En ny kirurgisk teknik som et fundament for In Vivo delvis lever ingeniør i rotten
Summary
Vi etablere en ny kirurgisk teknik for en i vivo single lever lap perfusion model i rotte som en forudsætning for videre studier i vivo delvis leveren engineering i fremtiden.
Abstract
Orgel engineering er en roman strategi til at generere leveren orgel erstatninger, der potentielt kan bruges i transplantation. For nylig, i vivo lever engineering, herunder i vivo orgel decellularization efterfulgt af genindsættelse, er der opstået som en lovende tilgang over ex vivo lever engineering. Postoperative overlevelse var dog ikke nået. Formålet med denne undersøgelse er at udvikle en roman kirurgisk teknik, i vivo selektiv lever lap perfusion i rotter som en forudsætning for i vivo lever engineering. Vi skaber et kredsløb bypass kun gennem den venstre laterale lap. Derefter, venstre lateral lap er perfunderet med heparinized saltvand. Eksperimentet udføres med 4 grupper (n = 3 rotter pr. gruppe) baseret på forskellige perfusion gange 20 min, 2 h, 3 h og 4 h. overlevelse samt makroskopisk synlig ændring af farve og histologisk bestemt fraværet af blodlegemer i den portalen triad og sinusoids, er taget som en indikator for en vellykket model etablering. Efter selektiv perfusion af venstre laterale lap observerer vi, at venstre laterale lap, faktisk, vendte fra rød til svagt gul. I en histologisk vurdering er ingen blod celler synlige i grenen af Vena, central venen og sinusoids. Den venstre laterale lap bliver rødt efter genåbningen de blokerede fartøjer. 12/12 rotter overlevede proceduren for mere end en uge. Vi er de første til at rapportere en kirurgisk model for i vivo single lever lap perfusion med en lang overlevelse periode på mere end en uge. I modsætning til den tidligere offentliggjorte rapport, de vigtigste fordel af teknikken præsenteret her er der perfusion af 70% af leveren fastholdes under hele proceduren. Oprettelsen af denne teknik giver et fundament for i vivo delvis lever engineering i rotter, herunder decellularization og recellularization.
Introduction
Indikationer for organtransplantation konstant ekspanderende. Derimod er orgel donation priser og generelle kvalitet af organer faldende, hvilket fører til en stigende efterspørgsel efter podninger. Antallet af ansøgere, der er føjet til levertransplantation venteliste fortsatte med at stige (f.eks.i USA, 11,340 patienter blev tilføjet i 2016, sammenlignet med 10,636 i 2015)1. Trods betydelige bestræbelser opfylder antallet af tilgængelige organer ikke kliniske behov. På grund af den øgede forekomst af leversygdom, mange patienter med slutstadiet leversygdomme dø på hårtransplantation venter liste før en donor organ bliver tilgængelig. For at imødekomme den store efterspørgsel efter donor lever grafts, forfulgt alternative metoder ved hjælp af levervævet engineering principper bliver aktivt2. I dag, kunne en nyudviklet biologiske teknik af leveren engineering potentielt overvinde denne mangel.
Leveren engineering består af to trin: generation af en acellulær stillads, efterfulgt af en genindsættelse af skafottet. For at opnå en biologisk acellulær lever stillads, er eksplanterede leveren perfunderet via det vaskulære system med ioniske eller nonionisk vaskemidler, der kan fjerne det cellulære materiale fra leveren. I de fleste tidligere undersøgelser, blev en biologisk acellulær lever stillads opnået ved perfusion af leveren med en kombination af dodecyl natriumsulfat og TritonX100. Som et resultat, blev alle celler fjernet, mens strukturen i den ekstracellulære matrix blev opretholdt. Orgel stilladser var tilsås med modne celler, hepatocellulært, samt endotel cellelinjer og primære hepatocytter med eller uden samtidige anvendelse i endothelial celler eller mesenchymale stamceller (MSC). De fleste forskere fokus på ex vivo lever engineering3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Men i de fleste tidligere undersøgelser, kun små stykker af genopbyggede stillads kuber blev transplanteret ind i forskellige heterotopisk implantation websteder. I et par undersøgelser, blev delvis genopbyggede stilladser transplanteret som hjælpeansatte transplantat. Maksimal indberettet overlevelsestid var dog kun 72 h8,14. Så vidt vi ved, har orthotopic transplantation af en genopbyggede fuld lever graft endnu ikke er udført eller offentliggjort om. Den langsigtede funktion og transplantation af manipuleret organer er stadig i deres vorden. Derfor, en alternativ tilgang til ex vivo lever engineering er nødvendig.
In vivo lever engineering kan udgøre et alternativ til at studere hepatisk genindsættelse fysiologiske betingelser. Fordelene i vivo lever engineering i forhold til ex vivo lever teknik er mangfoldige. I vivo genbefolket delvis lever stillads er udsat for fysiologiske blod perfusion med rette temperatur, tilstrækkelig ilt, næringsstoffer og vækstfaktorer i modsætning til ex vivo perfusion med kunstige næringssubstratet. Desuden fastholder resterende delvis normale leveren den hepatiske funktion, hovedsagelig tillader langsigtede overlevelse. Da en indopererede ex vivo manipuleret lever graft er stadig ikke i stand til at opretholde den langsigtede overlevelse af forsøgsdyr ved sin leverfunktionen8, vi forestiller at i vivo delvis lever engineeringwould i sidste ende blive en lovende model til yderligere undersøge udviklingen af manipuleret lever med længere overlevelse observationer end ex vivo.
En forskningsgruppe (Pan og kolleger) fremlagde for nylig, for første gang, en teknik, i vivo leveren engineering15. De opnåede den isolerede perfusion af lige ringere lever lap i levende rotter trods anatomiske og tekniske udfordringer. De rapporterede de første intraoperativ resultater af i vivo genindsættelse ved hjælp af en rotte primære hepatocyt cellelinje. Men, i vivo kirurgisk perfusion model af Pan et al. har ulemper. De opnåede single lever lap perfusion i rotter på bekostning af helt blokere portalen vene og ringere vena cava, som kan forårsage alvorlig skade for dyret. De eksperimentelle rotter blev ofret efter kun 6 timers intraoperativ observationstidspunkt. Derfor, i vivo lever lap perfusion teknik skal yderligere forbedring at opnå postoperative overlevelse.
Vi udviklede en roman overlevelse model for i vivo lever lap perfusion, baseret på tidligere undersøgelser af hepatisk anatomi af rotte16, Vena cannulation teknik til hæmodynamiske overvågning i mus17, og leveren bioteknologi 18 , 19. de vigtigste skridt under proceduren er illustreret i figur 1A – 1E.
Denne teknik egner sig til dem, der ønsker at bruge denne eksperimentelle i vivo perfusion model til grundforskning på delvis orgel behandling af infusion med narkotika, i vivo decellularization som en kemisk resektion for orgel sygdomme (f.eks. , leverkræft), i vivo cellekultur i en decellularized matrix sammenligne ex vivo todimensional og tredimensional celle kultur systemer20,21,22,23 , 24 , 25 , 26og i vivo lever engineering af decellularization og genoprettelse af bestanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved at blokere og cannulating venstre portal vene med et kateter som en væske indtag og venstre lateral leverens vene med en anden kateter som en væske outlet, genereret vi med succes en i vivo væske bypass i venstre laterale lap, der angiver, at selv om teknikken er meget udfordrende på grund af den lille størrelse af fartøjer til cannulation og en høj risiko for at forårsage blødning, er det muligt. Selv rotter gennemgår en lang perfusion periode på 4 timer overlevede mindst 1 uge, viser, at rottern…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Jens Geiling af anatomisk Institut I, Jena University Hospital, til at producere de skematiske tegninger af rotte lever anatomi.
Materials
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon | ||
References
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
