Summary
Establecemos una novedosa técnica quirúrgica para un modelo de perfusión en vivo solo lóbulo hepático de rata como requisito previo para el estudio adicional en vivo hígado parcial en el futuro de la ingeniería.
Abstract
Ingeniería de órganos es una nueva estrategia para generar sustitutos de hígado órgano que potencialmente pueden ser utilizados en el trasplante. Recientemente, en vivo hígado ingeniería, incluyendo en vivo órgano descelularización seguido de repoblación, ha surgido como un enfoque prometedor sobre ingeniería ex de vivo hígado. Sin embargo, no se logró la supervivencia postoperatoria. El objetivo de este estudio es desarrollar una nueva técnica quirúrgica en vivo perfusión selectiva del lóbulo hepático en las ratas como requisito previo para la ingeniería en vivo hígado. Generamos un circuito bypass sólo a través del lóbulo lateral izquierdo. Entonces, el lóbulo lateral izquierdo es inundado con solución salina heparinizada. El experimento se realizó con 4 grupos (n = 3 ratas por grupo) basado en tiempos diferentes de la perfusión de 20 min, 2 h, 3 h y 4 h. supervivencia, así como el cambio macroscópico visible del color y la ausencia histológico determinada de células de la sangre en el tríada portal y los sinusoides, es tomado como un indicador para el establecimiento de un modelo de éxito. Después de la perfusión selectiva del lóbulo lateral izquierdo, observamos que el lóbulo lateral izquierdo, de hecho, dio vuelta de rojo a amarillo débil. En una evaluación histológica, células de la sangre no son visibles en la rama de la vena porta, la vena central y los sinusoides. El lóbulo lateral izquierdo cambia a rojo después de la reapertura de los vasos obstruidos. 12/12 ratas sobrevivieron el procedimiento más de una semana. Somos el primer para divulgar un modelo quirúrgico para la perfusión sola lóbulo hepático en vivo con un período de supervivencia larga de más de una semana. En contraste con el informe previamente publicado, la ventaja más importante de la técnica presentada aquí es que la perfusión del 70% del hígado se mantiene a lo largo de todo el procedimiento. El establecimiento de esta técnica proporciona una base para en vivo parcial ingeniería hepática en ratas, como descelularización y recelularización.
Introduction
Las indicaciones para el trasplante de órganos están ampliando constantemente. Por el contrario, están disminuyendo las tasas de donación de órganos y la calidad general de los órganos, llevando a una creciente demanda de injertos. Continuó aumentando el número de candidatos ha añadido a la lista de espera de trasplante de hígado (p. ej., en los Estados Unidos, 11.340 pacientes fueron agregados en el año 2016, en comparación con 10.636 en 2015)1. A pesar de considerables esfuerzos, el número de órganos disponibles necesidades clínicas. Debido a la incidencia creciente de enfermedad hepática, muchos pacientes con enfermedades hepáticas de fase final muere en lista de espera de trasplante ante un órgano de donante disponible. Para satisfacer la enorme demanda de injertos de donantes, alternativas, utilizando tejido del hígado principios de ingeniería están siendo activamente persiguen2. Hoy en día, una técnica biológica desarrollada recientemente de ingeniería hepática potencialmente podría superar esta escasez.
Ingeniería hígado consta de dos pasos: la generación de un andamio acelular, seguido de una repoblación del andamio. Para obtener un andamio biológico de hígado acelular, el hígado explanted es inundada por el sistema vascular con detergentes iónicos o no iónicos, que se puede quitar el material celular del hígado. En la mayoría de los estudios anterior, un andamio biológico de hígado acelular fue alcanzado por la perfusión del hígado con una combinación de dodecil sulfato de sodio y TritonX100. Como resultado, todas las células fueron quitadas, mientras que se mantuvo la estructura de la matriz extracelular. Las matrices de soporte de órgano fueron resembrados con células maduras, hepatocelular, así como líneas de células endoteliales y hepatocitos primarios con o sin la aplicación simultánea de las células endoteliales o células madre mesenquimales (MSC). Enfoque de los investigadores más en vivo ex hígado ingeniería3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Sin embargo, en la mayoría de los estudios anterior, sólo pequeños trozos de cubos repoblado andamio fueron transplantadas en sitios diferentes de implantación heterotópica. En algunos estudios, andamios repoblación parciales fueron trasplantados como injertos auxiliares. Sin embargo, la máxima supervivencia divulgada fue sólo 72 h8,14. Lo que sabemos, trasplante ortotópico de un injerto completo higado repoblado aún no ha sido realizado o publicado sobre. La función a largo plazo y trasplante de órganos modificados son todavía en su infancia. Por lo tanto, es necesario un enfoque alternativo a la ex vivo hígado ingeniería.
En vivo hígado ingeniería puede representar una alternativa para el estudio hepático repoblación bajo condiciones fisiológicas. Las ventajas de en vivo hígado ingeniería comparado con ingeniería ex de vivo hepática son múltiples. En vivo repoblado parcial hígado andamio está sometido a perfusión sanguínea fisiológica con la temperatura adecuada, suficiente oxígeno, nutrientes y factores de crecimiento en contraste con perfusión ex vivo con medio de cultivo artificial. Además, el hígado normal parcial restante mantiene la función hepática, principalmente, lo que permite la supervivencia a largo plazo. Puesto que un injerto de hígado implantado ex vivo diseñado es todavía incapaz de sostener la supervivencia a largo plazo de animales de experimentación por su función hepática8, imaginamos que en vivo parcial hígado engineeringwould en última instancia convertirse en un modelo prometedor para estudiar más la evolución de la ingeniería hígados con más observaciones de supervivencia de ex vivo.
Recientemente, un grupo de investigación (Pan y colegas) presentó, por primera vez, una técnica de en vivo hígado ingeniería15. Alcanzaron la perfusión aislada del lóbulo inferior derecho hígado en ratas vivas a pesar de los desafíos técnicos y anatómicos. Ellos reportaron los primeros resultados intraoperativos de en vivo repoblación mediante una línea de celular de hepatocitos primarios de rata. Sin embargo, el modelo de perfusión quirúrgica en vivo de Pan et al. tiene desventajas. Alcanzaron la perfusión sola lóbulo hepático en ratas a costa de bloquear totalmente la vena porta y vena cava inferior, que puede causar grave daño al animal. Las ratas experimentales fueron sacrificadas después de sólo 6 horas de tiempo de observación intraoperatoria. Por lo tanto, la técnica de perfusión en vivo lóbulo hepático necesita mejora para lograr la supervivencia postoperatoria.
Desarrollamos un modelo de supervivencia nuevo para en vivo lóbulo hepático de la perfusión, basado en estudios previos de la Anatomía hepática de rata16, la técnica de canulación de la vena porta para monitoreo hemodinámico en ratones17y Bioingeniería hígado 18 , 19. los pasos claves para el procedimiento se ilustración en la figura 1A - 1E.
Esta técnica es adecuada para aquellos que quieran utilizar este modelo de perfusión experimental en vivo para la investigación básica en el tratamiento de órgano parcial por infusión de drogas, descelularización en vivo como una resección química para las enfermedades de órgano (p. ej. , cáncer de hígado), en vivo el cultivo de células en una matriz decellularized comparar ex vivo bidimensional y tridimensional de la célula cultura sistemas20,21,22,23 , 24 , 25 , 26y en vivo hígado ingeniería descelularización y repoblación.
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Protocol
La vivienda y todos los procedimientos realizados fueron conforme a legislación de bienestar animal alemán. Toda la gasa, cubierta de ropa e instrumentos quirúrgicos son esterilizado y preparado antes de la operación. Todos los procedimientos se llevan a cabo en condiciones estériles.
1. preparación de la rata para el procedimiento quirúrgico
- Colocar la rata en una cámara de inducción y anestesiar la rata con isoflurano vaporizado de 4% y oxígeno al 100% en 0,5 L/min durante aproximadamente 3 minutos, hasta que la rata está totalmente anestesiada.
- Sacar a la rata de la cámara de inducción y medir su peso corporal.
- Afeitarse la piel de la región quirúrgica en el abdomen.
- Coloque la parte trasera de animales en la cámara de isoflurano para un 2 minutos adicionales profundizar la anestesia.
- Colocar la rata en la mesa de operación en posición supina.
- Fijar la máscara de la anestesia en la región de la boca de la rata y que el animal anestesiado con un flujo de gas continuo de isoflurano vaporizado el 2% y el 100% de oxígeno a un flujo de 0.5 L/min.
- Fijar las extremidades con trozos de cinta.
- Aplique ungüento veterinario en ambos ojos para evitar la sequedad.
- Administrar buprenorfina 0,05 mg/kg por vía subcutánea, para aliviar el dolor durante el período de operación.
- Desinfección del campo quirúrgico del abdomen con 3 rondas de tintura de yodo seguido de 2 rondas de alcohol al 70%.
- Lugar esteriliza gasas alrededor del área donde se realizará la incisión para dejar sólo el campo de la operación del abdomen expuesto.
- Proceder a realizar la operación cuando está ausente el reflejo del pellizco del dedo del pie retiro de la rata.
2. laparotomía de la rata
- Hacer una incisión de piel y músculo abdominal transversal usando tijeras y un coagulador eléctrico.
- Fijar y sacar el proceso del xiphoid hacia la cabeza mediante una sutura de polipropileno 4-0.
Nota: Preste atención al levantar el proceso del xiphoid verticalmente para exponer mejor el hígado, pero proceda con precaución para evitar la restricción respiratoria severa y la asfixia. - Abrir la cavidad peritoneal tirando de ambos lados de las paredes abdominales hacia la cabeza con dos ganchos subcostal para exponer el hígado.
- Cubrir el duodeno y el intestino en la cavidad abdominal con una gasa humedecida para evitar que se sequen.
- Levante lóbulos medianos derecho e izquierdos utilizando una gasa humedecida y mantenerlos contra el tórax para exponer mejor el hilio del hígado.
- Lugar la rata bajo un estereomicroscopio (aumento de X 8).
- Deje caer alguna solución salina tibia en el abdomen y en la superficie del hígado y los intestinos cada varios minutos, para evitar que se sequen durante todo el procedimiento.
3. establecimiento de un pasaje de derivación dentro de lóbulo Lateral izquierdo
- Disecar la vena porta izquierda y ligan con una sutura de seda 6-0 en la base (figura 2A).
- Bloque de la izquierda de la arteria hepática, el conducto biliar izquierdo junto con la vena media izquierda del portal, la arteria hepática media izquierda y la izquierda mediana vía biliar con micro pinzas para evitar un flujo de la solución en el lóbulo medio izquierdo (figura 2B).
- Separar el lóbulo lateral izquierdo cortando los ligamentos circundantes del lóbulo con micro tijeras.
- Bloquear la lateral izquierda de la vena hepática por fijación en la base del lóbulo lateral izquierdo con micro pinzas (figura 2).
Nota: Asegúrese de no apretar la vena porta izquierda así por error. - Utilice abrazaderas de mosquito la ligadura de la vena porta izquierda y mantener la vena con la tensión adecuada para la canulación más adelante.
- Cuidadosamente hacer una incisión en la pared frontal de la vena porta izquierda pinchando con un aguja-vivienda 24-G catéter ( Figura 3A).
Nota: Para crear un puente, son necesarios puntos de acceso vascular en la izquierda de la vena porta y la vena hepática izquierda. Para este paso, es preferido para crear el acceso vascular por punción de los vasos con una aguja en lugar de hacer una incisión más grande con unas tijeras. Esto reduce el riesgo de sangrado y posterior estenosis. - Retirar el catéter y tomar la aguja de la sonda para obtener una sonda de aguja-libre 24-G.
- Conectar el catéter a un tubo de perfusión, de que el otro extremo se conecta a una jeringa de 20 mL con 15 mL de 40 U/mL heparinizada solución salina en una bomba de perfusión.
- Encienda la bomba para perfundiendo el tubo para expulsar el aire hacia fuera del tubo y la sonda de aguja-libre.
- Apague la bomba de perfusión.
- Una vez más, inserte el catéter sin aguja en la vena porta izquierda a través de la incisión pinchada en la vena (figura 3B).
Nota: Debido a espacio limitado para la fijación del catéter, no se fija en este punto. Por lo tanto, el cirujano debe usar cuidado para evitar el desplazamiento del catéter canulado. - Cuidadosamente hacer otra incisión en el margen de la región expuesta de la vena hepática lateral izquierda pinchando con un catéter de aguja-vivienda de 22 o 24 G (figura 3).
Nota: Se recomienda que el catéter sea ligeramente más pequeño que la nave. - Retirar el catéter y tomar la aguja por el catéter para obtener un catéter sin aguja 22-G.
- Encienda la bomba de perfusión perfusión salina heparinizada en el lóbulo lateral izquierdo vía 24-G canulado sin aguja catéter de la vena porta izquierda a una velocidad de flujo de 0,5 mL/min.
- Utilice una gasa seca para absorber el líquido que hacia fuera-fluye residuos alrededor de la zona de incisión de la vena hepática lateral izquierda.
- Canule la vena hepática lateral izquierda vía el pinchado de la incisión de la vena con el catéter de aguja 22-G, para generar una toma de fluidos para minimizar la contaminación intraabdominal (figura 3D).
Nota: Es técnicamente difícil fijar el catéter canulado en el lóbulo hepático. Por lo tanto, el cirujano debe prestar atención a evitar el desplazamiento del catéter. Por otra parte, sin la canulación de la vena hepática izquierda lateral con un catéter, residuos líquidos también pueden ser absorbido en la región de la incisión de la vena con una gasa seca. - Mantener perfundiendo el lóbulo lateral izquierdo con solución salina heparinizada para alrededor de 20 minutos (Grupo 1) y luego solamente con solución salina para 2 h, 3 h o 4 h (Grupo 2, grupo 3 y grupo 4, respectivamente).
- Apague la bomba para detener la perfusión.
4. a fisiológica reperfusión del lóbulo Lateral izquierdo
- Sacar ambos catéteres de la vena porta izquierda y el lateral izquierdo de la vena hepática.
- Cerrar la incisión de la vena porta izquierda con una sutura de poliamida 11-0.
- Cerrar la incisión de la vena hepática izquierda lateral con una sutura de poliamida 11-0 también.
- Suelte el lateral izquierdo de la vena hepática.
- Suelte la media izquierda de la vena porta, conducto biliar izquierdo y arteria hepática izquierda.
- Corte la ligadura de la vena porta izquierda a reabrir la vena.
5. cierre de la pared Abdominal
- Cerca de la capa muscular de la pared abdominal por la sutura interrumpida con una sutura absorbible Poliglactina 910 de 4-0.
- Cerrar la capa de la piel de la pared abdominal por la sutura interrumpida con una sutura de polidioxanona absorbible 4-0.
- Después de cerrar el abdomen, desinfectar la incisión de la piel con alcohol 70%.
6. postoperatorio tratamiento de la rata
- Coloque el animal en una cubierta térmica de colchón para la reanimación durante unos 10 minutos y luego ponerlo en una jaula nueva.
- Administrar buprenorfina 0,05 mg/kg por vía subcutánea 2 x día por 3 d consecutivo postoperatoriamente liberar el dolor.
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Representative Results
Doce hombre (edad 12 - 13 semanas) las ratas de Lewis fueron utilizadas para evaluar el efecto de la perfusión selectiva del lóbulo hepático El experimento se realizó en cuatro grupos (n = 3 ratas por grupo). Con períodos diferentes de la perfusión de 20 minutos, 2 horas, 3 horas y 4 horas, siguiendo los pasos descritos anteriormente, logra con éxito en vivo de la perfusión del lóbulo único.
En Vivo La perfusión del lóbulo Lateral izquierdo:
La identificación anatómica exacta de la vena porta izquierda y el lateral izquierdo de la vena hepática y el éxito de la vena porta izquierda e izquierda canulación de la vena hepática lateral puede confirmarse después de la perfusión con solución salina heparinizada. El primer indicador de una acertada identificación y canulación fue la observación que sangre mezclado con solución fluía de lóbulo lateral izquierdo mediante la toma de líquido (Figura 4A). El modelo de perfusión quirúrgica exitosa fue confirmado más observando el cambio de color del lóbulo lateral izquierdo después de la perfusión con solución salina heparinizada. El color del lóbulo lateral izquierdo cambia de rojo a amarillo débil, lo que indica la extracción de sangre del lóbulo lateral izquierdo. Para confirmar el mantenimiento de la perfusión fisiológica de los lóbulos restantes, el color de los lóbulos de hígado restantes fue observado constantemente durante la perfusión del lóbulo lateral izquierdo. La correcta perfusión del lóbulo lateral izquierdo resultó en el lóbulo da vuelta amarillo débil, mientras que los lóbulos de hígado restantes mantienen su color rojo brillante durante todo el proceso (Figura 4B).
Reperfusión fisiológica del lóbulo Lateral izquierdo:
Para evaluar la permeabilidad de los vasos canulados después de cerrar las incisiones de los recipientes y volver a abrir los recipientes, se observó el cambio de color del lóbulo lateral izquierdo. Algunas manchas rojas aparecieron en la superficie de la perfusión débil amarillo lateral lóbulo izquierdo después de la reapertura de la vena hepática izquierda lateral, indicando perfusión retrógrada inicial en el lóbulo lateral izquierdo (figura 5A). La superficie del lóbulo dirigida más tarde demostró aún más manchas rojas después de soltar las pinzas micro de la arteria hepática izquierda, izquierda conducto biliar y mediana de la vena porta, lo que implica más fisiológica perfusión del lóbulo lateral izquierdo vía a la izquierda el reabierto vasos (figura 5B). La superficie del lóbulo hepático dirigida volvió rojo oscuro después de la reapertura de la vena porta izquierda, confirmando que el lóbulo del hígado dirigido recuperó su perfusión completo fisiológica a través de la vena porta izquierda (figura 5).
Histología del lóbulo Lateral izquierdo inundada:
Después de acabado perfusión salina o solución salina heparinizada, lóbulo lateral izquierdo selectivamente perfundido (como experimental) y el lóbulo caudado inferior normal (como control) fueron resecados y fijadas con formaldehído y luego sometidos a un examen histológico (H & Estaining). En el lóbulo lateral izquierdo, no hay obvia las células de sangre visible en la rama de la vena porta, sinusoides y vena central. Como era de esperarse, las células rojas eran visibles en la rama de la arteria hepática (figura 6A y 6C). En el lóbulo caudado inferior normal (como control), las células sanguíneas se observaron significativamente en la rama de la vena porta, los sinusoides y la vena central (Figura 6B y 6 D).
Tasa de supervivencia:
Doce de doce ratas experimentales resultaron en una tasa de supervivencia de 1-semana del 100%. Sin embargo, 3 ratas experimentales que sufrió 4 horas de perfusión sufrieron temporalmente de diarrea y descargan sangrienta de los ojos en el segundo o tercer día después de la operación.
Figura 1 : Esquema de la cirugía en vivo modelo de perfusión del lóbulo del hígado solo. (A) este es un dibujo esquemático de la anatomía del hígado de rata. ()B) este panel muestra la obstrucción de la vena porta izquierda, la arteria hepática izquierda, el conducto biliar izquierdo, la izquierda mediana de la vena porta y la vena hepática lateral izquierda. (C) este panel muestra la canulación de la vena porta izquierda y la vena hepática izquierda lateral con catéteres para entrada de fluido y la salida. (D) este panel muestra la perfusión del lóbulo lateral izquierdo con solución salina heparinizada por una bomba de perfusión. (E) este panel muestra la reperfusión fisiológica del lóbulo lateral izquierdo después de reapertura los vasos bloqueados al lóbulo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Imágenes intraoperatorias que demuestra la obstrucción de los vasos de abastecimiento y drenaje del lóbulo lateral izquierdo. (A) este panel muestra la ligadura de la vena porta izquierda. (B) este panel muestra la obstrucción de la arteria hepática izquierda, la izquierda vía biliar y el conducto de bilis de la arteria izquierda de la vena porta hepática mediana con micro pinzas. (C) este panel muestra la obstrucción de la vena hepática lateral izquierda con pinzas micro (flecha blanca). Las barras de escala son 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Imágenes intraoperatorias que muestra la circulación del puente a través del lóbulo lateral izquierdo. (A) este panel muestra la incisión en la vena porta izquierda (flecha blanca) por punción con un catéter de aguja-vivienda de 24 G. (B) este panel muestra la canulación de la vena porta izquierda para una entrada de fluido con un catéter de aguja 24 G (flecha blanca). (C) este panel muestra la incisión en la vena hepática lateral izquierda (flecha blanca) por punción con un catéter de aguja-vivienda de 22-G. (D) este panel muestra la canulación de la vena hepática izquierda lateral para una salida de líquido con un catéter de aguja de 22 G (flecha blanca). Las barras de escala son 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Imágenes intraoperatorias que muestra la perfusión del lóbulo lateral izquierdo. (A) este panel muestra la solución que fluye en el lóbulo lateral izquierdo a través de la entrada (catéter amarillo) y que fluye del lóbulo lateral izquierdo a través de la salida (catéter azul). El lóbulo lateral izquierdo, fue inundado selectivamente, como se muestra por el cambio de color del lóbulo (flecha blanca). Nota (B) el cambio del color de los lóbulos laterales lóbulo izquierdo a amarillo débil después de la perfusión con solución salina heparinizada, mientras que los restantes hígado siendo rojo brillante (flechas blancas). Las barras de escala son 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Reperfusión fisiológica del lóbulo lateral izquierdo. (A) este panel muestra la perfusión retrógrada del lóbulo lateral izquierdo después de la reapertura de la vena hepática lateral izquierda (flecha blanca). (B) este panel muestra la reperfusión fisiológica de la izquierda lóbulo lateral (flecha blanca) después de soltar el micro abrazaderas en la izquierda mediana de la vena porta y la arteria hepática izquierda. (C) este panel muestra la reperfusión completa del lóbulo lateral izquierdo (flecha roja) después de la reapertura de la vena porta izquierda y la isquemia del lóbulo medio izquierdo (flecha azul). Las barras de escala son 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Las evaluaciones histológicas (tinción H & E). (A y C) estos paneles muestran una evaluación histológica de la perfusión de solución salina de heparina izquierdo lóbulo lateral (lóbulo experimental) demostrando la ausencia de células de la sangre en ()A) la vena porta y sinusoides y (C) la vena central. (A) sin embargo, las células rojas son visibles en la arteria hepática (flecha negra) como se esperaba. (B y D) estos paneles muestran una evaluación histológica del lóbulo caudado inferior normal (control) revela la presencia de células sanguíneas en estructuras vasculares de todo: vena porta, arteria hepática y sinusoides (flechas negras), (B) y (D) de la vena central (flecha negra). Las barras de escala son 250 μm.
| Parámetros | Resultados | |
| Grupo de investigación | Pan et al 2016 [15] | Propio grupo |
| En vivo | Sí | Sí |
| Lóbulo del hígado del destino | Lóbulo inferior derecho
|
Lóbulo lateral izquierdo
|
| Obstrucción de vena cava y vena porta principal | Sí
|
No
|
| Isquemia de los lóbulos restantes | Sí | Sólo lóbulo medio izquierdo |
| Canulación de vena cava | Sí | No |
| Canulación de la vena porta principal | Sí | No |
| Hipertensión portal | Sí | No |
| tasa de supervivencia de 1 semana | Sacrificado intraoperatoriamente | 100% |
Tabla 1. Comparación entre diferentes modelos de en vivo ingeniería hígado. Esta tabla muestra las diferencias esenciales en los establecimientos de dos modelos entre Pan et al. 15 y nuestro grupo de investigación.
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Discussion
Bloqueando y canular la vena porta izquierda con un catéter como una entrada de fluido y la vena hepática izquierda lateral con otro catéter como un fluido, con éxito generamos un puente fluido en vivo dentro del lóbulo lateral izquierdo, lo que indica que Aunque la técnica es muy difícil debido al tamaño pequeño de los vasos para la canulación y a un alto riesgo de causar hemorragias, es factible. Incluso las ratas en período de perfusión larga de 4 horas sobrevivieron por lo menos 1 semana, mostrando que las ratas podían tolerar este procedimiento quirúrgico.
En la siguiente sección, describimos los tres pasos técnicamente más difíciles y críticos y cómo dominarlas con éxito. En primer lugar, en el proceso de separación y la ligadura de la vena porta izquierda, debido a la estrecha relación espacial de la vena portal específica con el parénquima hepático circundante, aislamiento de la nave tiene un alto riesgo de causar sangrado. Se recomienda utilizar pinzas micro en lugar de tijeras para separar la vena porta izquierda, separando cuidadosamente el tejido avascular conectado que rodea la vena porta izquierda. En segundo lugar, en cuanto a la incisión en la pared frontal de la vena porta izquierda, una gran incisión en la pared frontal de la vena porta izquierda puede aumentar la dificultad de reparación de la incisión y la posibilidad de causar estenosis después de anastomosis vascular. Se recomienda utilizar un catéter de aguja-vivienda en lugar de tijeras para hacer una incisión de tamaño apropiado. En tercer lugar, con respecto a la obstrucción de la vena hepática izquierda de lateral, si la región expuesta de la vena hepática lateral izquierda está bloqueada incorrectamente, no habrá expuesto suficiente espacio en la vena hepática izquierda lateral para canulación más adelante. Sugerimos que la sujeción debe realizarse cerca del lóbulo medio izquierdo en lugar de en el centro de la región expuesta de la vena hepática lateral izquierda.
Comparar los dos modelos de perfusión selectiva en vivo hígado entre Pan et al. 15 y el nuestro (cuadro 1). En primer lugar, la selección del objetivo lóbulo hepático se considera un paso más crítico para el establecimiento del modelo. Seleccionamos un lóbulo bastante aislado, el lóbulo lateral izquierdo, como el lóbulo dirigido en vivo el establecimiento modelo de perfusión quirúrgica. En cambio, el grupo de investigación de Pan había seleccionado el lóbulo inferior derecho para el modelo14. Deficiencias de la selección del lóbulo inferior derecho están como followings: en primer lugar, tuvo que comprometer totalmente bloqueando y canular la vena cava para una toma de fluidos, que puede afectar la circulación de la sangre del animal. En segundo lugar, tuvieron que bloquear y canule la vena portal principal para una entrada, que causa la isquemia de los restantes lóbulos hepáticos e hipertensión portal. En comparación con el lóbulo dirigido aquí, lóbulo lateral izquierdo, nos bloquea y canulados vena hepática lateral izquierda en lugar de la vena cava para una salida de líquido. Hemos generado una entrada de líquido mediante la selección de la izquierda de la vena porta, que tiene un diámetro bastante grande, facilitando la disección, canulación y obstrucción. Por lo tanto, se evita directamente bloqueando el flujo de sangre a la vena cava y la vena porta principal en el modelo presentado aquí, que es crítico para la supervivencia de la rata.
A pesar del gran potencial de en vivo de la perfusión del lóbulo hepático, esta técnica tiene algunas limitaciones. En primer lugar, es inevitable, debido a la obstrucción de la vena portal media izquierda durante el proceso de isquemia del lóbulo medial izquierdo. En segundo lugar, basado en el bloqueo temporal en la base del lóbulo lateral izquierdo con pinzas micro, esto puede conducir a daños del parénquima hepático que rodea la base lobular y causar inevitablemente una fuga leve durante la perfusión con solución salina heparinizada. Tres ratas experimentales que fueron sometidas a un período de perfusión de 4 horas sufrieron temporalmente de diarrea y descarga sangrienta ocular, sugiriendo que 4 horas podría ser el período de perfusión máxima de una rata sin sufrir más complicaciones. A nuestro conocimiento, por lo menos 3 horas es necesario para la descelularización de un hígado entero rata ex vivo18. Por lo tanto, las 4 horas de tiempo de perfusión que pretende lograr sería suficientes para más descelularización de lóbulo hepático, que es un requisito previo para la ingeniería de hígado por la repoblación de células de un hígado andamio.
En el futuro, esta técnica novedosa para un modelo de perfusión en vivo puede potencialmente utilizar en la investigación experimental para el tratamiento parcial del órgano por infusión de drogas, en vivo descelularización órgano parcial como resección química, como un " vivo en sistema de cultivo de células ", y posiblemente lo más importante, para en vivo órgano parcial de ingeniería.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean dar las gracias Jens Geiling desde el Instituto de Anatomía I, Hospital de la Universidad de Jena, para producir los dibujos esquemáticos de la anatomía del hígado de rata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon |
References
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