Summary
Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un'induzione della perdita dell'udito conduttiva replicabile tramite la puntura chirurgica della membrana tipopanica e la verifica mediante la visualizzazione dell'otoscopio e la valutazione comportamentale tramite clap startle.
Abstract
L'ipoacusia conduttiva (CHL) è un'imposizione uditiva prevalente negli esseri umani. L'obiettivo del protocollo è descrivere una semplice procedura chirurgica per indurre CHL nei roditori. Il protocollo dimostra CHL da puntura a membrana timpanica. La verifica della chirurgia CHL è stata effettuata mediante esame di otoscopio e valutazione comportamentale mediante risposta clap startle, sia replicabile che affidabile, e sono semplici metodi per dimostrare che si è verificata la perdita dell'udito. La semplice procedura CHL è vantaggiosa per la sua riproducibilità e flessibilità nei diversi inseguimenti nella ricerca sulla perdita dell'udito. I limiti di indurre CHL con un approccio chirurgico sono associati alla curva di apprendimento per eseguire la procedura chirurgica e la fiducia nell'esame audiologico. L'induzione di un'ipoacusia da parte della CHL consente di studiare facilmente le manifestazioni neurali e gli esiti comportamentali della perdita dell'udito.
Introduction
La prevalenza della perdita dell'udito nei bambini e negli adulti è di circa il 19,5%1 e 15,2%2 rispettivamente. Tuttavia, circa il 39,3% di tutti i neonati con uno screening acustico anomalo non riceve un trattamento correttivo come riportato dai Centers for Disease Control3. La perdita dell'udito è una condizione ampiamente studiata e il roditore è un modello robusto per studiare i normali disturbi dell'udito e dell'udito4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15. Disturbi dell'udito come la perdita dell'udito conduttiva (CHL) portano ad un aumento della depressione sinaptica a breve termine nella corteccia uditiva4, che si traduce in pendenze psicometriche meno profonde associate a soglie di rilevamento della modulazione di frequenza 5. I modelli di perdita dell'udito conduttivi mediante rimozione/spostamento chirurgico della malleus, della puntura della membrana timpanica (TM) o del tappo per le orecchie sono facilmente impiegabili e consentono la rapida induzione del modello di perdita dell'udito5,14 ,15,16,17,18. L'obiettivo del presente protocollo e metodo è quello di dimostrare un modello CHL semplice e riproducibile nei roditori.
L'attuale protocollo è poco costoso (300 USD con tutti gli strumenti) e facilmente modificabile per le diverse attività di ricerca. Il ratto ha avuto valutazioni dettagliate dell'anatomia dell'orecchio medio19,20,21,22,23, approcci chirurgici24, modelli in otite media25, 26,27 e TM rigenerazione foratura16,17,18,28,29,30, che lo rende un modello ideale per studiare perdita dell'udito. Qui, una semplice procedura di induzione di CHL è descritta con la verifica tramite otoscopio e valutazione comportamentale con risposta clap startle nel ratto, che poi può essere utilizzata per esplorare ulteriori sequele di perdita dell'udito. La procedura CHL è indotta dalla puntura chirurgica della TM. La verifica della procedura CHL viene eseguita dalla visualizzazione dell'otoscopio per determinare l'assenza della TM. La valutazione comportamentale viene eseguita da un livello di pressione sonora (SPL) ad alto decibel (dB). Questo metodo è stato applicato in precedenza in una varietà di roditori. È facile da replicare, produce robuste differenze psicometriche e cambiamenti nelle risposte fisiologiche neurali4,5,16,17,18.
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Protocol
L'attuale studio e le procedure sono stati approvati dai comitati etici della ricerca sugli animali della City University di Hong Kong, dell'Università di Hong Kong e del Dipartimento della Salute della Regione Amministrativa Speciale di Hong Kong.
1. Animali
- Utilizzare ratti Sprague-Dawley (SD) di due mesi (N - 90, 200-250 g).
NOTA: i roditori sono stati forniti dall'unità animale da laboratorio accreditata dell'Università di Hong Kong. - Mantenere i ratti sotto una temperatura costante di 25 gradi centigradi e del 60-70% di umidità presso l'Unità di Ricerca Animale di Laboratorio.
- Casa roditori in cicli di luce / buio 12/12-h con accesso al cibo e acqua potabile, ad libitum.
- Acclimatarsi roditori per l'ambiente abitativo per almeno un giorno prima della chirurgia CHL.
- Raccogliere il roditore dal mischia e anesizzare il roditore con un cocktail di ketamina e xilarina (80-100 mg/kg: 5-10 mg/kg, rispettivamente) tramite iniezione intraperitoneale (combinare 1,0 mL di ketamina con 0,5 mL di xilarcome concentrazione finale).
NOTA: Utilizzare una siringa da 1 mL con un ago da 23-25G. Iniettare circa 0,2 mL per 100 g di peso corporeo del ratto per 30 min di anestesia. - Eseguire il pizzico del dito del dito per verificare la sensazione di dolore e per corroborare l'anestesia corretta. Una reazione al pizzico dell'aldito profondo (per ritiro dell'arto posteriore) indica un'anestesia insufficiente.
2. Configurazione chirurgica
- Sterilizzare tutte le attrezzature in un autoclave o bicchiere caldo perline sterilizzatore prima di iniziare l'intervento chirurgico. Pulire l'area chirurgica con il 70% di etanolo.
- Utilizzare guanti di lattice e camice da laboratorio prima di iniziare la procedura.
- Posizionare un drappo chirurgico sterile sul banco pulito (Figura 1A).
- Sterilizzare microforbici e un otoscopio prima dell'intervento chirurgico per ridurre al minimo l'infezione dell'orecchio (Figura 1B).
- Posizionare le microforbici e l'otoscopio nell'area sterile.
- Posizionare il roditore nel campo chirurgico e in allineamento con il chirurgo.
- Procedere con l'induzione chirurgica di CHL.
3. Induzione chirurgica della perdita dell'udito conduttiva
- Posizionare la coda e la testa del roditore allineati in posizione prona, testa più vicina al chirurgo.
- Visualizzare l'orecchio sinistro e destro del roditore sotto l'otoscopio per garantire una sana membrana timpanica (Figura 2a). Valutare l'orecchio destro e sinistro di ogni roditore per verificare le condizioni sane prima dell'induzione della CHL.
- Afferrare l'elica dell'orecchio ed estendere il canale uditivo esterno (ad esempio, canale uditivo, meatus uditivo esterno, qui canale uditivo) per far sì che l'interno diventi oscurato e annerito dalla profondità. Qui, il canale uditivo è reso perpendicolare alla superficie della TM.
NOTA: Assicurarsi che il cannel uditivo sia direttamente parallelo ora e che la TM formi un angolo retto con l'asse di inserimento delle microforsors. Sarà visualizzato come un tubo nero senza luce. A volte il canale uditivo deve essere inclinato con una leggera angolazione, circa 15 gradi rispetto alla superficie planare del cranio. Questo assicura che la mano del chirurgo sia perpendicolare alla superficie della TM. - Introdurre le micro forbici al centro del canale uditivo prestando attenzione a non sfiorare o graffiare il tessuto del canale uditivo e procedere leggermente, circa 5 mm dal centro dell'oscurità, spingendo in avanti delicatamente attraverso il centro della TM.
NOTA: la foratura TM può essere confermata da un suono pop quando le punte micro-forbice perforano la TM. Il suono popping può essere ascoltato a circa 2 min 52 s nel video. Questo non è un suono forbice; questo è un suono di puntura TM. Come misurato dopo l'analisi, il "pop" è di circa 20 dB SPL maggiore del suono di sottofondo come registrato da un microfono ad alta frequenza. Non c'è bisogno di verificare il suono "pop" in questa misura, la visualizzazione dell'otoscopio è sufficiente. L'investigatore potrebbe dover praticare l'esentire di un "pop" durante ogni procedura di CHL. - Aprire immediatamente le micro forbici a molla e ruotare tre volte dopo aver forato la TM per garantire lo spostamento della testa del malleus lontano dal TM (solo se si desidera lo spostamento malleo).
- Rimuovere le microfors afors e posizionare il roditore sotto l'otoscopio per la visualizzazione.
NOTA: È importante notare che non dovrebbe verificarsi alcun sanguinamento significativo dopo la procedura chirurgica. Eutanasia il roditore e non procedere alla valutazione comportamentale se si verifica un sanguinamento. - Indurre CHL bilaterale procedendo come sopra nell'orecchio opposto.
4. Visualizzazione otoscopio
- Confermare un intervento chirurgico CHL di successo con un otoscopio utilizzando uno speculum di piccolo diametro per visualizzare l'orecchio medio del roditore.
- Valutare ogni roditore prima e dopo la procedura chirurgica CHL sotto l'otoscopio. Garantire la conferma della normale TM (Figura 2a) e della TM danneggiata dopo l'induzione di CHL (Figura 2b).
-
Cura post-operatoria per il roditore
- Posizionare il roditore nella gabbia di casa sotto una lampada calda.
- Osservare l'induzione del roditore dopo la CHL fino a quando i diritti del roditore stesso.
- Iniettare il roditore con il siero di glucosio (dextrose/saline) per recuperare coscienza e mettere il roditore nella gabbia di casa per il recupero.
NOTA: Utilizzare un ago da 23G con una siringa da 10 mL per iniettare 5 mL di salina dopo l'intervento chirurgico CHL. - Iniettare il roditore via intramuscolare con Enrofloxacin antibatterico 0,05 mg/kg due volte durante il periodo di recupero di 24 ore.
- Osservare regolarmente il roditore per il comportamento del dolore o sintomi dopo l'intervento chirurgico.
5. Valutazione comportamentale (convalida dell'induzione della CHL) - risposta clap startle
- Corroborato CHL (dopo la conferma dell'otoscopio) 24 ore dopo l'intervento chirurgico con la valutazione comportamentale costituita dal clap-startle-test.
- Posizionare il ratto indotto dalla CHL accanto a un ratto normale in due gabbie adiacenti separate.
- Mettere i roditori in una stanza silenziosa.
- Stare a circa 0,5 m di distanza dai roditori e procedere a applaudire con durate egualmente distanziate un certo numero di volte (5 applausi sono stati scelti e distanziati su 1 secondo).
NOTA: L'applauso prodotto dall'applauso della mano misurato 40 dB SPL maggiore del suono di sottofondo come registrato da un microfono ad alta frequenza.
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Representative Results
La semplice procedura CHL è stata eseguita su 90 ratti e da questo gruppo 2 ha avuto sanguinamento significativo e 2 non hanno avuto perdita dell'udito il giorno successivo, come valutato da clap startle comportamentale. Questi quattro ratti sono stati scartati. I ratti dovrebbero essere scartati come descritto dai motivi della discussione a causa di complicazioni. L'induzione di foratura e/o malleus spostamento/rimozione di malleus (Figura 2B) provoca CHL, che si traduce in manifestazioni comportamentali (cioè CHL - nessuna risposta al forte dB SPL startle). I ratti devono essere controllati per otoscopio prima dell'intervento chirurgico per garantire la normale membrana timpanica e dopo l'intervento chirurgico per garantire la puntura della membrana timpanica (Figura 2; Figura supplementare 1). Nota, nessuna emorragia o infiammazione significativa dovrebbe verificarsi ( Figurasupplementare 2). Il roditore indotto CHL non risponde ad un forte suono di applausi dB SPL, mentre un compagno di gabbia di controllo che sente il controllo salterà all'applauso forte. Il ratto CHL non è sordo al suono, ma ha una CHL e quindi sottili manifestazioni comportamentali si verificano5. Un roditore udito di controllo reagisce vigorosamente con salti a un forte suono dB SPL, come l'applauso spaventato. La risposta di salto/risposta è chiaramente visibile nel video dal compagno della gabbia uditiva, mentre il ratto indotto CHL non risponde. Il comportamento per un ratto CHL può essere più sottile. Dimostriamo il riflesso generale dell'applauso per un ratto CHL rappresentativo e controlliamo il ratto acustico. Nel corso del tempo chirurgia post-CHL alcuni ratti possono ritrovare la risposta di applausi spavento.
Utilizzando la procedura CHL, studi precedenti hanno studiato le manifestazioni neurali della perdita dell'udito. Ad esempio, il grado di perdita dell'udito seguito alla procedura è stato quantificato misurando i potenziali evocati uditivi15,16,17, le registrazioni della finestra rotonda4,18e soglie uditive comportamentali5. L'attività neurale dopo CHL è stata studiata con il metodo 2-deoxyglucose e le registrazioni intere cellule4,16,17. Anche l'attività nervosa uditiva è stata esaminata con le registrazioni della finestra rotonda18. Le soglie di rilevamento della modulazione di frequenza sono state studiate comportamentalmente5. Questa procedura CHL è chiaramente compatibile con una vasta gamma di metodi sperimentali per studi dettagliati sulla perdita dell'udito.
Figura 1: Configurazione chirurgica. A) Posizionare il roditore in un'area ben illuminata con una lampada chirurgica. Anestesizza il roditore. Preparare un assortimento di microforsors, se il più piccolo non funziona, una coppia più grande può garantire la foratura TM. Assicurarsi che l'otoscopio sia pronto. B)Microforsa a molla. Le pinzette saranno sufficienti se lo sperimentatore può controllare l'apertura e la chiusura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Membrana tipopanica rappresentativa. A)Membrana timpanica (TM) prima della puntura. B) TM dopo la foratura. Quando si esegue la conferma della foratura CHL e TM con l'otoscopio, è imperativo notare prima la testa del malleus e dopo l'induzione di CHL, una rimozione e una puntura di TM di successo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Informazioni supplementari Figura 1: Prima e dopo l'intervento chirurgico CHL come visualizzato da un otoscopio. Visualizzazione dell'otoscopio prima e dopo l'intervento chirurgico CHL (immediato) in ratto identico. La colonna sinistra delle figure sono i canale uditivo del ratto rappresentativi visualizzati prima della procedura CHL per otoscopio con ossicle normali di TM e medio orecchio. La colonna destra delle figure sono i canale uditivo del ratto rappresentativo visualizzati dopo la procedura CHL da otoscopio con TM forata e ossicazioni dell'orecchio medio spostate. Sanguinamento significativo è costituito da accumulo di sangue nelle orecchie. Studiare l'anatomia dell'orecchio medio dei roditori prima di eseguire la procedura19,20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29. La visualizzazione dell'otoscopio è stata condotta 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Clicca qui per scaricare questa figura.
Supplementare Informazioni Figura 2: Controllo e dopo CHL chirurgia ratto canale uditivo come valutato dall'istologia. Vista istologica dell'orecchio medio in controllo e dopo l'intervento di CHL (Barra 500 m). I canali uditivi sono stati elaborati mediante ematossina e eosina (H&E) e Masson's Trichrome (MT) e 24 ore dopo la chirurgia post-CHL. Colonna sinistra di figure sono rappresentative sezioni istologiche del canale uditivo nei ratti di controllo. Colonna destra delle figure sono rappresentative sezioni istologiche del canale uditivo dopo la procedura CHL. Si noti che non si verifica alcuna infiammazione significativa dopo l'intervento chirurgico CHL. Nessuna differenza è stata notata fino a una settimana. Clicca qui per scaricare questa figura.
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Discussion
Descriviamo una semplice induzione chirurgica di CHL con verifica utilizzando la visualizzazione dell'otoscopio e la risposta comportamentale dell'applauso nel ratto. Qui dimostriamo il metodo sul ratto e in precedenza questo metodo è stato applicato a gerbilli e topi. Il metodo può essere facilmente adottato per altri roditori. L'induzione di CHL consente lo studio di una sottile forma di perdita dell'udito che si manifesta nelle alterazioni corticali uditive e nei risultati comportamentali psicofisici4,5,16,17,18 .
Il mancato induzione della CHL potrebbe essere dovuto a diversi motivi, come indicato di seguito. In ogni caso, si consiglia di scartare il ratto. Eutanasia il ratto se una delle orecchie sanguina. Il sanguinamento indica che le forbici hanno preso contatto con il canale uditivo e l'approccio chirurgico non era pulito. In caso contrario, si può significare che la puntura era più profonda di quanto preferito, causando danni interni, possibilmente danni cerebrali. Danni interni potrebbero significare un inserimento profondo o nicking il canale uditivo. La procedura è una membrana timpanica minimamente invasiva e/o malleus rimozione/spostamento; pertanto, non deve verificarsi alcunsanguinamento significativo (Figura supplementare 1). Se si verifica un sanguinamento significativo, eutanasia il ratto. Se durante la puntura della membrana timpanica non si sente alcun suono "pop", ciò potrebbe indicare un povero CHL, il che significa che le forbici non hanno fatto contatto diretto con la membrana timpanica. Eliminare il roditore dal gruppo ed eutanasia. Utilizzando l'otoscopio, se la visualizzazione conferma che l'orecchio medio è simile alle orecchie di controllo, ciò indica che la membrana timpanica non è stata forata. Non è stato indotto alcun CHL e quindi il roditore deve essere scartato. Se il roditore risponde al test del suono clap, deve essere scartato. Se un roditore indotto CHL salta o salta dopo i suoni delle applausi, simile al suo accoppiamento in gabbia, ciò indica che la procedura chirurgica non ha avuto successo. Una risposta a un suono di applausi indica che non si è verificato alcun CHL e il ratto deve essere scartato o eutanasia. I limiti di indurre CHL da un approccio chirurgico sono associati con la curva di apprendimento per eseguire la procedura chirurgica e la fiducia nell'esame audiologico19,20,22,23, 27,28,29. Inoltre, questo protocollo non utilizzava ABR o DPOAE per valutare la perdita dell'udito15 al fine di stabilire un protocollo semplice per gli scienziati che non hanno familiarità con le procedure audiologiche. Le procedure audiologiche ABR e DPOAE possono essere utilizzate per gli scienziati che desiderano un'ulteriore valutazione della CHL15.
Una modifica della tecnica sta utilizzando la puntura TM con spostamento malleus. Per un novizio questo può essere difficile da stabilire, ma il malleo è chiaramente visualizzato con un otoscopio in quasi tutte le orecchie dei roditori. La TM è una membrana fibrosa dall'aspetto pellucido che trasmette luce. Esercitare la verifica dell'otoscopio per stabilire una visualizzazione coerente basata sulla letteratura precedente19,20,22,23,27,28,29 . Dopo che uno è fiducioso nella visualizzazione malleus, il suo spostamento durante l'intervento chirurgico è facilmente confermato da un forte 'pop' come si può sentire a 2 min 52 s. Questo pop è un forte cambiamento dB SPL nel file audio di circa 20 dB SPL prima della torsione delle micro forbici a molla. Il forte pop conferma la foratura e il successo di TM senza danneggiare il canale uditivo. Due aspetti della procedura chirurgica devono essere eseguiti con cura: 1) assicurarsi che le microforsors siano poste al centro del canale uditivo, e 2) assicurarsi che l'angolo delle microforsors sia parallelo al canale uditivo durante la foratura verso il basso. Assicurarsi che il movimento della foratura sia rapido e una spinta verso il basso di circa 5 mm dall'apertura del canale uditivo. Ruotare e aprire le micro forbici per lo spostamento malleo, se lo si desidera.
I passaggi chiave del protocollo CHL sono garantire la puntura TM e verificare l'applauso comportamentale. Garantire la verifica della rimozione/puntura malleus della TM conferma che è stata eseguita la CHL. La verifica avviene attraverso l'esame otoscopico. I passaggi critici per la valutazione comportamentale sono garantire un applauso abbastanza forte che il roditore è sorpreso. Differenze sono state osservate quando un ratto CHL è collocato in una gabbia simile a un ratto udito; qui, un ratto è sorpreso dall'altro, anche se il ratto non riesce a sentire il suono. Un ratto/roditore spaventato spesso salta o salta, ma questo non è un criterio. Come si può osservare, il ratto CHL non si muove all'applauso. Poiché la foratura TM è una CHL, diversi livelli di suoni db SPL possono essere ascoltati dal roditore5.
Il significato principale di questo semplice metodo CHL è che può essere eseguito da una vasta gamma di ricercatori, anche con risorse solo modeste. La verifica della perdita dell'udito viene eseguita tramite la visualizzazione dell'otoscopio e la risposta comportamentale dell'applauso nel ratto. Qui dimostriamo il metodo sul ratto e in precedenza questo metodo è stato applicato a gerbilli e topi. Il metodo può essere facilmente adottato per altri roditori. L'induzione di CHL consente lo studio di una sottile forma di perdita dell'udito che si manifesta nelle alterazioni corticali uditive e nei risultati comportamentali psicofisici4,5,16,17,18 La tecnica attuale può essere combinata con l'elettrofisiologia e le tecniche comportamentali per determinare le conseguenze corticali della perdita dell'udito, che è di grande interesse per la ricerca sulla perdita dell'udito31.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interessi finanziari o non finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dall'Hong Kong Research Grants Council, Early Career Scheme, Project #21201217 to C. L., per il progetto Brain mapping ha guidato l'elettrofisiologia con applicazioni nella ricerca sull'inquinamento acustico e acustico. Ringraziamo il Posgrado en Ciencias Biomédicas, l'Instituto de Neurobiologa dell'Universidad Nacional Autnoma de México (UNAM), il Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) México per la Graduate Fellowship 578458 a FAM Manno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex, polyvinyl or nitrile gloves | AMMEX | Use unpowdered gloves 8-mil | |
| Micro spring scissors (see Fig. 1b) | RWD Life Science | S11035-08 | 8.0 cm total length, with 3.5mm cutting edge, or similar micro forceps. Standard tweezers with spring action will suffice |
| Otoscope mini 3000 | HEINE | D-008.70.120M | Standard LED otoscope will suffice |
| Rat or mouse | JAX labs | Any small rodent | |
| Small rodent cage | Tecniplast | 1284L | Need two cages to separate CHL rodent from hearing rodent. If rodents are in direct contact with one-another, they will startle each other. Cage dimensions 365 x 207 x 140 mm, floor area: 530 cm2/82.15 in2 |
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