृत धमनी में दिखाई दे रहे हैं (काले तीर) उम्मीद के रूप में. (बी और डी) इन पैनलों सामान्य अवर caudate पालि (नियंत्रण) के एक ऊतकवैज्ञानिक आकलन सभी संवहनी संरचनाओं में रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति का खुलासा दिखाने: (ख) पोर्टल नस, यकृत धमनी, और sinusoids (काले तीर), और (घ) मध्य शिरा (काला तीर). पैमाने सलाखों के २५० µm हैं ।
| पैरामीटर | परिणाम | |
| अनुसंधान समूह | पैन एट अल २०१६ [15] | स्वयं के समूह |
| इन-वीवो | हाँ | हाँ |
| लक्ष्य जिगर पालि | दायां अवर पालिक
|
बायां पार्श्व पालि
|
| नाकाबन्दी गर्दा वेना कावा र मुख्य पोर्टल नस | हाँ
|
नहीं
|
| शेष पालियों के Ischemia | हाँ | केवल वाम माध्य पालि |
| Cannulation ऑफ वेना कावा | हाँ | नहीं |
| Cannulation के मुख्य पोर्टल नस | हाँ | नहीं |
| पोर्टल हाइपरटेंशन | हाँ | नहीं |
| 1 सप्ताह जीवित रहने की दर | बलि intraoperatively | १००% |
तालिका 1. के विभिंन मॉडलों के बीच तुलना वीवो में जिगर इंजीनियरिंग । यह तालिका पैन एट अल के बीच दो मॉडल प्रतिष्ठानों में महत्वपूर्ण मतभेदों को दर्शाता है । 15 और हमारे अनुसंधान समूह ।
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Discussion
अवरुद्ध और cannulating एक द्रव प्रवेश के रूप में एक कैथेटर के साथ छोड़ दिया पोर्टल नस और एक तरल पदार्थ आउटलेट के रूप में एक और कैथेटर के साथ छोड़ दिया पार्श्व यकृत नस, हम सफलतापूर्वक वाम पार्श्व पालि के भीतर vivo द्रव बाईपास में एक उत्पन्न, यह दर्शाता है कि हालांकि तकनीक अत्यधिक cannulation और रक्तस्राव के कारण के एक उच्च जोखिम के लिए जहाजों के छोटे आकार के कारण चुनौतीपूर्ण है, यह संभव है । यहां तक कि चूहों 4 घंटे के एक लंबे समय छिड़काव अवधि के दौर से गुजर कम 1 सप्ताह बच, दिखा रहा है कि चूहों इस शल्य प्रक्रिया को बर्दाश्त कर सकता है ।
निम्न अनुभाग में, हम तीन तकनीकी रूप से सबसे कठिन और महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन और उन्हें सफलतापूर्वक मास्टर करने के लिए कैसे. सबसे पहले, जुदाई और वाम पोर्टल नस के बंधाव की प्रक्रिया में, आसपास के जिगर पैरेन्काइमा के साथ लक्षित पोर्टल नस के करीबी स्थानिक रिश्ते के कारण, पोत का अलगाव रक्तस्राव के कारण के एक उच्च जोखिम है । हम माइक्रो संदंश का उपयोग करने के बजाय कैंची से छोड़ दिया पोर्टल नस अलग करने के लिए, ध्यान से अलग से जुड़े avascular बाईं पोर्टल नस आसपास के ऊतकों को फाड़ने की सलाह देते हैं । दूसरे, बाईं पोर्टल नस के सामने की दीवार पर चीरा के संदर्भ में, बाईं पोर्टल नस के सामने की दीवार पर एक oversize चीरा चीरा मरम्मत की कठिनाई और संवहनी सम्मिलन के बाद एक प्रकार का रोग पैदा होने की संभावना बढ़ सकता है. हम एक ठीक से आकार चीरा बनाने के लिए कैंची के बजाय एक सुई निवास कैथेटर का उपयोग करने की सलाह देते हैं. तीसरे, वाम पार्श्व यकृत नस की रुकावट के बारे में, बाएं पार्श्व यकृत नस के उजागर क्षेत्र अनुचित तरीके से अवरुद्ध है, तो बाद में cannulation के लिए छोड़ दिया पार्श्व यकृत नस पर पर्याप्त जगह उजागर नहीं होगा । हम सुझाव clamping के बजाय वाम पार्श्व यकृत नस के उजागर क्षेत्र के बीच में से छोड़ दिया औसत पालि के करीब प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
हम वीवो लिवर छिड़काव में चुनिंदा पैन एट अल के बीच के दो मॉडलों की तुलना करते हैं । 15 और हमारा (तालिका 1) । सबसे पहले, लक्षित जिगर पालि के चयन मॉडल स्थापना के लिए एक सबसे महत्वपूर्ण कदम माना जाता है । हम एक जगह पृथक पालि, वाम पार्श्व पालि, vivo सर्जिकल छिड़काव मॉडल स्थापना में के लिए लक्षित पालि के रूप में चुना है । इसके विपरीत, पैन के अनुसंधान समूह14मॉडल के लिए सही अवर पालि चयनित । सही अवर पालि के चयन की कमियों के रूप में निंनलिखित हैं: सबसे पहले, वे पूरी तरह से अवरुद्ध और एक द्रव आउटलेट के लिए वेना कावा cannulating, जो नकारात्मक जानवर के रक्त परिसंचरण प्रभाव हो सकता है द्वारा समझौता किया था । दूसरे, वे ब्लॉक और एक प्रवेश है, जो शेष जिगर पालियों के ischemia के कारण के लिए मुख्य पोर्टल नस cannulate था, और पोर्टल उच्च रक्तचाप । के रूप में यहां लक्षित पालि की तुलना में, वाम पार्श्व पालि, हम अवरुद्ध और cannulated एक द्रव आउटलेट के लिए वेना कावा के बजाय पार्श्व यकृत नस छोड़ दिया है । हम वाम पोर्टल नस, जो एक जगह बड़े व्यास है, विच्छेदन, रुकावट की सुविधा का चयन करके एक द्रव प्रवेश उत्पंन, और cannulation । इसलिए, सीधे वेना कावा के लिए रक्त के प्रवाह को अवरुद्ध और मुख्य पोर्टल नस यहां प्रस्तुत मॉडल है, जो चूहे के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है में बचा है ।
vivo जिगर पालि छिड़काव में के लिए महान क्षमता के बावजूद, इस तकनीक कुछ सीमाएं हैं । सबसे पहले, छोड़ दिया औसत दर्जे का पालि के ischemia अपरिहार्य है, इस प्रक्रिया के दौरान वाम माध्य पोर्टल नस की रुकावट के कारण । दूसरे, माइक्रो clamps का उपयोग छोड़ पार्श्व पालि के आधार पर अस्थाई रुकावट पर आधारित है, यह जिगर लोबार आधार आसपास पैरेन्काइमा की क्षति के लिए नेतृत्व कर सकते है और अनिवार्य रूप से heparinized खारा के साथ छिड़काव के दौरान एक मामूली रिसाव का कारण । तीन प्रयोगात्मक चूहों जो 4 घंटे की एक छिड़काव अवधि के अधीन थे दस्त और खूनी नेत्र निर्वहन से अस्थाई रूप से सामना करना पड़ा, सुझाव है कि 4 घंटे अधिक जटिलताओं दुख के बिना एक चूहे के लिए अधिकतम छिड़काव अवधि हो सकता है । हमारे ज्ञान के लिए, एक पूरे चूहे जिगर पूर्व vivo18की decellularization के लिए कम से कम 3 घंटे की आवश्यकता है । इसलिए, छिड़काव समय के 4 घंटे हम आगे जिगर पालि decellularization, जो एक जिगर पाड़ के सेल पुनर्जनसंख्या द्वारा जिगर इंजीनियरिंग के लिए एक शर्त है के लिए पर्याप्त होगा प्राप्त करने का इरादा ।
भविष्य में, vivo छिड़काव मॉडल में एक के लिए इस उपंयास तकनीक संभवतः प्रयोगात्मक अनुसंधान में दवाओं के साथ अर्क द्वारा आंशिक अंग उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, में vivo आंशिक अंग decellularization के रूप में रासायनिक लकीर के रूप में, एक " vivo में सेल संस्कृति प्रणाली ", और, संभवतः सबसे महत्वपूर्ण बात, के लिए vivo आंशिक अंग इंजीनियरिंग में .
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक को एनाटॉमी मैं, जेना विश्वविद्यालय अस्पताल के संस्थान से जेएनएन Geiling शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, चूहे जिगर शरीर रचना के योजनाबद्ध चित्र के उत्पादन के लिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon |
References
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
