Summary
여기에서, 우리는 박수 에 의하여 이경 시각화 및 행동 평가를 통해 외과 고막 천자 및 검증을 통해 복제 전도성 청력 손실 유도를 확립하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
전도성 난청 (CHL)은 인간에 있는 널리 퍼진 청각 손상입니다. 프로토콜의 목표는 설치류에서 CHL을 유도하기위한 간단한 수술 절차를 설명하는 것입니다. 이 프로토콜은 고막 천자에 의한 CHL을 보여줍니다. CHL 수술의 검증은 박수 깜짝 반응에 의한 이경 검사 및 행동 평가에 의해, 복제 및 신뢰성 모두, 그리고 난청이 발생했음을 입증하는 간단한 방법이다. 간단한 CHL 절차는 청력 손실 연구에서 다른 추구에 대한 재현성과 유연성으로 인해 유리합니다. 외과 적 접근법에 의한 CHL 유도의 한계는 청력 검사에서 외과 적 수술 및 자신감을 수행하는 학습 곡선과 관련이 있습니다. CHL에 의한 청각 장애를 유도하면 청력 손실의 신경 증상과 행동 결과를 쉽게 연구 할 수 있습니다.
Introduction
어린이와 성인의 난청 유병률은 각각 약 19.5%1% 및 15.2%2입니다. 그러나, 이상한 청력 검열을 가진 모든 신생아의 대략 39.3%는 질병 통제 센터에 의해 보고된 대로 구제 처리를 수신하지 않습니다3. 난청은 널리 연구된 상태이며, 설치류는 정상적인 청력 및 청력 관련 장애를 연구하는 견고한 모델입니다4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15. 전도성 청력 손실 (CHL)과 같은 청력 장애는 청각 피질4에서단기 시냅스 우울증의 증가로 이어지며, 이는 주파수 변조 감지 임계값과 관련된 얕은 심리 측정 경사를 초래합니다. 5.외과적 제거/변위에 의한 전도성 난청 모델, 고막(TM) 천자 또는 귀마개가 용이하게 사용가능하며 난청 모델5,14의 신속한 유도를 허용한다. ,15,16,17,18. 본 프로토콜 및 방법의 목적은 설치류에서 간단하고 재현 가능한 CHL 모델을 입증하는 것입니다.
본 프로토콜은 저렴하며(모든 도구에서 미화 300달러) 다른 연구 활동을 쉽게 수정할 수 있습니다. 쥐는 중이 해부학19,20,21,22,23,외과 접근법24,중이염25의모델의 상세한 평가를받았습니다. 26,27 및 TM 천공 재생16,17, 18,28,29,30,공부하기에 이상적인 모델만들기 청력 손실. 여기에서, 간단한 CHL 유도 절차는 쥐에 있는 박수 깜짝 반응으로 이경 및 행동 평가에 의하여 확인으로 기술되고, 그 때 청력 감소의 추가 후유증을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다. CHL 절차는 TM의 외과 적 천자에 의해 유도됩니다. CHL 절차의 검증은 TM의 부재를 결정하기 위해 이경 시각화에 의해 수행된다. 행동 평가는 높은 데시벨 (dB) 음압 수준 (SPL) 손 박수에 의해 수행된다. 이 방법은 이전에 다양한 설치류에 적용되었습니다. 그것은 복제하기 쉽고, 강력한 심리측정 차이와 신경생리반응의변화를 일으킨다4,5,16,17,18.
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Protocol
본 연구 및 절차는 홍콩 시립 대학, 홍콩 대학 및 홍콩 특별 행정구 보건부의 동물 연구 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물
- 2 개월의 스프라그 - Dawley (SD) 쥐를 사용합니다 (N = 90, 200-250 g).
참고 : 설치류는 홍콩 대학의 공인 실험실 동물 단위에 의해 제공되었다. - 실험실 동물 연구 실에서 일정한 25 °C 온도와 60-70 % 습도에서 쥐를 유지합니다.
- 음식과 식수, 광고 리비텀에액세스 할 수있는 12/12-h 빛 / 어두운 주기의 집 설치류.
- CHL 수술 전에 적어도 하루 동안 주택 환경에 적응 설치류.
- 스크러프에 의해 설치류를 선택하고 케타민과 자일라진 (80-100 mg / kg : 각각 5-10 mg / kg)의 칵테일로 설치류를 마취하여 복강 내 주사 (케타민 1.0 mL과 최종 농도로 자일라진 0.5 mL을 결합).
참고 : 23-25G 바늘로 1 mL의 주사기를 사용하십시오. 마취의 30 분 동안 쥐의 체중 100g 당 약 0.2 mL를 주입하십시오. - 발가락 핀치를 수행하여 통증 감각을 확인하고 적절한 마취를 확증하십시오. 깊은 발가락 핀치에 대한 반응 (뒷다리의 철수에 의해)은 부족한 마취를 나타냅니다.
2. 외과 설정
- 수술을 시작하기 전에 오토클레이브 또는 뜨거운 유리 비드 소독기의 모든 장비를 소독하십시오. 70% 에탄올로 수술 부위를 청소하십시오.
- 절차를 시작하기 전에 라텍스 장갑과 실험실 코트를 사용하십시오.
- 깨끗한 벤치에 멸균 수술 용 드레이프를 놓습니다(그림 1A).
- 귀 감염을 최소화하기 위해 수술 전에 미세 가위와 이경을 살균합니다(도 1B).
- 소독 부위에 미세 가위와 이경을 놓습니다.
- 설치류를 외과 의사와 정렬하여 수술 장에 놓습니다.
- CHL의 외과 유도를 진행하십시오.
3. 전도성 난청수술 유도
- 꼬리와 설치류의 머리를 외과 의사에게 가장 가까운 위치에 정렬하십시오.
- 건강한 고막(그림 2a)을보장하기 위해 이경 아래 설치류의 왼쪽과 오른쪽 귀를 시각화합니다. CHL 유도 전에 모든 설치류의 오른쪽 과 왼쪽 귀를 모두 평가하여 건강한 상태를 확인하십시오.
- 귀 나선을 잡고 외부 청각 운하 (즉, 외이도, 외부 청각 고기, 본원 청각 운하)를 확장하여 내부가 가려지고 깊이가 검게됩니다. 여기서, 청각 운하는 TM의 표면에 수직으로 만들어집니다.
참고 : 청각 캐널이 지금 직접 평행하고 TM이 마이크로 가위 삽입 축과 직각을 형성하도록하십시오. 그것은 빛이없는 검은 튜브로 시각화됩니다. 때로는 청각 운하를 두개골의 평면 표면에 약 15 °의 약간의 각도로 기울여야합니다. 이것은 외과 의사의 손이 TM의 표면에 수직임을 보장합니다. - 청각 운하 중앙에 있는 마이크로 가위를 소개하여 청각 운하의 조직을 탈지하거나 닉하지 않도록 주의를 기울이고, 은둔의 중심에서 약 5mm 정도, TM의 중심을 통해 부드럽게 앞으로 밀어 넣습니다.
참고 : 마이크로 가위 팁TM을 뚫을 때 TM 펑크는 팝 사운드로 확인할 수 있습니다. 터지는 소리는 비디오에서 약 2 분 52 s에서 들을 수 있습니다. 이것은 가위 소리가 아닙니다. 이것은 TM 펑크 소리입니다. 분석 후 측정된 바와 같이, "팝"은 고주파 마이크에 의해 기록된 배경 사운드보다 약 20dB SPL 더 큽니다. 이 정도까지 "팝"소리를 확인할 필요가 없습니다, 이경 시각화는 충분하다. 조사관은 각 CHL 절차 중에 '팝'이 들리도록 연습해야 할 수도 있습니다. - 즉시 스프링로드 마이크로 가위를 열고 TM에서 멀리 malleus의 머리의 변위를 보장하기 위해 TM을 천공 후 세 번 회전 (malleus 변위가 필요한 경우에만).
- 마이크로 가위를 제거하고 시각화를 위해 이경 아래에 설치류를 놓습니다.
참고 : 수술 후 중요한 출혈이 발생하지 않아야한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 설치류를 안락사시키고 출혈이 발생하면 행동 평가를 진행하지 마십시오. - 반대쪽 귀에서 위와 같이 진행하여 양측 CHL을 유도합니다.
4. 이경 시각화
- 설치류 중이를 시각화하기 위해 작은 직경의 speculum을 사용하여 이경으로 성공적인 CHL 수술을 확인하십시오.
- 이경 아래 의 CHL 수술 전후에 모든 설치류를 평가하십시오. CHL 유도 후 정상 TM(그림2a)과손상된 TM의 확인을 확인합니다(그림2b).
-
설치류에 대한 수술 후 치료
- 설치류를 따뜻한 램프 아래에 집 케이지에 놓습니다.
- 설치류 권리 자체가 될 때까지 설치류 사후 CHL 유도를 관찰하십시오.
- 의식을 회복하고 회복을 위해 홈 케이지에 설치류를 배치하기 위해 포도당 (덱스트로스 / 식염수) 혈청으로 설치류를 주입하십시오.
참고: CHL 수술 후 식염수 5mL를 주입하기 위해 10 mL 주사기가 있는 23G 바늘을 사용하십시오. - 항균 Enrofloxacin와 근육을 통해 설치류를 주입 0.05 mg/kg 동안 두 번 24 시간 복구 기간.
- 수술 후 통증 이나 증상에 대 한 정기적으로 설치류를 관찰.
5. 행동 평가 (CHL 유도의 유효성 검사) - 박수 깜짝 응답
- Corroborate CHL (이경 확인 후) 24 시간 후 수술 후 박수 -깜짝 테스트로 구성된 행동 평가.
- CHL 유도 된 쥐를 두 개의 별도 인접 케이지에 정상적인 쥐 옆에 놓습니다.
- 설치류를 조용한 방에 놓습니다.
- 설치류에서 약 0.5m 떨어진 곳에 서서 동일한 간격으로 박수를 치기 위해 여러 번 (5 개의 박수가 선택되고 1 초 이상 간격을 두는 경우).
참고: 손박수로 생성된 박수 의기판은 고주파 마이크에 의해 기록된 배경 사운드보다 40dB SPL 더 큰 측정을 측정했습니다.
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Representative Results
간단한 CHL 절차는 90 마리의 쥐에 수행되었고이 그룹 2에서 상당한 출혈이 있었고 2는 행동 박수 에 의해 평가된 대로 다음날 청력 손실이 없었습니다. 이 네 마리의 쥐는 버려졌다. 쥐는 합병증으로 인해 논의의 이유에 의해 설명 된 대로 폐기되어야한다. TM 천자 및/또는 malleus 변위/제거를 유도(그림 2B)행동 표현 (즉, CHL - 큰 소리로 dB SPL 깜짝 놀라게에 대한 응답 없음)을 초래CHL을 유도합니다. 쥐는 정상적인 고막 막을 보장하기 위해 수술 전에 이경에 의해 검사되어야하고 수술 후 고막 막 천장을 보장하기 위해(그림 2; 보충 그림 1). 참고, 출혈이나 유의한 염증이 발생하지 않아야합니다(보충 그림 2). CHL 유도 설치류는 큰 dB SPL 박수 소리에 반응하지 않는 반면 제어 청력 케이지 메이트는 큰 박수로 이동합니다. CHL 쥐는 소리에 귀머거리가 아니지만 CHL이 있으므로 미묘한 행동 징후가5. 제어 청각 설치류는 박수 소리와 같은 큰 dB SPL 소리에 도약과 적극적으로 반응합니다. 점프/깜짝 반응은 청각 케이지 메이트의 비디오에서 명확하게 볼 수 있으며 CHL 유도 된 쥐는 반응하지 않습니다. CHL 쥐에 대한 동작은 미묘할 수 있습니다. 우리는 대표적인 CHL 쥐 및 제어 청력 쥐에 대한 일반적인 박수 깜짝 반사를 보여줍니다. 시간이 지남에 따라 CHL 수술 후 일부 쥐 박수 깜짝 반응을 회복 할 수 있습니다.
CHL 절차를 사용하여, 이전 연구는 청력 손실의 신경 증상을 조사했다. 예를 들어, 절차에 따른 난청의 정도는 청각 적기 전위를 측정하여 정량화되었습니다15,16,17,둥근 창 녹음4,18,및 행동 청력 임계값5. CHL에 따른 신경 활성은 2-다옥시글루코스 방법 및전세포 기록4,16,17로연구되었다. 청각 신경 활동은 또한 둥근 창 기록18로검토되었습니다. 주파수 변조 검출 임계값은 동작적으로 연구되었습니다5. 이 CHL 절차는 청력 손실에 대한 상세한 연구를 위한 광범위한 실험 방법과 명확하게 호환됩니다.
그림 1: 수술 설정. A)설치류를 수술용 램프가 있는 조명이 잘 된 곳에 놓습니다. 설치류를 마취. 작은 작동하지 않는 경우, 마이크로 가위의 구색을 준비, 큰 쌍은 TM 펑크를 보장 할 수 있습니다. 이경이 준비되었는지 확인합니다. B)스프링로드 마이크로 가위. 피실험자가 개폐를 제어할 수 있다면 핀셋으로 충분합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 대표적인 고막. A)천공 전에 고막 (TM). B)펑크 후 TM. 이경으로 CHL 및 TM 천자 확인을 수행 할 때, 먼저 malleus의 머리를 주의하고 CHL 유도 후, TM의 성공적인 제거 및 천자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 정보 그림 1: 이경에 의해 시각화된 CHL 수술 전후. 동일한 쥐에서 CHL 수술 전후 (즉각적인) 이경 비주얼리제이티 시각화. 그림의 왼쪽 열은 일반적인 TM 및 중이 소골이 있는 이경에 의해 CHL 절차 의 앞에 시각화된 대표적인 쥐 청각 운하입니다. 그림의 오른쪽 열은 천공 된 TM과 변위 된 중이 소골이있는 이경에 의해 CHL 절차 후에 시각화 된 대표적인 쥐 청각 운하입니다. 중요한 출혈은 귀에 혈액 축적으로 구성됩니다. 절차를 수행하기 전에 설치류의 중이 해부학을 공부19,20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29. 이경 시각화는 수술 후 24시간 동안 수행되었다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 정보 그림 2: 통제 및 CHL 수술 후 쥐 청각 운하 는 학회에 의해 평가. 제어 및 CHL 수술 후 중이의 조직학적보기 (바 = 500 μm). 청각 운하는 헤마톡실린과 에오신 (H&E) 및 매슨의 삼조 (MT) 제어 염색및 24 시간 CHL 수술 후 염색에 의해 처리되었다. 수치의 왼쪽 열은 제어 쥐에서 청각 운하의 대표적인 조직학적 섹션입니다. 수치의 오른쪽 열은 CHL 절차 후 청각 운하의 대표적인 조직학적 섹션입니다. CHL 수술 후 심각한 염증이 발생하지 않습니다. 1 주일까지 차이가 발견되지 않았습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 쥐에 있는 이경 비주얼리제이션 및 행동 박수 깜짝 반응을 사용하여 확인을 가진 CHL의 간단한 외과 감응을 기술합니다. 여기에서 우리는 쥐에 방법을 설명하고 이전에이 방법은 gerbils 및 마우스에 적용되었습니다. 이 방법은 다른 설치류에 쉽게 채택 될 수 있습니다. CHL의 유도는 청각 피질 변경 및 정신 물리학 행동 사실 인정에 명시되는 청력 손실의 미묘한 양식의 연구 결과를허용합니다4, 5,16,17, 18 .
CHL을 유도하지 못하는 것은 아래에 나열된 여러 가지 이유로 인한 것일 수 있습니다. 각각의 경우에, 우리는 쥐를 폐기하는 것이 좋습니다. 귀 중 하나가 출혈하는 경우 쥐를 안락사. 출혈은 가위가 청각 운하와 접촉하고 수술 접근법이 깨끗하지 않음을 나타냅니다. 그렇지 않으면, 그것은 펑크가 바람직한 것보다 더 깊었음, 내부 손상, 아마도 뇌 손상을 일으키는 것을 의미 할 수있다. 내부 손상은 깊은 삽입 또는 청각 운하를 닉킹 을 의미 할 수있다. 절차는 최소 침습 적 고막 및 / 또는 malleus 제거 / 변위; 따라서 심각한 출혈이 발생하지 않아야합니다(보충 그림 1). 상당한 출혈이 발생하면 쥐를 안락사시하십시오. 고막 천자 중에 "팝" 소리가 들리지 않으면 CHL이 불량하여 가위가 고막과 직접 접촉하지 않았음을 나타낼 수 있습니다. 설치류를 그룹에서 버리고 안락사한다. 이경을 사용하여 중이가 제어 귀와 유사하다는 것을 시각화하면 고막이 구멍이 뚫리지 않았다는 것을 나타냅니다. CHL이 유발되지 않았기 때문에 설치류를 폐기해야합니다. 설치류가 박수 소리 테스트에 응답하면 폐기해야합니다. CHL유도 설치류 도약 또는 박수 소리 후 점프 하는 경우, 그것의 케이지 메이트와 유사, 이것은 수술 이 성공 하지 않은 나타냅니다. 박수 소리에 대한 응답은 CHL이 발생하지 않았으며 쥐를 폐기하거나 안락사시켜야 한다는 것을 나타냅니다. 외과적 접근법에 의한 CHL 유도의 한계는 청각검사19,20,22,23, 27,28,29. 또한, 이 프로토콜은 청력 학적 절차에 익숙하지 않은 과학자를위한 간단한 프로토콜을 확립하기 위해 청력 손실평가 15를 위해 ABR 또는 DPOAE를 사용하지 않았습니다. 청각 학적 절차 ABR 및 DPOAE는 CHL15의추가 평가를 원하는 과학자를 위해 사용될 수 있습니다.
이 기술의 수정은 Malleus 변위와 TM 펑크를 사용하는 것입니다. 초보자를 위해 이것은 설치하기 어려울지도 모르지만, malleus는 거의 모든 설치류 귀에 있는 이경으로 명확하게 구상됩니다. TM은 빛을 전달하는 투명한 외관을 가진 섬유막입니다. 이전 문헌19,20,22,23,27,28,29에 기초하여 일관된 시각화를 확립하기 위해 이경 검증을 연습 . malleus 시각화에 자신감을 가지고 나면 수술 중 변위는 2 분 52 s에서들을 수있는 큰 소리로 '팝'으로 쉽게 확인됩니다. 이 팝은 스프링 로드 마이크로 가위의 비틀기 전에 약 20 dB SPL의 오디오 파일에서 큰 소리로 dB SPL 변화이다. 시끄러운 팝은 청각 운하를 손상시키지 않으면서 TM 펑크와 성공을 확인합니다. 외과 적 수술의 두 가지 측면은주의하여 수행해야합니다 : 1) 마이크로 가위가 청각 운하의 중심에 배치되도록하고 2) 미세 가위의 각도가 하향 천자 동안 청각 운하와 평행하게 되도록합니다. 청각 운하의 개통에서 펑크 모션이 빠르고 약 5mm 하향 추력인지 확인하십시오. 바람직할 경우 소가위를 회전하고 열면 변위가 양상을 나타낸다.
CHL 프로토콜의 주요 단계는 TM 펑크를 보장하고 행동 박수 시작을 확인하는 것입니다. TM의 쇼핑몰 제거/펑크에 대한 확인을 확인하여 CHL이 수행되었음을 확인합니다. 검증은 이오스 검사를 통해 이루어집니다. 행동 평가를 위한 중요한 단계는 설치류가 깜짝 놀랄 만큼 큰 박수를 치도록 하는 것입니다. CHL 쥐가 청각 쥐와 유사한 케이지에 배치 될 때 차이점이 지적되었습니다. 여기서, 한 쥐는 쥐가 소리를들을 수없는 경우에도, 다른 에 의해 깜짝 놀라게된다. 깜짝 놀란 쥐 /설치류는 종종 점프하거나 홉하지만, 이것은 기준이 아닙니다. 관찰할 수 있는 바와 같이, CHL 래트는 박수로 이동하지 않는다. TM 펑크는 CHL이기 때문에 설치류5에서다양한 수준의 db SPL 사운드를 들을 수 있습니다.
이 간단한 CHL 방법의 주요 중요성은 단지 겸손한 자원으로도 광범위한 연구원에 의해 수행 될 수 있다는 것입니다. 청력 손실의 확인은 쥐에 있는 이경 시각화 및 행동 박수 깜짝 반응에 의해 수행됩니다. 여기에서 우리는 쥐에 방법을 설명하고 이전에이 방법은 gerbils 및 마우스에 적용되었습니다. 이 방법은 다른 설치류에 쉽게 채택 될 수 있습니다. CHL의 유도는 청각 피질 변경 및 정신 물리학 행동 사실 인정에 명시되는 청력 손실의 미묘한 양식의 연구 결과를허용합니다4, 5,16,17, 18 본 기술은 청력 손실 연구에 큰 관심이있는 청력 손실의 피질 결과를 결정하기 위해 전기 생리학 및 행동 기술과 결합 될 수 있습니다31.
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Disclosures
저자는 이해관계의 재정적 또는 비재정적 충돌을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 홍콩 연구 보조금 위원회, 초기 경력 계획, 프로젝트 #21201217 C. L.에 의해 부분적으로 지원되었다, 프로젝트 뇌 매핑 청각 및 소음 공해 연구에 응용 프로그램과 전기 생리학을 안내. 우리는 포스그라도 엔 시엔시아스 Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma 드 멕시코 (UNAM)의 인스티투토 드 Neurobiología, 대학원 펠로우십에 대한 콘세조 Nacional 드 시엔시아 y Tecnología (CONACyT) 멕시코 에 FAM Manno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex, polyvinyl or nitrile gloves | AMMEX | Use unpowdered gloves 8-mil | |
| Micro spring scissors (see Fig. 1b) | RWD Life Science | S11035-08 | 8.0 cm total length, with 3.5mm cutting edge, or similar micro forceps. Standard tweezers with spring action will suffice |
| Otoscope mini 3000 | HEINE | D-008.70.120M | Standard LED otoscope will suffice |
| Rat or mouse | JAX labs | Any small rodent | |
| Small rodent cage | Tecniplast | 1284L | Need two cages to separate CHL rodent from hearing rodent. If rodents are in direct contact with one-another, they will startle each other. Cage dimensions 365 x 207 x 140 mm, floor area: 530 cm2/82.15 in2 |
References
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