Summary
Ici, nous présentons un protocole pour établir une induction conductrice reproductible de perte auditive par la perforation et la vérification chirurgicales de membrane tympanique par la visualisation d'otoscope et l'évaluation comportementale par le sursaut de clap.
Abstract
La perte auditive conductrice (LCH) est une déficience auditive répandue chez l'homme. Le but du protocole est de décrire une procédure chirurgicale simple pour induire l'ACh chez les rongeurs. Le protocole démontre CHL par perforation de membrane tympanique. La vérification de la chirurgie de LCH était par l'examen d'otoscope et l'évaluation comportementale par la réponse de sursaut de clap, reproductible et fiable, et sont des méthodes simples pour démontrer la perte d'audition s'est produite. La procédure simple de l'EsCH est avantageuse en raison de sa reproductibilité et de sa souplesse à différentes activités de recherche sur les pertes auditives. Les limites d'induire CHL par une approche chirurgicale sont associées à la courbe d'apprentissage pour effectuer l'intervention chirurgicale et la confiance dans l'examen audiologique. Induire une déficience auditive par l'UneCH permet d'étudier facilement les manifestations neuronales et les résultats comportementaux de la perte auditive.
Introduction
La prévalence de la perte auditive chez les enfants et les adultes est d'environ 19,5 %1 et 15,2 %2 respectivement. Cependant, environ 39,3 % de tous les nouveau-nés ayant subi un dépistage auditif anormal ne reçoivent pas de traitement correctif tel que rapporté par les Centers for Disease Control3. La perte auditive est une condition largement étudiée, et le rongeur est un modèle robuste pour étudier les troubles normaux liés à l'audition et l'ouïe4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15. Les troubles auditifs tels que la perte auditive conductrice (LCH) entraînent une augmentation de la dépression synaptique à court terme dans le cortex auditif4, ce qui entraîne des pentes psychométriques moins profondes associées aux seuils de détection de la modulation de fréquence. 5. Les modèles de perte auditive conductrice par l'ablation/déplacement chirurgical du malleus, de la ponction de membrane tympanique (TM) ou du bouchon d'oreille sont facilement employés et permettent l'induction rapide du modèle de perte auditive5,14 ,15,16,17,18. L'objectif du protocole et de la méthode actuels est de démontrer un modèle simple et reproductible de CHL chez les rongeurs.
Le protocole actuel est peu coûteux (300 $US avec tous les outils) et facilement modifiable à différentes activités de recherche. Le rat a eu des évaluations détaillées de l'anatomie de l'oreille moyenne19,20,21,22,23, approches chirurgicales24, modèles dans les médias d'otite25, 26,27 et TM rinçant la régénération16,17,18,28,29,30, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier perte. Ici, une procédure simple d'induction de CHL est décrite avec la vérification par l'otoscope et l'évaluation comportementale avec la réponse de sursaut de clap dans le rat, qui peut alors être employée pour explorer des séquelles additionnelles de perte d'audition. La procédure de LCH est induite par la perforation chirurgicale du TM. La vérification de la procédure de l'OLC est effectuée par visualisation d'otoscope pour déterminer l'absence du TM. L'évaluation comportementale est effectuée par un niveau de pression sonore élevé de décibels (dB) (SPL) à la main. Cette méthode a été appliquée précédemment dans une variété de rongeurs. Il est facile à reproduire, produit des différences psychométriques robustes et des changements dans les réponses physiologiques neuronales4,5,16,17,18.
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Protocol
La présente étude et les procédures ont été approuvées par les comités d'éthique de la recherche animale de la City University de Hong Kong, de l'Université de Hong Kong et du Département de la santé de la Région administrative spéciale de Hong Kong.
1. Animaux
- Utiliser des rats Sprague-Dawley (SD) de deux mois (N ' 90, 200-250 g).
REMARQUE : Les rongeurs ont été fournis par l'unité des animaux de laboratoire accréditée de l'Université de Hong Kong. - Maintenir les rats sous une température constante de 25 oC et une humidité de 60 à 70 % à l'Unité de recherche sur les animaux de laboratoire.
- Les rongeurs de maison dans les cycles de lumière/obscurité de 12/12-h avec accès à la nourriture et à l'eau potable, ad libitum.
- Acclimater les rongeurs à l'environnement du logement pendant au moins un jour avant la chirurgie de la LCH.
- Ramassez le rongeur par les éraflures et anesthésiez le rongeur avec un cocktail de kétamine et de xylazine (80-100 mg/kg : 5-10 mg/kg, respectivement) par injection intrapéritone (combiner 1,0 ml de kétamine avec 0,5 ml de xylazine comme concentration finale).
REMARQUE : Utilisez une seringue de 1 ml avec une aiguille de 23 à 25 G. Injecter environ 0,2 ml par 100 g de poids corporel du rat pendant 30 min d'anesthésie. - Effectuer le pincement de l'orteil pour vérifier la sensation de douleur et de corroborer l'anesthésie appropriée. Une réaction à la pince profonde d'orteil (par le retrait du membre postérieur) indique l'anesthésie insuffisante.
2. Configuration chirurgicale
- Stérilisez tous les équipements dans un stérilisateur de perles de verre autoclave ou chaud avant le début de la chirurgie. Nettoyer la zone chirurgicale avec 70% d'éthanol.
- Utilisez des gants en latex et une blouse de laboratoire avant de commencer l'intervention.
- Placez un drapé chirurgical stérile sur le banc propre (Figure 1A).
- Stériliser les micro-ciseaux et un otoscope avant la chirurgie pour minimiser l'infection de l'oreille (Figure 1B).
- Placez les micro-ciseaux et l'otoscope dans la zone stérile.
- Placez le rongeur dans le champ chirurgical et en alignement avec le chirurgien.
- Procéder à l'induction chirurgicale de la LCH.
3. Induction chirurgicale de la perte auditive conductrice
- Placez la queue et la tête du rongeur alignés dans une position encline, la tête la plus proche du chirurgien.
- Visualisez l'oreille gauche et droite du rongeur sous otoscope pour assurer la membrane tympanique saine (Figure 2a). Évaluer l'oreille droite et gauche de chaque rongeur pour vérifier l'état de santé avant l'induction de la LCH.
- Prenez l'hélice de l'oreille et étendez le canal auditif externe (c.-à-d. le canal auditif, le meatus auditif externe, le canal auditif ci-temps) pour faire obscurcir l'intérieur et noircir par la profondeur. Ici, le canal auditif est rendu perpendiculaire à la surface du TM.
REMARQUE : Assurez-vous que le cannel auditif est directement parallèle maintenant et que le TM forme un angle droit avec l'axe d'insertion des micro-ciseaux. Il sera visualisé comme un tube noir sans lumière. Parfois, le canal auditif doit être incliné à un léger angle, à environ 15 degrés de la surface planaire du crâne. Cela garantit que la main du chirurgien est perpendiculaire à la surface du TM. - Introduire les micro-ciseaux au centre du canal auditif en prêtant attention à ne pas écrémer ou entailler le tissu du canal auditif et procéder légèrement, à environ 5 mm du centre de l'obscurité, poussant vers l'avant doucement à travers le centre de la TM.
REMARQUE : La ponction TM peut être confirmée par un bruit de bruit lorsque les pointes de micro-ciseaux perforent le TM. Le bruit éclatant peut être entendu à environ 2 min 52 s dans la vidéo. Ce n'est pas un son de ciseaux; c'est un bruit de perforation TM. Comme mesuré post-analyse, le "pop" est d'environ 20 dB SPL plus grand que le son de fond tel qu'enregistré par un microphone à haute fréquence. Il n'est pas nécessaire de vérifier le son "pop" dans cette mesure, la visualisation otoscope est suffisante. L'enquêteur peut avoir besoin de s'assurer qu'un « pop » est entendu au cours de chaque procédure de l'IlL. - Ouvrez immédiatement les micro-ciseaux à ressort et tournez trois fois après avoir perforé le TM pour assurer le déplacement de la tête du malleus loin du TM (seulement si le déplacement du malleus est souhaité).
- Retirez les micro-ciseaux et placez le rongeur sous l'otoscope pour la visualisation.
REMARQUE : Il est important de noter qu'aucun saignement significatif ne devrait se produire après l'intervention chirurgicale. Euthanasier le rongeur et ne pas procéder à une évaluation comportementale en cas de saignement. - Induire la LCH bilatérale en procédant comme ci-dessus dans l'oreille opposée.
4. Visualisation d'otoscope
- Confirmer une chirurgie réussie de lUNE avec un otoscope utilisant un spéculum de petit diamètre pour visualiser l'oreille moyenne de rongeur.
- Évaluer chaque rongeur avant et après l'intervention chirurgicale de la LCH sous l'otoscope. Assurer la confirmation de la MT normale (figure 2a) et endommagée TM après l'induction de la LCH (figure 2b).
-
Soins postopératoires pour le rongeur
- Placez le rongeur dans la cage de la maison sous une lampe chaude.
- Observez l'induction du rongeur après la LCH jusqu'à ce que le rongeur lui-même ait droit.
- Injectez le rongeur avec du sérum de glucose (dextrose/saline) pour retrouver conscience et placer le rongeur dans la cage domestique pour la récupération.
REMARQUE : Utilisez une aiguille de 23 G mlas avec une seringue de 10 ml pour injecter 5 ml de salin après une chirurgie de la LCH. - Injecter le rongeur par intramusculaire avec enréofloxacine antibactérienne 0,05 mg/kg deux fois au cours de la période de récupération de 24 h.
- Observez régulièrement le rongeur pour un comportement de douleur ou des symptômes après la chirurgie.
5. Évaluation comportementale (validation de l'induction de la LCH) - réponse de sursaut de clap
- Corroborer CHL (après confirmation d'otoscope) 24 h post-chirurgie avec l'évaluation comportementale se composant du clap-startle-test.
- Placez le rat induit par la LCH à côté d'un rat normal dans deux cages adjacentes séparées.
- Placez les rongeurs dans une pièce silencieuse.
- Tenez-vous à environ 0,5 m des rongeurs et continuez à applaudir dans des durées également espacées à plusieurs reprises (5 claps ont été choisis et espacés sur 1 seconde).
REMARQUE : Le sursaut de clap produit par le clap de main mesuré 40 dB SPL plus grand que le bruit de fond tel qu'enregistré par un microphone à haute fréquence.
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Representative Results
La procédure simple de LCH a été exécutée sur 90 rats et de ce groupe 2 a eu le saignement significatif et 2 n'a pas eu la perte d'audition le lendemain comme évalué par le sursaut comportemental de clap. Ces quatre rats ont été jetés. Les rats doivent être jetés comme décrit par les raisons dans la discussion en raison de complications. Induire la ponction tM et/ou le déplacement/déplacement de malleus (figure 2B) suscitent des manifestations comportementales (c.-à-d. CHL - aucune réponse à l'effigie forte de DB SPL). Les rats doivent être vérifiés par otoscope avant la chirurgie afin d'assurer la membrane tympanique normale et après la chirurgie pour assurer la perforation de la membrane tympanique(figure 2; Figure supplémentaire 1). Remarque, aucun saignement ou inflammation significative ne devrait se produire (Figure supplémentaire 2). Le rongeur induit de la LCH ne répondra pas à un bruit fort de clap dB SPL tandis qu'un compagnon de cage d'audition de commande sautera au clap fort. Le rat de lCh n'est pas sourd au son, mais a une LCH et donc des manifestations comportementales subtiles se produisent5. Un rongeur d'audition de contrôle réagit vigoureusement avec des sauts à un bruit fort de SPL de dB, tel que le sursaut de clap. La réponse de saut/sursaut est clairement visible dans la vidéo du compagnon de cage d'audition, tandis que le rat induit par la LCH ne répond pas. Le comportement d'un rat de la LCH peut être plus subtil. Nous démontrons le réflexe général de sursaut de clap pour un rat représentatif de CHL et rat d'audition de commande. Au fil du temps après la chirurgie de l'ALC, certains rats peuvent retrouver la réponse de sursaut de clap.
Utilisant la procédure de LCH, des études antérieures ont étudié les manifestations neurales de la perte d'audition. Par exemple, le degré de perte auditive suivant la procédure a été quantifié en mesurant les potentiels auditifs évoqués15,16,17, enregistrements de fenêtre ronde4,18, et seuils d'audition comportemental5. L'activité neuronale suivant l'ACL a été étudiée avec la méthode de 2-désoxyglucose et les enregistrements de cellules entières4,16,17. L'activité de nerf auditif a également été examinée avec des enregistrements ronds de fenêtre18. Les seuils de détection de la fréquence-modulation ont été étudiés comportementalement5. Cette procédure de LCH est clairement compatible avec un large éventail de méthodes expérimentales pour des études détaillées de la perte auditive.
Figure 1: Configuration chirurgicale. A) Placer le rongeur dans une zone bien éclairée avec une lampe chirurgicale. Anesthésiez le rongeur. Préparez un assortiment de micro-ciseaux, si le plus petit ne fonctionne pas, une plus grande paire peut assurer la ponction TM. Assurez-vous que l'otoscope est prêt. B) Micro-ciseaux à ressorts. Les pinces suffiront si l'expérimentateur peut contrôler l'ouverture et la fermeture. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Membrane tympanique représentative. A) Membrane tympanique (TM) avant la perforation. B) TM après la perforation. Lors de l'exécution de la confirmation de la crevaison de la LCH et de la TM avec l'otoscope, il est impératif de noter d'abord la tête du malleus et après l'induction de la LCH, un retrait réussi et une ponction de TM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Information complémentaire Figure 1: Avant et après la chirurgie de la LCH telle qu'elle est visualisée par un otoscope. Visualisation d'otoscope avant et après chirurgie de lCH (immédiate) dans le rat identique. La colonne gauche des figures sont des canaux auditifs représentatifs de rat visualisés avant la procédure de CHL par otoscope avec les ossicules normaux de TM et d'oreille moyenne. La colonne droite des figures sont des canaux auditifs représentatifs de rat visualisés après la procédure de CHL par otoscope avec le TM perforé et les ossicules déplacés d'oreille moyenne. Les saignements significatifs se composent de l'accumulation de sang dans les oreilles. Étude de l'anatomie de l'oreille moyenne des rongeurs avant d'effectuer la procédure19,20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29. La visualisation d'otoscope a été conduite 24 heures après chirurgie. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Information complémentaire Figure 2: Contrôle et après la chirurgie de la LCH rat canal auditif tel qu'évalué par histologie. Vue histologique de l'oreille moyenne en contrôle et après la chirurgie de l'ALC (Bar à 500 m). Les canaux auditifs ont été traités par l'hématoxylin et l'éosine (H et E) et la coloration Trichrome (MT) de Masson en contrôle et 24 heures après la chirurgie de chLD. La colonne gauche des figures sont des sections histologiques représentatives du canal auditif dans les rats témoins. La colonne droite des figures sont des sections histologiques représentatives du canal auditif après la procédure de LCH. Notez qu'aucune inflammation significative ne se produit après la chirurgie de lCH. Aucune différence n'a été remarquée jusqu'à une semaine. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
Nous décrivons une induction chirurgicale simple de CHL avec la vérification utilisant la visualisation d'otoscope et la réponse comportementale de sursaut de clap dans le rat. Ici nous démontrons la méthode sur le rat et précédemment cette méthode a été appliquée aux gerbilles et aux souris. La méthode peut facilement être adoptée à d'autres rongeurs. L'induction de la LCH permet l'étude d'une forme subtile de perte auditive qui se manifeste par des altérations corticales auditives et des résultats comportementaux psychophysiques4,5,16,17,18 .
L'omission d'induire la LCH pourrait être due à plusieurs raisons énumérées ci-dessous. Dans chaque cas, nous recommandons de jeter le rat. Euthanasier le rat si l'une des oreilles saigne. Le saignement indique que les ciseaux sont en contact avec le canal auditif et que l'approche chirurgicale n'était pas propre. Sinon, il peut signifier que la perforation a été plus profonde que préféré, causant des dommages internes, éventuellement des dommages au cerveau. Les dommages internes peuvent signifier une insertion profonde ou le nicking du canal auditif. La procédure est une membrane tympanique mini-invasive et/ou l'enlèvement/déplacement de malleus ; par conséquent, aucun saignement significatif ne devrait se produire (Figure supplémentaire 1). En cas de saignement important, euthanasiez le rat. Si aucun son "pop" n'est entendu pendant la perforation de la membrane tympanique, cela pourrait indiquer une mauvaise LCH, ce qui signifie que les ciseaux n'ont pas fait de contact direct avec la membrane tympanique. Jetez le rongeur du groupe et euthanasiez- À l'aide de l'otoscope, si la visualisation confirme que l'oreille moyenne est semblable aux oreilles témoins, cela indique que la membrane tympanique n'a pas été perforée. Aucune LCH n'a été induite et donc le rongeur devrait être jeté. Si le rongeur répond au clap-sound-test, il doit être jeté. Si un rongeur induit par la LCH saute ou saute après des bruits de clap, semblable à son compagnon de cage, ceci indique que le procédé chirurgical n'a pas été réussi. Une réponse à un bruit de clap indique qu'aucun LCH ne s'est produit et que le rat doit être jeté ou euthanasié. Les limites de l'induire CHL par une approche chirurgicale sont associées à la courbe d'apprentissage pour effectuer l'intervention chirurgicale et la confiance dans l'examen audiologique19,20,22,23, 27,28,29. En outre, ce protocole n'a pas utilisé ABR ou DPOAE pour évaluer la perte auditive15 afin d'établir un protocole simple pour les scientifiques peu familiers avec les procédures audiologiques. Les procédures audiologiques ABR et DPOAE peuvent être utilisées pour les scientifiques qui veulent une évaluation plus approfondie de CHL15.
Une modification de la technique est d'utiliser la ponction TM avec déplacement de malleus. Pour un novice cela peut être difficile à établir, mais le malleus est clairement visualisé avec un otoscope dans presque toutes les oreilles de rongeurs. Le TM est une membrane fibreuse avec un aspect pellucide qui transmet la lumière. Vérification d'otoscope de pratique pour établir la visualisation cohérente basée sur la littérature précédente19,20,22,23,27,28,29 . Après que l'on est confiant dans la visualisation de malleus, son déplacement pendant la chirurgie est facilement confirmé par un fort 'pop' comme on peut l'entendre à 2 min 52 s. Cette pop est un changement fort dB SPL dans le fichier audio d'environ 20 dB SPL avant la torsion des micro-ciseaux à ressort. La forte pop confirme la crevaison et le succès de TM sans endommager le canal auditif. Deux aspects de l'intervention chirurgicale doivent être effectués avec soin : 1) s'assurer que les micro-ciseaux sont placés au centre du canal auditif, et 2) s'assurer que l'angle des micro-ciseaux est parallèle au canal auditif pendant la ponction vers le bas. Assurez-vous que le mouvement de la crevaison est rapide et qu'il est d'environ 5 mm à partir de l'ouverture du canal auditif. Faites pivoter et ouvrez les micro-ciseaux pour le déplacement du malleus si souhaitable.
Les principales étapes du protocole de la LCH sont d'assurer la ponction de TM et de vérifier le sursaut des claps comportementaux. S'assurer que la vérification de l'enlèvement ou de la perforation du malleus de la LC confirme que la LCH a été effectuée. La vérification se fait par l'examen otoscopique. Les étapes critiques pour l'évaluation comportementale sont d'assurer un clap assez fort que le rongeur est surpris. Des différences ont été relevées lorsqu'un rat de la LCH est placé dans une cage semblable à celle d'un rat entendant; ici, un rat est surpris par l'autre, même si le rat ne peut pas entendre le son. Un rat/rongeur surpris saute souvent ou saute, mais ce n'est pas un critère. Comme on peut l'observer, le rat de la LCH ne se déplace pas vers le clap. Puisque la ponction de TM est une CHL, différents niveaux de sons db SPL peuvent être entendus par le rongeur5.
La principale signification de cette méthode simple de la LCH est qu'elle peut être effectuée par un large éventail de chercheurs, même avec des ressources modestes. La vérification de la perte auditive est effectuée par visualisation d'otoscope et réponse comportementale de sursaut de clap chez le rat. Ici nous démontrons la méthode sur le rat et précédemment cette méthode a été appliquée aux gerbilles et aux souris. La méthode peut facilement être adoptée à d'autres rongeurs. L'induction de la LCH permet l'étude d'une forme subtile de perte auditive qui se manifeste par des altérations corticales auditives et des résultats comportementaux psychophysiques4,5,16,17,18 La technique actuelle peut être combinée avec l'électrophysiologie et les techniques comportementales pour déterminer les conséquences corticales de la perte auditive, qui est d'un grand intérêt pour la recherche sur la perte auditive31.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts financier ou non financier.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par le Hong Kong Research Grants Council, Early Career Scheme, Project #21201217 to C. L., pour le projet Brain mapping guided electrophysiology with applications in hearing and noise pollution research. Nous remercions le Posgrado en Ciencias Biomédicas, l'Instituto de Neurobiologa de l'Universidad Nacional Autànoma de México (UNAM), le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) México pour la Bourse supérieure 578458 à FAM Manno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex, polyvinyl or nitrile gloves | AMMEX | Use unpowdered gloves 8-mil | |
| Micro spring scissors (see Fig. 1b) | RWD Life Science | S11035-08 | 8.0 cm total length, with 3.5mm cutting edge, or similar micro forceps. Standard tweezers with spring action will suffice |
| Otoscope mini 3000 | HEINE | D-008.70.120M | Standard LED otoscope will suffice |
| Rat or mouse | JAX labs | Any small rodent | |
| Small rodent cage | Tecniplast | 1284L | Need two cages to separate CHL rodent from hearing rodent. If rodents are in direct contact with one-another, they will startle each other. Cage dimensions 365 x 207 x 140 mm, floor area: 530 cm2/82.15 in2 |
References
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