Summary
We stellen een nieuwe chirurgische techniek voor een in vivo één lever kwab perfusie model in rat als een voorwaarde voor de verdere studie van in vivo gedeeltelijke lever techniek in de toekomst.
Abstract
Orgel engineering is een nieuwe strategie voor het genereren van lever orgel substituten die potentieel kunnen worden gebruikt in de transplantatie. Onlangs, in vivo lever engineering, met inbegrip van in vivo orgel decellularization gevolgd door herbevolking, heeft ontpopt als een veelbelovende aanpak over ex vivo lever engineering. Postoperatieve voortbestaan werd echter niet bereikt. Het doel van deze studie is te ontwikkelen van een nieuwe chirurgische techniek van in vivo selectieve lever kwab perfusie bij ratten als een voorwaarde voor in vivo lever engineering. We genereren een bypass circuit alleen via de linker laterale kwab. Vervolgens is de linker kwab van laterale geperfundeerd met EDTA zoutoplossing. Het experiment wordt uitgevoerd met 4 groepen (n = 3 ratten per groep) op basis van verschillende perfusie tijden van 20 min, 2 h, 3 h en 4 h. overleven, evenals het macroscopisch zichtbare verandering van kleur en het histologisch vastberaden ontbreken van bloedcellen in het Portal triade en de blokgolven, wordt beschouwd als een indicator voor de oprichting van een succesvolle model. Na selectieve perfusie van de linker laterale kwab zien we dat de linker laterale kwab, inderdaad, van rood naar flauw geel draaide. In een histologisch beoordeling zijn geen bloed cellen zichtbaar in de tak van de portal-ader, de centrale ader en de sinusoïdes. De linker laterale kwab rood na de heropening van de geblokkeerde bloedvaten. 12/12 ratten overleefde de procedure voor meer dan een week. Wij zijn de eerste om te rapporteren een chirurgische model voor in vivo één lever kwab perfusie met een periode van lange overleving van meer dan een week. In tegenstelling tot de eerder gepubliceerde verslag, is het belangrijkste voordeel van de techniek die hier gepresenteerd dat perfusie van 70% van de lever wordt gehandhaafd gedurende de hele procedure. De oprichting van deze techniek biedt een basis voor in vivo gedeeltelijke lever engineering bij ratten, met inbegrip van decellularization en recellularization.
Introduction
De indicaties voor orgaantransplantatie zijn voortdurend uitbreiden. Daarentegen afneemt orgaan donatie tarieven en de algehele kwaliteit van organen, wat leidt tot een toenemende vraag naar protheses. Het aantal kandidaten die zijn toegevoegd aan de wachtlijst voor levertransplantatie blijven stijgen (bijvoorbeeldin de Verenigde Staten, 11,340 patiënten werden toegevoegd in 2016, vergeleken met 10,636 in 2015)1. Ondanks aanzienlijke inspanningen behoeften het aantal beschikbare organen niet klinische. Als gevolg van de verhoogde incidentie van leverziekte, worden veel patiënten met end--toneel lever ziekten sterven op de wachtlijst voor transplantatie voor een donororgaan beschikbaar. Om te voldoen aan de enorme vraag naar donor lever transplantaten, alternatieve benaderingen met behulp van leverweefsel engineering beginselen actief worden nagestreefd2. Tegenwoordig, kon een nieuw ontwikkelde biologische techniek lever ingenieurswetenschappen potentieel overwinnen dit tekort.
Lever engineering bestaat uit twee stappen: de generatie van een Acellulair steiger, gevolgd door een herbevolking van de steiger. Voor het verkrijgen van een biologische Acellulair lever steiger, is het transplanteren lever geperfundeerd via het vaatstelsel met Ionische of nonionic detergentia die aan het celmateriaal uit de lever verwijderen kunt. In de meeste eerdere studies, werd een biologische Acellulair lever steiger bereikt door perfusie van de lever met een combinatie van natrium dodecyl sulfaat en TritonX100. Dientengevolge, zijn alle cellen verwijderd, overwegende dat de structuur van de extracellulaire matrix werd gehandhaafd. Het orgel steigers werden reseeded met volwassen cellen, hepatocellulaire, evenals endothelial cellijnen en primaire hepatocyten met of zonder de gelijktijdige toepassing van endotheliale cellen of mesenchymale stamcellen (MSC). De meeste onderzoekers focus op ex vivo lever engineering3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Echter in de meeste eerdere studies, waren slechts kleine stukjes van nieuwe steiger kubussen in verschillende heterotopic implantatie sites getransplanteerd. In een paar studies, waren gedeeltelijke nieuwe steigers getransplanteerde als een ondersteunende graft. De maximale gerapporteerde overlevingstijd was echter slechts 72 h8,14. As far as we know, is orthotopic transplantatie van een nieuwe volledige lever transplantatie nog niet uitgevoerd of gepubliceerd over. De lange termijn functie en -transplantatie van gemanipuleerde organen zijn nog in de kinderschoenen. Daarom is een alternatieve aanpak ex vivo lever techniek noodzakelijk.
In vivo lever engineering kan vertegenwoordigen een alternatief voor het bestuderen van hepatische herbevolking onder fysiologische omstandigheden. De voordelen van in vivo lever engineering in vergelijking met ex vivo lever engineering zijn spruitstuk. De in vivo herbevolkt gedeeltelijke lever steiger is onderworpen aan fysiologische bloedverspreiding met de juiste temperatuur, voldoende zuurstof, voedingsstoffen en groeifactoren in tegenstelling tot ex vivo perfusie met kunstmatige kweekmedium. Daarnaast onderhoudt de resterende gedeeltelijke normale lever de lever functie, voornamelijk waardoor voortbestaan op lange termijn. Aangezien een geïmplanteerde ex vivo ontworpen lever transplantatie nog steeds niet in staat is om het voortbestaan van de proefdieren door de leverfunctie8, wij voorzien dat in vivo gedeeltelijke lever engineeringwould uiteindelijk worden een veelbelovende model de evolutie van gemanipuleerde levers met langere overleving opmerkingen dan ex vivoverder te bestuderen.
Onlangs, een onderzoeksgroep (Pan en collega's) ingediend, voor de eerste keer, een techniek van in vivo lever engineering15. Ze bereikt de geïsoleerde perfusie van het recht inferieur lever kwab bij levende ratten ondanks anatomische en technische uitdagingen. Zij rapporteerde de eerste intraoperatieve resultaten van in vivo herbevolking met behulp van een rat primaire hepatocyte cellijn. Echter het in vivo chirurgische perfusie model van Pan et al. heeft nadelen. Ze bereikt één lever kwab perfusie bij ratten ten koste van de ader van de portal en de vena cava inferior, die ernstige schade aan het dier veroorzaken kunnen volledig te blokkeren. De experimentele ratten werden opgeofferd na slechts 6 uur van intraoperatieve observatietijdstip. Daarom moet de in vivo lever kwab perfusie techniek verder worden verbeterd om postoperatieve overleven.
We ontwikkelden een roman voortbestaan model voor in vivo lever kwab perfusie, gebaseerd op eerdere studies van de hepatische anatomie van rat16, de portal vein cannulation techniek voor de hemodynamische bewaking in muizen17, en lever bioengineering 18 , 19. de belangrijkste stappen voor de procedure worden geïllustreerd in figuur 1A - 1E.
Deze techniek is geschikt voor diegenen die willen deze experimentele in vivo perfusie model voor fundamenteel onderzoek op gedeeltelijke orgel behandeling door infusie met drugs, in vivo decellularization gebruiken als een chemische resectie voor orgel ziekten (bv , leverkanker), in vivo de cultuur van de cel in een decellularized matrix vergelijken ex vivo twee-dimensionale en drie-dimensionale cel cultuur systemen20,21,22,23 , 24 , 25 , 26en in vivo lever engineering door decellularization en herbevolking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De behuizing en alle procedures uitgevoerd in overeenstemming waren met het welzijn van de Duitse wetgeving. Alle gaas, bekleding kleren en chirurgische instrumenten zijn gesteriliseerde met autoclaaf en bereid vóór de bewerking. Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.
1. voorbereiding van de Rat van de chirurgische ingreep.
- Plaats de rat in een zaal van de inductie en anesthetize van de rat met 4% verdampt Isofluraan en 100% zuurstof op 0.5 L/min gedurende ongeveer 3 minuten, totdat de rat is volledig verdoofd.
- De rat uit de kamer van de inductie en meten van zijn lichaamsgewicht.
- Scheren van de vacht van het chirurgische gebied op de buik.
- Plaats het dier terug in de bedwelmingsruimte Isofluraan voor een extra 2 min te verdiepen van de verdoving.
- Plaats de rat op de operatie tafel in liggende positie.
- De verdoving masker positiebepaling naar de regio van de mond van de rat en houd het dier verdoofd met een continue gasstroom van 2% verdampt Isofluraan en 100% zuurstof bij een debiet van 0.5 L/min.
- Het herstellen van de ledematen met stukken van tape.
- Dierenarts zalf toepassen op beide ogen om te voorkomen dat droogte.
- Beheren van buprenorfine 0,05 mg/kg subcutaan, om pijn te verlichten tijdens de operatie.
- Desinfecteer het chirurgische gebied van de buik met 3 rondes van jodium tinctuur gevolgd door 2 rondes van 70% alcohol.
- Plaats gesteriliseerd gaas rond het gebied waar de incisie wordt gemaakt alleen verlaten het gebied van de werking van de buik blootgesteld.
- Ga verder met het uitvoeren van de bewerking wanneer de reflex teen-snuifje terugtrekking van de rat afwezig is.
2. laparotomie van de Rat
- Het maken van een transversale buik huid en spier incisie met schaar en een elektrische coagulator.
- Los en trek de xiphoid process richting het hoofd met behulp van een 4-0 polypropyleen hechtdraad.
Opmerking: Let op til de xiphoid proces verticaal beter bloot de lever, maar behoedzaam om ernstige respiratoire beperking en verstikking te voorkomen. - Open de peritoneale holte door beide zijden van de buik muren naar het hoofd met twee subcostal haken bloot van de lever te trekken.
- Dekking van de twaalfvingerige darm en dunne darm in de buikholte met een bevochtigde gaas om te voorkomen dat het drogen.
- Links en rechts mediaan lobben verheffen met behulp van een bevochtigde gaas en houd ze tegen de thorax naar betere bloot de Hilus van de lever.
- Plaats de rat onder een stereomicroscoop (8 X vergroting).
- Drop enkele warme zoutoplossing in de buik en op het oppervlak van de lever en de darmen elke enkele minuten, om te voorkomen dat het drogen tijdens de hele procedure.
3. oprichting van een Bypass Passage binnen de linker laterale kwab
- De linker portal vein ontleden en het afbinden met een 6-0 zijde Sutuur (geologie) op het honk (figuur 2A).
- Blokkeren de linker hepatische slagader, de linker gal duct samen met de linker mediaan portal ader, de linker mediaan hepatische slagader en de linker mediaan gal koker met micro klemmen om te voorkomen dat een stroom van het perfusaat de linker mediaan kwab (figuur 2B).
- Scheid de linker laterale kwab door het afsnijden van de omringende ligamenten van de kwab met micro schaar.
- Blokkeren de linker laterale hepatische ader door klemmen aan de voet van de linker laterale kwab met micro klemmen (figuur 2C).
Opmerking: Zorg ervoor dat u niet per ongeluk de linker portal vein evenals klem. - Gebruik mug klemmen te houden van de ligatuur van de linker portal-ader en houd de ader met de juiste spanning voor de latere cannulation.
- Zorgvuldig maken een insnijding in de voorgevel van de linker portal ader door het prikken met een 24-G naald-woning katheter ( figuur 3A).
Opmerking: Als u wilt maken een bypass, vasculaire toegangspunten op de linker portal-ader en de linker hepatische ader nodig zijn. Voor deze stap, bij voorkeur wordt maken de vasculaire toegang door de schepen prikken met een naald eerder dan het maken van een grotere snede met behulp van schaar. Dit vermindert het risico van bloeden en later stenose. - Trekken van de katheter en neem de naald uit de katheter te verkrijgen van een naald-vrij 24-G-katheter.
- De katheter te verbinden door een buis perfusie, van die het andere eindpunt verbinding maakt met een 20-mL injectiespuit met 15 mL 40 U/mL EDTA zoutoplossing op een pomp perfusie.
- De pomp voor de buis om lucht uit uit de buis en de naald-vrije katheter zoogdierlevercellen inschakelen.
- Uitschakelen van de perfusie-pomp.
- Nogmaals, invoegen de naald-vrije katheter de linker portal vein via de geperforeerde incisie op de ader (figuur 3B).
Opmerking: Als gevolg van het feit is er zeer beperkte ruimte voor de vaststelling van de katheter, het is op dit punt niet vast. Daarom, de chirurg zorg moet gebruiken om te voorkomen dat de verplaatsing van de gecanuleerde katheter. - Zorgvuldig maken nog een insnijding in de marge van het blootgestelde gebied van de linker laterale hepatische ader door het prikken met een 22 - of 24-G naald-woning katheter (Figuur 3 c).
Opmerking: Het wordt aanbevolen dat de katheter iets kleiner is dan het schip. - Trekken van de katheter en neem de naald uit de katheter te verkrijgen van een naald-vrij 22-G-katheter.
- Zet de perfusie pomp perfuse EDTA zoutoplossing in de linker laterale kwab via de 24-G gecanuleerde naald-vrije katheter van de linker ader van het portaal op een debiet van 0,5 mL/min.
- Gebruik droog gaas om te absorberen uit vloeiende afval vloeistof rond het gebied van de insnijding van de linker laterale hepatische ader.
- Cannulate de linker laterale hepatische ader via de geperforeerde insnijding van de ader met de 22-G naald-vrije katheter, voor het genereren van een vloeistof stopcontact om het minimaliseren van intra-abdominale besmetting (figuur 3D).
Opmerking: Het is technisch moeilijk op te lossen de gecanuleerde katheter naar de lever kwab. Daarom moet de chirurg aandacht om te voorkomen dat de verplaatsing van de katheter. Als alternatief, zonder cannulation van de linker laterale hepatische ader met een katheter, afval vloeistof kan ook worden opgevangen in de regio van de insnijding van de ader alleen met een droog gaas. - Houd de linker laterale kwab met EDTA saline voor ongeveer 20 min (groep 1) zoogdierlevercellen en dan alleen met zoutoplossing voor 2 h, 3 h of 4 h (groep 2, groep 3 en groep 4, respectievelijk).
- Uitschakelen van de pomp om te stoppen met de perfusie.
4. fysiologische reperfusie van de linker laterale kwab
- Beide katheters vanuit de linker portal-ader en de linker laterale hepatische ader opstijgen.
- Sluit de insnijding van de linker portal ader met een 11-0 polyamide hechtdraad.
- Sluit de insnijding van de linker laterale hepatische ader met een 11-0 polyamide hechtdraad ook.
- Unclamp de linker laterale hepatische ader.
- Unclamp de linker mediaan portal vein, linker gal duct en linker hepatische slagader.
- De ligatuur die op de linker portal ader te heropenen van de ader afgesneden.
5. sluiting van de buikwand
- Sluit de laag van de spieren van de buikwand door onderbroken wordt met een 4-0 absorbeerbare polyglactin 910 hechtdraad.
- Sluit de huidlaag van de buikwand door onderbroken wordt met een 4-0 absorbeerbare polydioxanone hechtdraad.
- Na het sluiten van de buik, Desinfecteer de huid incisie met 70% alcohol.
6. postoperatieve behandeling van de Rat
- Plaats het dier op een opwarming pad voor reanimatie voor ongeveer 10 minuten en zet het dan in een nieuwe kooi.
- Beheren van buprenorfine 0,05 mg/kg subcutaan 2 x per dag voor een opeenvolgende 3 d postoperatief pijn vrij te laten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Twaalf man (leeftijd 12 - 13 weken) Lewis ratten werden gebruikt voor het beoordelen van het effect van selectieve lever kwab perfusie. Het experiment werd uitgevoerd in vier groepen (n = 3 ratten per groep). Met behulp van verschillende perfusie periodes van 20 minuten, bereikt 2 uur, 3 uur en 4 uur, na de stappen die hierboven beschreven, we met succes in vivo één kwab perfusie.
In Vivo Perfusie van de linker laterale kwab:
De nauwkeurige anatomische identificatie van de linker portal-ader en de linker laterale hepatische ader en de succesvolle links portal vein en links laterale hepatische veneuze cannulation kan worden bevestigd na perfusie met EDTA zoutoplossing. De eerste indicator van een succesvolle identificatie en cannulation was de waarneming dat bloed gemengd met perfusaat was stroomt uit de linker laterale kwab via de vloeistof outlet (figuur 4A). De succesvolle chirurgische perfusie-model werd verder bevestigd door het observeren van de verandering van de linker laterale kwab kleur na de perfusie met EDTA zoutoplossing. De kleur van de linker laterale kwab veranderd van knalrood tot flauw geel, met vermelding van de verwijdering van het bloed van de linker laterale kwab. Om te bevestigen het onderhoud van de fysiologische perfusie van de resterende lobben, was de kleur van de resterende lever lobben voortdurend geobserveerd gedurende de perfusie van de linker laterale kwab. De juiste perfusie van de linker laterale kwab resulteerde in de kwab flauw geel draaien terwijl de resterende lever lobben hun heldere rode kleur tijdens het hele proces (figuur 4B onderhouden).
Fysiologische reperfusie van de linker laterale kwab:
Om te beoordelen de bij van de gecanuleerde vaartuigen na afsluiting van de insnijdingen van de vaartuigen en de heropening van de schepen, werd de kleurverandering van de linker laterale kwab waargenomen. Een paar rode plekken verscheen op het oppervlak van de perfused flauw geel links laterale kwab na de heropening van de linker laterale hepatische ader, met vermelding van eerste retrograde perfusie in de linker laterale kwab (figuur 5A). Het oppervlak van de gerichte kwab later toonde zelfs meer rode vlekken na het loslaten van de micro klemmen van de linker hepatische slagader, gal duct links, en links mediaan portal vein, impliceren verder fysiologische perfusie van de linker laterale kwab via de heropende schepen (figuur 5B). Het oppervlak van de gerichte lever kwab draaide donkerrood na de heropening van de linker portal ader, waarin wordt bevestigd dat de gerichte lever kwab haar volledige fysiologische perfusie via de linker portal vein (figuur 5C herwonnen).
Histologie van de Perfused links laterale kwab:
Na afwerking EDTA zout of de zoutoplossing perfusie, de selectief perfused linker laterale kwab (als experimenteel) en de normale inferieur Spiegelse kwab (als besturingselement) waren gereseceerd en vaste met formaldehyde en vervolgens onderworpen aan een histopathologisch onderzoek (H & Estaining). In de linker laterale kwab zijn er geen voor de hand liggende bloedcellen zichtbaar in de tak van de portal vein, blokgolven en centrale ader. Zoals verwacht, waren de rode bloedcellen zichtbaar in de tak van de hepatische slagader (figuur 6A en 6 C). In de normale inferieur Spiegelse kwab (als besturingselement), werden bloedcellen aanzienlijk waargenomen in de tak van de portal-ader, de sinusoïdes en de centrale ader (figuur 6B en 6 D).
Overlevingskansen:
Twaalf van de twaalf experimentele ratten resulteerde in een 1-weekse overlevingspercentage van 100%. Echter, 3 experimentele ratten die 4 uur van perfusie onderging tijdelijk last van diarree en bloedige kwijting van de ogen op de tweede of derde dag postoperatief.
Figuur 1 : Regeling van de chirurgische in vivo één lever kwab perfusie model. (A) Dit is een schematische tekening van de rat lever anatomie. ()B) dit paneel toont de blokkade van de linker portal ader, de linker hepatische slagader, de linker gal buis, de linker mediaan portal ader en de linker laterale hepatische ader. (C) dit paneel toont de cannulation van de linker portal-ader en de linker laterale hepatische ader met katheters voor vloeibare inlaat en uitlaat. (D) dit paneel toont de perfusie van de linker laterale kwab met EDTA zoutoplossing door een pomp perfusie. (E) dit paneel toont de fysiologische reperfusie van de linker laterale kwab na de heropening van de geblokkeerde schepen aan de kwab. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Intraoperatieve afbeeldingen tonen de blokkade van de vaartuigen leveren en zuig de linker laterale kwab. (A) dit paneel toont de afbinding van de linker portal ader. (B) dit paneel toont de blokkade van de linker hepatische slagader, de linker buis van gal en de linker mediaan portal vein/hepatische slagader/gal koker met micro klemmen. (C) dit paneel toont de blokkade van de linker laterale hepatische ader met micro klemmen (witte pijl). De schaal bars zijn 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Intraoperatieve afbeeldingen tonen de rondweg omloop door de linker laterale kwab. (A) dit paneel toont de incisie in de linker portal vein (witte pijl) door het prikken met een 24-G naald-woning katheter. (B) dit paneel toont de cannulation van de linker portal ader voor een vloeistof inlaat met een 24-G naald-vrije katheter (witte pijl). (C) dit paneel toont de incisie in de linker laterale hepatische ader (witte pijl) door het prikken met een 22-G naald-woning katheter. (D) dit paneel toont de cannulation van de linker laterale hepatische ader voor een vloeistof outlet met een 22-G naald-vrije katheter (witte pijl). De schaal bars zijn 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Intraoperatieve afbeeldingen tonen perfusie van de linker laterale kwab. (A) dit paneel toont perfusaat stroomt in de linker laterale kwab via de inlaat (gele katheter) en stroomt uit de linker laterale kwab via het stopcontact (blauwe katheter). De linker laterale kwab was, inderdaad, selectief geperfundeerd, zoals blijkt uit de kleur wijzigen van de kwab (witte pijl). (B) Opmerking de kleurverandering van de linker laterale kwab voor flauw geel na de perfusie met EDTA saline, terwijl de resterende lever kwabben blijven knalrood (witte pijlen). De schaal bars zijn 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Fysiologische reperfusie van de linker laterale kwab. (A) dit paneel toont de retrograde perfusie van de linker laterale kwab na de heropening van de linker laterale hepatische ader (witte pijl). (B) dit paneel toont de fysiologische reperfusie links laterale kwab (witte pijl) na het loslaten van de micro op de linker mediaan portal ader en de linker hepatische slagader klemmen. (C) dit paneel toont de volledige reperfusie van de linker laterale kwab (rode pijl) na de heropening van de linker portal-ader en de ischemie van de linker mediaan kwab (blauwe pijl). De schaal bars zijn 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Histologische evaluaties (H & E kleuring). (A en C) deze panelen tonen een histologische beoordelingvan de heparine-saline-geperfundeerd links laterale kwab (experimentele kwab) aan te tonen het ontbreken van bloedcellen in ()A) de portal vein blokgolven, en (C) de centrale ader. (A) rode bloedcellen zijn echter zichtbaar in de hepatische slagader (zwarte pijl) zoals verwacht. (B en D) deze panelen tonen een histologische beoordeling van de normale inferieur Spiegelse kwab (control) onthullen de aanwezigheid van cellen van het bloed in alle vasculaire structuren: portal vein, hepatische slagader en sinusoïdes (zwarte pijlen), (B) en (D) centraal veneuze (zwarte pijl). De schaal bars zijn 250 µm.
| Parameters | Resultaten | |
| Onderzoeksgroep | Pan et al. 2016 [15] | Eigen groep |
| In vivo | Ja | Ja |
| Doel lever kwab | Rechts inferieur kwab
|
Linker laterale kwab
|
| Verstopping van de vena cava en belangrijkste portal vein | Ja
|
No
|
| Ischemie van de resterende kwabben | Ja | Alleen linker kwab van de mediaan |
| Cannulation vena cava | Ja | No |
| Cannulation van belangrijkste portal vein | Ja | No |
| Portal hypertensie | Ja | No |
| 1 week overlevingskans | Geofferd en | 100% |
Tabel 1. Vergelijking tussen de verschillende modellen van in vivo Lever engineering. Deze tabel toont kritische verschillen in de inrichtingen van de twee model tussen Pan et al. 15 en onze onderzoeksgroep.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Door blokkeren en cannulating de linker portal ader met een katheter als een vloeistof inlaat en de linker laterale hepatische ader met een katheter als een vloeistof outlet, we met succes hebben gemeld een in vivo vloeistof bypass binnen de linker laterale kwab, waaruit blijkt dat Hoewel de techniek zeer uitdagend vanwege de geringe omvang van de schepen voor cannulation en een hoog risico is veroorzaken bloedingen, is het haalbaar. Zelfs de ratten in een periode van lange perfusie van 4 uur overleefde ten minste 1 week, waaruit blijkt dat de ratten deze chirurgische ingreep kon tolereren.
In de volgende sectie beschrijven we de drie meest technisch moeilijk en kritische stappen en hoe succesvol kapitein hen. Ten eerste, in het proces van scheiding en Afbinding van de linker portal ader, vanwege de nauwe ruimtelijke relatie van de gerichte portal vein met het omringende parenchym lever, isolatie van het schip heeft een hoog risico veroorzaakt bloeden. Wij adviseren gebruikend micro pincet in plaats van schaar te scheiden van de linker portal ader, door zorgvuldig verscheurt het aangesloten avasculaire weefsel rondom de linker portal ader. Anderzijds in termen van de insnijding op de voorgevel van de linker portal ader, kan een oversize insnijding op de voorgevel van de linker portal ader verhogen de moeilijkheid van de incisie reparatie en de kans op waardoor stenose na vasculaire anastomose. Het is raadzaam om met behulp van een katheter naald-woning in plaats van schaar voor het maken van een juiste afmeting incisie. Ten derde, met betrekking tot de blokkade van de linker laterale hepatische ader, als de blootgestelde regio van de linker laterale hepatische ader ten onrechte is geblokkeerd, zal er niet voldoende ruimte op de linker laterale hepatische ader voor latere cannulation blootgesteld. Het is raadzaam om dat de klemmen dicht bij de linker kwab van mediaan in plaats van in het midden van de blootgestelde regio van de linker laterale hepatische ader moet worden uitgevoerd.
We vergelijken de twee modellen van selectieve in vivo lever perfusie tussen Pan et al. 15 en ons (tabel 1). Ten eerste, de selectie van de gerichte lever kwab wordt beschouwd als een meest cruciale stap voor de totstandbrenging van het model. We een eerder geïsoleerde lobe, de zijdelingse linker kwab, geselecteerd als de gerichte kwab verantwoordelijkzijnvoor in vivo chirurgische perfusie model. De onderzoeksgroep van Pan geselecteerd daarentegen het recht inferieur kwab voor het model14. Tekortkomingen van het selecteren van de juiste inferieur kwab zijn als de volgende: ten eerste, ze moesten door volledig blokkeren en cannulating van de vena cava voor een vloeistof outlet, die negatief effect op de bloedsomloop van het dier hebben kan in gevaar brengen. Anderzijds moesten ze blokkeren en cannulate de belangrijkste ader van de portal voor een inham, waardoor ischemie van de resterende lever lobben en portal hypertensie. In vergelijking met de kwab gericht hier, de linker kwab van laterale, we geblokkeerd en gecanuleerd links laterale hepatische ader in plaats van de vena cava voor een vloeistof outlet. We genereerden een vloeistof inlaat door het selecteren van de linker portal ader, die een vrij grote diameter heeft, dissectie, blokkade, en cannulation te vergemakkelijken. Daarom wordt direct blokkeren de bloedtoevoer naar de vena cava en de belangrijkste ader van de portal vermeden in het model gepresenteerd hier, dat is van cruciaal belang voor het voortbestaan van de rat.
Ondanks het groot potentieel voor in vivo lever kwab perfusie kent deze techniek een aantal beperkingen. Ten eerste, ischemie van de linker mediale kwab is onvermijdelijk, als gevolg van de blokkade van de linker mediaan portal vein tijdens het proces. Ten tweede, op basis van de tijdelijke blokkade aan de voet van de linker laterale kwab met behulp van micro klemmen, dit kan leiden tot beschadiging van de lever parenchym rondom de lobar base en onvermijdelijk leiden tot een lichte lekkage tijdens de perfusie met EDTA zoutoplossing. Drie experimentele ratten die werden onderworpen aan een periode van de perfusie van 4 uur te lijden tijdelijk diarree en bloedige oogbeschadigingen en/of kwijting, suggereren dat 4 uur zou de maximale perfusie-periode voor een rat zonder lijden meer complicaties. Om onze kennis is ten minste 3 uur vereist voor de decellularization van een hele rat lever ex vivo18. Dus zou de 4 uur van perfusie tijd die wij wilden bereiken voldoende zijn voor verdere lever kwab decellularization, dat is een voorwaarde voor lever techniek door cel herbevolking van een lever steiger.
In de toekomst, kan deze nieuwe techniek voor een in vivo perfusie model potentieel worden gebruikt in experimenteel onderzoek voor gedeeltelijke orgel behandeling door infusie met drugs, in de in vivo gedeeltelijke orgel decellularization als chemische resectie, als een "- in vivo cel cultuur systeem ", en, eventueel, vooral voor in vivo gedeeltelijke orgel engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Jens Geiling van de Instituut van Anatomie I, Jena universitair ziekenhuis, voor de productie van de schematische tekeningen van rat lever anatomie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon |
References
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
