Summary
نقوم بإنشاء تقنية جراحية رواية لنموذج نضح فص كبد واحد في فيفو في الفئران كشرط مسبق لمواصلة دراسة في فيفو الكبد الجزئي الهندسية في المستقبل.
Abstract
هندسة الجهاز هو استراتيجية رواية لإنشاء جهاز الكبد البدائل التي يمكن أن تستخدم في زرع الأعضاء. في الآونة الأخيرة، في فيفو الكبد الهندسية، بما في ذلك في فيفو الجهاز ديسيلولاريزيشن تليها إعادة تعمير، برزت نهجاً واعداً أكثر السابقين فيفو الكبد الهندسة. ومع ذلك، لم يتحقق البقاء على قيد الحياة بعد العملية الجراحية. الهدف من هذه الدراسة تطوير تقنية جراحية رواية من فيفو نضح انتقائية فص الكبد في الفئران كشرط مسبق للهندسة في فيفو الكبد. ونحن توليد تجاوز دائرة إلا من خلال الفص الجانبي الأيسر. ثم، هو perfused الفص الجانبي الأيسر مع هيبارينيزيد المالحة. يتم إجراء التجربة مع أربع مجموعات (n = 3 الفئران كل مجموعة) استناداً إلى أوقات مختلفة نضح 20 دقيقة، ح 2، ح 3، وحاء 4 البقاء على قيد الحياة، فضلا عن تغيير لون الميكروسكوب مرئية وغياب العزم الأشيع من خلايا الدم في ثالوث المدخل والكبدية، تؤخذ كمؤشر لإنشاء نموذج ناجح. بعد نضح الانتقائي للفص الجانبي الأيسر، نلاحظ أن الفص الجانبي الأيسر، الواقع، تحولت من اللون الأحمر إلى أصفر باهت. وفي تقييم النسيجي، لا خلايا الدم مرئية في الفرع في الوريد البابي والوريد المركزي وفي الجيوب. الفص الجانبي الأيسر أحمرا بعد إعادة فتح الأوعية المحجوبة. نجا 12/12 الفئران الإجراء لأكثر من أسبوع واحد. ونحن الأول من يقدم نموذجا جراحية في فيفو نضح فص كبد واحد بفترة طويلة البقاء على قيد الحياة لأكثر من أسبوع واحد. على عكس التقرير المنشور سابقا، أهم ميزة لهذه التقنية المقدمة هنا أن الحفاظ على التروية 70 ٪ من الكبد في جميع أنحاء الإجراء بأكمله. إنشاء هذا الأسلوب يوفر أساسا في فيفو جزئي الهندسة الكبد في الفئران، بما في ذلك ديسيلولاريزيشن وريسيلولاريزيشن.
Introduction
المؤشرات لزرع آخذة في التوسع باستمرار. وفي المقابل، معدلات التبرع بالجهاز والجودة الشاملة للأجهزة آخذة في الانخفاض، مما أدى إلى زيادة طلب على الطعوم. واستمر عدد المرشحين إضافة إلى قائمة الانتظار لعملية زرع كبد لزيادة (مثلاً، في الولايات المتحدة، وأضيفت المرضى 11,340 في عام 2016، مقارنة مع 10,636 في عام 2015)1. وعلى الرغم من جهود كبيرة، على عدد الأجهزة المتوفرة لا تلبي الاحتياجات السريرية. بسبب ازدياد نسبة الإصابة بأمراض الكبد، تتوفر العديد من المرضى مع نهاية مرحلة من أمراض الكبد يموت على قائمة الانتظار لزرع قبل جهازا مانحة. لتلبية الطلب الهائل ترقيع المانحة الكبد، اتباع نهج بديلة باستخدام أنسجة الكبد مبادئ الهندسة يجري بنشاط2. في الوقت الحاضر، تقنية بيولوجية المطورة حديثا للهندسة الكبد يمكن أن يحتمل أن التغلب على هذا النقص.
هندسة الكبد يتكون من خطوتين: توليد سقالة اللاخلوي، متبوعاً بتعمير من السقالة. للحصول على سقالة كبد اللاخلوي بيولوجية، هو الكبد اكسبلانتيد perfused عبر نظام الأوعية الدموية مع المنظفات الأيونية أو النطاق، يمكن إزالة المواد الخلوية من الكبد. في معظم الدراسات السابقة، قد حققت سقالة كبد اللاخلوي بيولوجية نضح الكبد مع مزيج من دوديسيل كبريتات الصوديوم و TritonX100. كنتيجة لذلك، تم إزالة كافة الخلايا، بينما أبقى على هيكل المصفوفة خارج الخلية. وقد ريسيديد السقالات الجهاز مع خلايا ناضجة وسرطانه الخلية، فضلا عن خطوط الخلايا البطانية، وخلايا الكبد الأولية مع أو بدون التطبيق المتزامن لخلايا بطانية أو الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC). معظم الباحثين تركز على السابقين فيفو الكبد الهندسية3،4،5،6،،من78،9،10، 11،12،،من1314. ومع ذلك، في معظم الدراسات السابقة، تم زرع فقط من القطع الصغيرة من مكعبات سقالة repopulated في مواقع مختلفة من زرع هيتيروتوبيك. في عدد قليل من الدراسات، تم زرع السقالات repopulated الجزئية كالابتزاز مساعدة. ومع ذلك، كان الوقت بقاء المبلغ الأقصى8،ح 72 فقط14. وبقدر ما نعلم، زرع أورثوتوبيك من طعم كبد كامل repopulated لم تم تنفيذها أو نشرت حول. مهمة طويلة الأجل وزرع الأعضاء هندسيا لا تزال في مراحلها الأولى. ولذلك، هناك حاجة إلى نهج بديل للهندسة السابقين فيفو الكبد.
الهندسة في فيفو الكبد قد تمثل بديلاً لدراسة إعادة تعمير الكبد تحت الظروف الفسيولوجية. وتتعدد مزايا في فيفو الكبد الهندسة مقارنة ب السابقين فيفو الكبد الهندسة. في فيفو repopulated الجزئي الكبد سقالة يخضع التروية الدموية الفسيولوجية مع درجة حرارة مناسبة وكافية الأوكسجين والمغذيات وعوامل النمو على عكس السابقين فيفو التروية مع الاصطناعية الثقافة المتوسطة. وعلاوة على ذلك، يحتفظ الكبد العادي الجزئية المتبقية وظيفة الكبد، أساسا السماح ببقاء على المدى الطويل. منذ ما زالت عاجزة عن الحفاظ على بقاء على المدى الطويل من الحيوانات التجريبية التي لها وظيفة الكبد8مزروع السابقين فيفو هندسيا كبد الاختلاس، نحن نتصور أن في فيفو الجزئي الكبد انجينيرينجوولد تصبح في نهاية المطاف نموذج واعدة مزيد من الدراسة تطور كبد هندسيا مع الملاحظات البقاء على قيد الحياة أطول من السابقين فيفو.
مؤخرا، قدمت مجموعة بحوث (عموم والزملاء)، للمرة الأولى، تقنية في فيفو الكبد الهندسة15. أنهم حققوا نضح معزولة من الفص الكبد أدنى حق في الفئران الحية على الرغم من التحديات التشريحية والتقنية. وأفادوا بالمضاعفات والنتائج الأولى لتعمير في فيفو على استخدام خط خلية الأولية تتمثل الفئران. ومع ذلك، نموذج نضح الجراحية في فيفو لعموم et al. له العيوب. أنهم حققوا نضح واحد فص الكبد في الفئران على حساب حجب تماما بالوريد البابي وأدنى الوريد الأجوف، مما قد يسبب أذى شديدا للحيوان. كانت التضحية الفئران التجريبية بعد 6 ساعات فقط من وقت الملاحظة الموضعية. ولذلك، تقنية التروية فص الكبد في فيفو يحتاج إلى مزيد من التحسين لتحقيق البقاء على قيد الحياة بعد العملية الجراحية.
قمنا بتطوير نموذج رواية البقاء على قيد الحياة في فيفو نضح فص الكبد، استناداً إلى الدراسات السابقة لتشريح الفئران16، تقنية cannulation الوريد البابي لرصد الفسيولوجية في الفئران17، والهندسة الحيوية الكبد الكبد 18 , 19-الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء موضحة في الشكل 1A - 1E.
هذا الأسلوب مناسبة لأولئك الذين يريدون استخدام هذا النموذج نضح التجريبية في فيفو للبحوث الأساسية بشأن معاملة الجهاز الجزئي بالحقن بالمخدرات، و في فيفو ديسيلولاريزيشن بتر كيميائية لأمراض الجهاز (مثلاً ، سرطان الكبد)، في فيفو ثقافة الخلية في مصفوفة ديسيلولاريزيد مقارنة السابقين فيفو ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد خلية ثقافة نظم20،21،،من2223 , 24 , 25 , 26، و في فيفو الكبد الهندسية التي ديسيلولاريزيشن وإعادة تعمير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كانت الإسكان وجميع الإجراءات المنفذة وفقا للتشريع الألماني الرفق بالحيوان. كل شاش وتغطي الملابس والأدوات الجراحية يعقم والمعدة قبل العملية. تنفذ جميع الإجراءات تحت ظروف معقمة.
1. إعداد الفئران للعملية الجراحية
- وضع الفئران في دائرة للاستقراء وتخدير الفئران مع إيسوفلوراني 4% ويتبخر والأكسجين 100% في 0.5 لتر في الدقيقة لحوالي 3 دقيقة، حتى يتم تخديره تماما من الفئران.
- إخراج الفئران من قاعة الاستقراء وقياس وزن الجسم.
- يحلق الفراء منطقة العمليات الجراحية في البطن.
- ضع الجزء الخلفي الحيوان في غرفة isoflurane مين 2 إضافية لتعميق التخدير.
- وضع الفئران في الجدول العملية في موقف ضعيف.
- تحديد قناع التخدير إلى منطقة الفم في الفئران والحفاظ على الحيوان تخديره مع تدفق غاز مستمر إيسوفلوراني 2% ويتبخر والأكسجين 100% بمعدل تدفق 0.5 لتر في الدقيقة.
- إصلاح أطرافه مع قطعة من الشريط.
- تطبيق مرهم البيطرية في كلتا العينين لمنع جفاف.
- إدارة البوبرينورفين 0.05 مغ/كغ تحت الجلد، لتخفيف الألم أثناء فترة العملية.
- تطهير ميدان العمليات الجراحية للبطن مع 3 جولات من صبغة اليود تليها جولات 2 من الكحول 70%.
- مكان تعقيم الشاش حول المنطقة حيث ستبذل الشق فقط ترك مجال عملية البطن مكشوف.
- المضي قدما لإجراء العملية عند غائب منعكس سحب إصبع القدم-رشة من الفئران.
2-فتح البطن للفئران
- جعل شق الجلد والعضلات البطن عرضية باستخدام مقص وكواجولاتور كهربائية.
- الإصلاح وسحب العملية الرهابه تجاه الرأس استخدام خياطة البوليبروبيلين 4-0.
ملاحظة: إيلاء اهتمام لرفع عملية الرهابه عمودياً لفضح أفضل في الكبد، ولكن المتابعة مع توخي الحذر لتجنب تقييد شديد في الجهاز التنفسي والاختناق. - فتح التجويف البريتوني عن طريق سحب كلا الجانبين من جدران البطن نحو رأسه بخطافات سوبكوستال اثنين لفضح الكبد.
- تغطية الإثني عشر والأمعاء الدقيقة في تجويف البطن مع شاش ترطب لتجنب التجفيف.
- أرفع الفصوص اليسار واليمين الوسط باستخدام شاش ترطب وعقد لهم ضد الصدر لفضح أفضل هيلم الكبد.
- مكان الفئران تحت ستيريوميكروسكوبي (8 X التكبير).
- إسقاط بعض الملحية الدافئة في البطن وعلى سطح الكبد والأمعاء كل عدة دقائق، لمنع تجفيف أثناء الإجراء بأكمله.
3. إنشاء ممر الالتفافية داخل الفص الجانبي الأيسر
- تشريح الوريد البابي الأيمن واضطر أنه مع خياطة حرير 6-0 في القاعدة (الشكل 2A).
- كتلة الشريان الكبدي الأيسر، والقناة الصفراوية الأيسر إلى جانب الوريد البابي الوسط الأيسر والشريان الكبدي الوسط الأيسر، والقناة الصفراوية الوسط الأيسر مع المشابك الصغيرة لمنع تدفق بيرفوساتي إلى الفص المتوسط الأيسر (الشكل 2).
- فصل الفص الجانبي الأيسر بقطع الأربطة المحيطة للفص بالمقص الصغير.
- كتلة الوريد الكبدي الجانبي الأيسر لقط في قاعدة الفص الجانبي الأيسر مع المشابك الصغيرة (الشكل 2).
ملاحظة: تأكد من عدم المشبك الوريد البابي الأيسر، وكذلك عن طريق الخطأ. - استخدام المشابك البعوض اضغط حرف مزدوج الوريد البابي الأيمن والحفاظ على المنوال مع التوتر السليم ل cannulation لاحقاً.
- بعناية تجعل شق في الجدار الأمامي من الوريد البابي الأيسر بثقب مع قسطرة إبرة مسكن 24-ز ( الشكل 3A).
ملاحظة: لإنشاء تجاوز، هناك حاجة نقاط وصول الأوعية الدموية في الوريد البابي الأيمن والوريد الكبدي الأيسر. لهذه الخطوة، ومن المفضل إنشاء وصول الأوعية الدموية بثقب السفن بإبرة بدلاً من إجراء شق أكبر باستخدام مقص. وهذا يقلل من خطر تضيق النزيف والإصدارات الأحدث. - سحب القسطرة وتأخذ الإبرة خارج القسطرة للحصول على قسطرة خالية من إبرة 24-ز.
- الاتصال القسطرة بأنبوب نضح، ومن الذي يربط نقطة النهاية الأخرى لحقنه 20 مل مع 15 مل 40 هيبارينيزيد U/mL المالحة في مضخة التروية.
- قم بتشغيل المضخة بيرفوسينج على أنبوب لطرد الهواء خارجاً من الأنبوب والقسطرة خالية من الإبرة.
- إيقاف تشغيل المضخة التروية.
- مرة أخرى، إدراج القسطرة خالية من إبرة الوريد البابي الأيسر عبر شق ثقب في الوريد (الشكل 3B).
ملاحظة: نظراً لكون هناك مساحة محدودة للغاية لتحديد القسطرة، ولم يتم إصلاحها عند هذه النقطة. ولذلك، ينبغي استخدام الجراح العناية لتجنب تشريد القسطرة مقني. - بعناية تجعل شق آخر على هامش المنطقة المكشوفة الوريد الكبدي الجانبي الأيسر بثقب مع قسطرة ز 22 أو 24 إبرة مسكن (الشكل 3).
ملاحظة: من المستحسن أن القسطرة تكون أصغر قليلاً من السفينة. - سحب القسطرة وتأخذ الإبرة خارج القسطرة للحصول على قسطرة خالية من إبرة 22-ز.
- قم بتشغيل المضخة نضح نتخلل المالحة هيبارينيزيد في الفص الجانبي الأيسر عن طريق القسطرة خالية من إبرة مقني 24-ز الوريد الأيسر بوابة تدفق بمعدل 0.5 مل/دقيقة.
- استخدام الشاش الجاف لامتصاص السوائل النفايات المتدفقة خارج حول منطقة شق الوريد الكبدي الجانبي الأيسر.
- كانولاتي في الوريد الكبدي الجانبي الأيسر عبر شق ثقب الوريد مع القسطرة خالية من إبرة 22-ز، لإنشاء منفذ للسوائل لتقليل التلوث داخل البطن (الشكل 3D).
ملاحظة: من الصعب من الناحية الفنية لإصلاح القسطرة مقني فص الكبد. ولذلك، الجراح أن تولي اهتماما لتجنب تشريد القسطرة. بدلاً من ذلك، دون cannulation الوريد الكبدي الجانبي الأيسر مع قسطرة، سوائل النفايات يمكن أيضا أن تستوعب في منطقة شق الوريد فقط مع شاش جافة. - الحفاظ على بيرفوسينج الفص الجانبي الأيسر مع المالحة هيبارينيزيد لحوالي 20 دقيقة (المجموعة 1) ومن ثم فقط مع المالحة ح 2، ح 3، أو 4 ح (المجموعة 2، المجموعة 3، والمجموعة 4، على التوالي).
- إيقاف تشغيل المضخة لوقف في التروية.
4-الفسيولوجية ضخه من الفص الجانبي الأيسر
- خلع القسطرة كلا من الوريد البابي الأيمن والوريد الكبدي الجانبي الأيسر.
- إغلاق شق الوريد المدخل الأيسر مع خياطة بولي أميد 11-0.
- إغلاق شق الوريد الكبدي الجانبي الأيسر مع خياطة بولي أميد 11-0 كذلك.
- أونكلامب الوريد الكبدي الجانبي الأيسر.
- أونكلامب في الوريد البابي الوسط الأيسر، والقناة الصفراوية الأيسر والشريان الكبدي الأيسر.
- قطع حرف مزدوج في الوريد البابي الأيمن فتح الوريد.
5-إغلاق جدار البطن
- إغلاق الطبقة العضلية لجدار البطن بخياطة متقطعة مع خياطة بوليجلاكتين امتصاص 910 4-0.
- إغلاق طبقة الجلد من جدار البطن بخياطة متقطعة مع خياطة بوليديوكسانوني امتصاص 4-0.
- بعد إغلاق البطن، تطهير شق الجلد بالكحول 70%.
6-بعد العملية الجراحية معاملة الفئران
- ضع الحيوان على لوح الاحترار للإنعاش لمدة حوالي 10 دقائق وثم وضعه في قفص جديد.
- إدارة البوبرينورفين 0.05 مغ/كغ تحت الجلد 2 × يوميا لمد 3 على التوالي بعد للإفراج عن الألم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ذكر اثنا عشر (الذين تتراوح أعمارهم بين 12-13 أسبوعا) استخدمت الفئران لويس لتقييم تأثير نضح فص الكبد انتقائية. أجريت هذه التجربة في أربع مجموعات (n = 3 الفئران في كل مجموعة). استخدام فترات مختلفة نضح لمدة 20 دقيقة، 2 ساعة، 3 ساعات و 4 ساعات، اتباع الخطوات الموضحة أعلاه، بنجاح حققنا في فيفو نضح فلقة واحدة.
في فيفو نضح الفص الجانبي الأيسر:
تعريف التشريحية الدقيقة الوريد البابي الأيمن والوريد الكبدي الجانبي الأيسر وناجحة الوريد البابي اليسار واليسار cannulation الوريد الكبدي الجانبية يمكن تأكيدها بعد التروية مع المالحة هيبارينيزيد. وكان المؤشر الأول لتحديد الهوية الناجحة وكانوليشن ملاحظة أن الدم مختلطة مع بيرفوساتي كانت تتدفق من الفص الجانبي الأيسر عبر مأخذ السوائل (الشكل 4 أ). وأكد نموذج نضح الجراحية الناجحة كذلك مراقبة تغير لون الفص الجانبي الأيسر بعد التروية مع هيبارينيزيد المالحة. تغير لون الفص الجانبي الأيسر من أحمر إلى صفراء باهتة، تشير إلى إزالة الدم من الفص الجانبي الأيسر. لتأكيد الحفاظ على التروية الفسيولوجية الفصوص المتبقية، لوحظ استمرار لون الفصوص الكبد المتبقية خلال نضح الفص الجانبي الأيسر. نضح الصحيح للفص الجانبي الأيسر نتج عن الفص تحول أصفر باهت بينما الفصوص الكبد الباقية تحتفظ لون أحمر طوال العملية برمتها (الشكل 4 باء).
فسيولوجية ضخه من الفص الجانبي الأيسر:
تقييم سالكيه للسفن مقني بعد سد شقوق للسفن وإعادة فتح الأوعية، لوحظ تغير لون الفص الجانبي الأيسر. ظهرت بعض البقع الحمراء على سطح perfused باهتة صفراء الأفقي الفص الأيسر بعد إعادة فتح على المنوال كبدي الجانبي الأيسر، تشير إلى نضح رجعية الأولية في الفص الجانبي الأيسر (الشكل 5A). سطح الفص المستهدفة أظهرت المزيد من البقع الحمراء بعد الإفراج عن المشابك الصغيرة الشريان الكبدي الأيسر لاحقاً، وترك القناة الصفراوية، وغادر الوسيط الوريد البابي، مما يعني زيادة التروية الفسيولوجية للفص الجانبي الأيسر عبر أعيد فتحها السفن (الشكل 5 (ب)). تحول سطح فص الكبد المستهدفة أحمر داكن بعد إعادة فتح الوريد البابي الأيسر، مما يؤكد أن الفص الكبد المستهدفة استعاد به نضح الفيزيولوجية الكاملة عن طريق الوريد البابي اليسرى (الشكل 5).
علم الأنسجة للفص الجانبي الأيسر بيرفوسيد:
بعد الانتهاء من نضح المالحة أو المالحة هيبارينيزيد، الفص الجانبي الأيسر perfused بشكل انتقائي (تجريبية) والفص caudate أدنى العادية (كعنصر تحكم) كانت مستأصل والثابتة مع فورمالدهايد وثم تعرضوا لدراسة نسيجية (ح & استاينينج). في الفص الجانبي الأيسر، هناك أية خلايا الدم واضحة مرئية في فرع الوريد البابي والكبدية، والوريد المركزي. كما هو متوقع، والخلايا الحمراء كانت مرئية في فرع الشريان الكبدي (الشكل 6 ألف و 6 ج). في الفص كودات أدنى العادية (كعنصر التحكم)، لوحظت خلايا الدم إلى حد كبير في الفرع في الوريد البابي، وفي الجيوب وفي الاتجاه المركزي (الشكل 6B ود 6).
معدل البقاء على قيد الحياة:
اثنا عشر من أصل اثني عشر الفئران التجريبية أسفر عن معدل البقاء على قيد الحياة 1-الأسبوع 100%. ولكن الفئران التجريبية 3 الذي خضع لمدة 4 ساعات نضح عانت مؤقتاً من الإسهال ودموية التفريغ من العيون في اليوم الثاني أو الثالث بعد.
الشكل 1 : مخطط العمليات الجراحية في فيفو نموذج نضح فص كبد واحد. (أ) هذا تخطيطي الرسم تشريح الجرذ الكبد. (ب) يظهر هذا الفريق انسداد الوريد البابي الأيمن والشريان الكبدي الأيسر، والقناة الصفراوية الأيسر، الوريد البابي الوسط الأيسر والوريد الكبدي الجانبي الأيسر. (ج) هذا الفريق يظهر cannulation الوريد البابي الأيمن والأيسر الوريد الكبدي الأفقي مع القسطرة للسوائل مدخل ومخرج. (د) هذا الفريق يظهر نضح الفص الجانبي الأيسر مع هيبارينيزيد المالحة بمضخة التروية. (ه) هذا الفريق يظهر ضخه الفسيولوجية للفص الجانبي الأيسر بعد إعادة فتح الأوعية المحظورة للفص. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الصور الموضعية التي تبين انسداد الأوعية الموردة وتجفيف الفص الجانبي الأيسر. (أ) هذا الفريق يظهر ربط الوريد المدخل الأيسر. (ب) هذا الفريق يظهر انسداد الشريان الكبدي الأيسر، والقناة الصفراوية الأيسر والشريان الوريد البابي الوسط الأيسر/الكبد/الصفراوية مع المشابك الصغيرة. (ج) هذا الفريق يظهر انسداد الوريد الكبدي الجانبي الأيسر مع المشابك الصغيرة (السهم الأبيض). هي أشرطة مقياس 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : صور المضاعفات تظهر على تداول تجاوز من خلال الفص الجانبي الأيسر. (أ) هذا الفريق يظهر الشق في الوريد البابي الأيسر (السهم الأبيض) بثقب مع قسطرة إبرة مسكن 24-ز. (ب) هذا الفريق يظهر cannulation الوريد المدخل الأيسر لمدخل السائل مع قسطرة خالية من إبرة 24-ز (السهم الأبيض). (ج) هذا الفريق يظهر الشق في الوريد الكبدي الجانبي الأيسر (السهم الأبيض) بثقب مع قسطرة إبرة مسكن 22-ز. (د) هذا الفريق يظهر cannulation الوريد الكبدي الجانبي الأيسر لمنفذ للسوائل مع قسطرة خالية من إبرة 22-ز (السهم الأبيض). هي أشرطة مقياس 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الصور الموضعية التي تبين نضح الفص الجانبي الأيسر. (أ) هذا الفريق بيرفوساتي يظهر تتدفق الفص الجانبي الأيسر عن طريق المدخل (القسطرة الأصفر) والمتدفقة من الفص الجانبي الأيسر عبر المنفذ (القسطرة الأزرق). الفص الجانبي الأيسر كان، في الواقع، بشكل انتقائي perfused، كما هو موضح بتغيير الألوان للفص (السهم الأبيض). (ب) ملاحظة تغير لون الفصوص الجانبية الفص الأيسر الأصفر باهتة بعد التروية مع هيبارينيزيد المالحة، بينما تبقى الكبد تبقى أحمر (الأسهم البيضاء). هي أشرطة مقياس 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : ضخه الفسيولوجية للفص الجانبي الأيسر. (أ) هذا الفريق يظهر نضح تراجعية من الفص الجانبي الأيسر بعد إعادة فتح الوريد الكبدي الجانبي الأيسر (السهم الأبيض). (ب) هذا الفريق يظهر ضخه الفسيولوجية لليسار المشابك الفص الجانبي (السهم الأبيض) بعد الإفراج الجزئي في الوريد البابي الوسط الأيسر والشريان الكبدي الأيسر. (ج) هذا الفريق يبدي ضخه كاملة من الفص الجانبي الأيسر (السهم الأحمر) بعد إعادة فتح الوريد البابي الأيمن والاسكيميه من الفص المتوسط الأيسر (السهم الأزرق). هي أشرطة مقياس 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : التقييم النسيجي (ح & ه تلطيخ). (ألف و جيم) تظهر هذه اللوحات تقييم النسيجي للفص الجانبي الأيسر (الفص التجريبية) الهيبارين-سالين-perfused مما يدل على عدم وجود خلايا الدم في (A) الوريد البابي والكبدية، و (ج) وفي الاتجاه المركزي. (أ) الخلايا الحمراء غير مرئية في الشريان الكبدي (السهم الأسود) كما هو متوقع. (ب ود) إظهار هذه الأفرقة بتقييم غذائها للفص كودات أدنى العادية (مراقبة) يكشف عن وجود خلايا الدم في جميع الأوعية الدموية الهياكل: الوريد البابي والشريان الكبدي الكبدية (الأسهم السوداء)، (ب) والوريد المركزي (د) (السهم الأسود). أشرطة مقياس هي 250 ميكرون.
| معلمات | النتائج | |
| فريق الأبحاث | عموم et al عام 2016 [15] | المجموعة الخاصة |
| في فيفو | نعم | نعم |
| الفص الهدف الكبد | الفص اليمين السفلي
|
الفص الجانبي الأيسر
|
| انسداد الوريد الأجوف والوريد البابي الرئيسي | نعم
|
لا
|
| الاسكيمية الفصوص المتبقية | نعم | الفص المتوسط الأيسر فقط |
| كانوليشن في الوريد الأجوف | نعم | لا |
| كانوليشن الوريد البابي الرئيسي | نعم | لا |
| بوابة ارتفاع ضغط الدم | نعم | لا |
| معدل البقاء على قيد الحياة 1 أسبوع | ضحى إينتراوبيراتيفيلي | 100 ٪ |
الجدول 1- مقارنة بين نماذج مختلفة من في فيفو الهندسة الكبد. ويوضح هذا الجدول الاختلافات الهامة في المنشآت النموذجية اثنين بين عموم et al. 15 ومجموعتنا البحثية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بحظر وكانولاتينج الوريد البابي الأيمن مع قسطرة كمدخل السوائل والوريد الكبدي الجانبي الأيسر قسطرة أخرى كمنفذ للسوائل، ونحن بنجاح إنشاء في فيفو السوائل التفافية داخل الفص الجانبي الأيسر، مما يدل على أن على الرغم من أن التقنية التي تنطوي على تحد كبير بسبب الحجم الصغير لهذه السفن كانوليشن وخطر التسبب بنزيف، من الممكن. ونجا حتى الفئران تمر بفترة طويلة نضح من 4 ساعات 1 أسبوع على الأقل، تبين أن الفئران يمكن أن يتسامح مع هذا الإجراء الجراحي.
في المقطع التالي، يصف لنا ثلاث خطوات من الناحية التقنية الأكثر صعوبة والحرجة وكيفية السيطرة عليها بنجاح. أولاً، عملية فصل وربط الوريد المدخل الأيسر، بسبب العلاقة المكانية الوريد البابي المستهدفة لحمه الكبد المحيطة بها، قد عزل السفينة خطر التسبب بنزيف. نوصي باستخدام الملقط الصغير بدلاً من المقص لفصل الوريد البابي الأيسر، بعناية تمزق الأنسجة avascular متصلة المحيطة بالوريد البابي الأيسر. ثانيا، فيما يتعلق بالشق في الجدار الأمامي من الوريد البابي الأيسر، شق كبيرة الحجم على الجدار الأمامي الوريد البابي اليسرى قد تزيد صعوبة إصلاح الشق وفرصة ليسبب تضيق بعد ملامسة الأوعية الدموية. نوصي باستخدام قسطرة إبرة مسكن بدلاً من المقص لصنع شق حجم بشكل صحيح. وثالثاً، فيما يتعلق بانسداد الوريد الكبدي الجانبي الأيسر، إذا تم حظر منطقة مكشوفة الوريد الكبدي الجانبي الأيسر غير صحيح، ولن يكون هناك تعرض بما فيه الكفاية الفضاء على المنوال كبدي الجانبي الأيسر ل cannulation لاحقاً. ونقترح لقط ينبغي أن يقوم ما يقرب من الفص المتوسط الأيسر بدلاً من وسط منطقة مكشوفة الوريد الكبدي الجانبي الأيسر.
قارنا هذين النموذجين من انتقائية في فيفو الكبد نضح بين عموم et al. 15 وبلدنا (الجدول 1). أولاً، اختيار فص الكبد المستهدفة يعتبر خطوة بالغة أهمية لإنشاء نموذج. اخترنا فص بدلاً من عزلة، الفص الجانبي الأيسر، كفلقة المستهدفة في فيفو نضح الجراحية نموذج إنشاء. على النقيض من ذلك، تحديد المجموعة البحثية لعموم الفص حق أدنى ل نموذج14. أوجه القصور في تحديد الفص اليمين السفلي كما يلي: أولاً، كان عليهم أن خرق حظر تماما وكانولاتينج الوريد الأجوف لمنفذ للسوائل، مما قد يؤثر سلبيا على الدورة الدموية للحيوان. وثانيا، كان عليهم أن كتلة وكانولاتي على المنوال المدخل الرئيسي لمدخل، الذي تسبب في الاسكيمية المتبقية الفصوص الكبد، وارتفاع ضغط الدم المدخل. بالمقارنة مع الفص المستهدفة هنا، الفص الجانبي الأيسر، نحن حظر ومقني الوريد الكبدي الجانبي الأيسر بدلاً من الوريد الأجوف لمنفذ للسوائل. نحن ولدت مدخل السوائل عن طريق تحديد الوريد البابي اليسرى، التي يبلغ قطرها كبير بدلاً من ذلك، تسهيل التشريح وانسداد كانوليشن. ولذلك، يتم تجنب عرقلة تدفق الدم في الوريد الأجوف والوريد البابي الرئيسي مباشرة في النموذج المعروض هنا، هو أمر حيوي لبقاء الفئران.
وعلى الرغم من إمكانية كبيرة في فيفو نضح فص الكبد، هذه التقنية على بعض القيود. أولاً، الاسكيمية الفص الأيسر الآنسي أمر لا مفر منه، بسبب انسداد الوريد البابي الوسط الأيسر أثناء العملية. ثانيا، استناداً إلى انسداد مؤقت في قاعدة الفص الجانبي الأيسر استخدام المشابك الصغيرة، هذا قد يؤدي إلى ضرر للحمة الكبد المحيطة بقاعدة فصي وحتماً يسبب تسرب طفيف أثناء التروية مع المالحة هيبارينيزيد. الفئران التجريبية الثلاثة التي تعرضت لمدة 4 ساعات نضح مؤقتاً يعانون من الإسهال والتفريغ العين الدموية، مما يوحي بأن 4 ساعات قد تكون فترة نضح الحد الأقصى للفئران دون معاناة المزيد من التعقيدات. على حد علمنا، مطلوب على الأقل 3 ساعات ديسيلولاريزيشن للكبد كله الفئران السابقين فيفو18. ولذلك، 4 ساعات الوقت نضح نحن تهدف إلى تحقيق ستكون كافية لزيادة ديسيلولاريزيشن فص الكبد، الذي شرط مسبق لهندسة الكبد بتعمير الخلية من السقالة الكبد.
في المستقبل، رواية استخدام هذه التقنية لنموذج التروية في فيفو قد يحتمل أن تكون في البحوث التجريبية لعلاج الجهاز الجزئي بالحقن بالمخدرات، و في فيفو ديسيلولاريزيشن الجهاز الجزئي بتر الكيميائية، " المجراة في خلية النظام الثقافي "،، وربما الأهم من ذلك، في فيفو الجهاز الجزئي بالهندسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر ينز جيلينج من معهد التشريح الأول، مستشفى جامعة يينا، لإنتاج رسومات تخطيطية لتشريح الجرذ الكبد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon |
References
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
