使用大鼠的耳镜可视化和行为拍片启动反应进行验证，对传导性听力损失进行简单手术诱导

Summary

在这里，我们提出了一个协议，通过手术性鼓膜穿刺建立可复制的传导性听力损失诱导，并通过耳镜可视化和行为评估通过拍拍惊吓进行验证。

Abstract

传导性听力损失 （CHL） 是人体常见的听力损伤。该协议的目的是描述一个简单的外科手术，诱导啮齿动物的CHL。该协议通过鼓膜穿刺演示CHL。CHL手术的验证是通过耳镜检查和行为评估，通过拍拍的启动反应，既可复制又可靠，是证明听力损失发生的简单方法。简单的CHL程序具有优越的优越性，因为其可重复性和灵活性对听力损失研究中的不同追求。通过手术方法诱导CHL的局限性与执行外科手术的学习曲线和对听力检查的信心有关。由CHL诱导听力损伤，使人们能够随时研究听力损失的神经表现和行为结果。

Introduction

儿童和成人听力损失的患病率分别为19.5%1和15.2%。然而，大约39.3%的新生儿有异常的听力筛查没有得到治疗，如疾病控制中心^报告3。听力损失是一种被广泛研究的疾病，啮齿动物是研究正常听力和听力相关^{疾病4、5、6、7、8、9}的有力模型 ^{，10，11，12，13，14，15}。听力障碍，如传导性听力损失（CHL），导致听觉皮^层4的短期突触抑郁症增加，导致与频率调制检测阈值相关的较浅的心理测量斜坡^5.通过手术去除/置换的胸膜、鼓膜 （TM） 穿刺或耳塞的传导性听力损失模型易于使用，并允许快速诱导听力损失模型^{5，14 ，15，16，17，18}.本协议和方法的目的是在啮齿类动物中演示一种简单且可重复的CHL模型。

本协议价格低廉（所有工具为300美元），可随时修改，适用于不同的研究领域。大鼠曾对中耳解剖进行了详细评估，其中19、20、21、22、23、手术^方法24、中耳炎^{模型25、 26，27}和 TM 穿刺再生^{16，17，18，28，29，30，}使其成为理想的模型研究听力损失。在这里，一个简单的CHL诱导程序描述与耳镜和行为评估验证与拍拍启动反应在大鼠，然后可用于探索听力损失的其他后遗症。CHL 程序由 TM 的手术穿刺诱导。CHL 程序的验证通过耳镜可视化执行，以确定没有 TM。行为评估由高分贝 （dB） 声压水平 （SPL） 手拍执行。该方法以前已应用于各种啮齿动物。它很容易复制，产生强大的心理测量差异和神经生理反应的变化4，5，16，17，18。

Protocol

本研究及程序获香港城市大学、香港大学及香港特别行政区卫生署动物研究伦理委员会批准。

1. 动物

1. 使用两个月的斯普拉格-道利 （SD） 大鼠（N = 90，200-250 g）。
   注：啮齿动物由香港大学认可化验动物组提供。
2. 在实验室动物研究室保持大鼠在25°C恒定的温度和60-70%的湿度下。
3. 房子啮齿动物在12/12-h光/暗周期与获得食物和饮用水，解放。
4. 在 CHL 手术前至少一天，使啮齿动物适应外壳环境。
5. 通过腹肌内注射（将1.0 mL的氯胺酮与0.5 mL的木氨酸作为最终浓度）与氯胺酮和木氨酸的鸡尾酒（分别为80-100毫克/千克：5-10毫克/千克）一起，用刮毛剂将啮齿动物麻醉。
   注：使用带23-25G针头的1mL注射器。注射约0.2 mL每100克体重的老鼠30分钟的麻醉。
6. 执行脚趾捏，以验证疼痛感和证实适当的麻醉。对深脚趾挤压的反应（通过后肢的戒断）表明麻醉不足。

2. 手术设置

1. 在开始手术之前，在高压灭菌器或热玻璃珠消毒器中对所有设备进行消毒。用70%乙醇清洁手术区域。
2. 在开始手术之前，请使用乳胶手套和实验室涂层。
3. 在干净的长凳上放置无菌手术窗帘 （图 1A）。
4. 手术前对微剪刀和耳镜进行消毒，以尽量减少耳部感染（图1B）。
5. 将微型剪刀和示波器放在无菌区域。
6. 将啮齿动物放在手术现场，并与外科医生保持一致。
7. 继续CHL的手术诱导。

3. 传导性听力损失的手术诱导

1. 将啮齿动物的尾巴和头部对齐放在一个容易的位置，头部最接近外科医生。
2. 可视化耳镜下的啮齿动物的左耳和右耳，以确保健康的鼓膜（图2a）。评估每只啮齿动物的右耳和左耳，以在CHL感应前验证健康状况。
3. 抓住耳螺旋，并延长外音管（即，耳道，外音肉，这里在听觉管），使内部变得模糊和发黑的深度。在这里，听觉通道垂直于TM的表面。
   注：确保现在直接平行的听觉罐，并且TM与微剪刀插入轴形成直角。它将被想象成一个没有光的黑管。有时听觉管需要以轻微的角度倾斜，大约 15° 到头骨的平面。这可确保外科医生的手垂直于 TM 的表面。
4. 在听觉管中心引入微剪刀，注意不要掠过或刻痕听觉管的组织，从默默无闻的中心稍微前进约5毫米，轻轻向前推过TM的中心。
   注：当微剪刀尖刺穿TM时，可以通过爆音来确认TM穿刺。在视频中，大约 2 分钟 52 秒可以听到爆裂声。这不是剪刀声;这是一个TM穿刺的声音。根据分析后测量，"爆音"大约比高频麦克风录制的背景声音大 20 dB SPL。没有必要验证"流行"的声音到这个程度，耳镜可视化就足够了。调查员可能需要练习确保在每个 CHL 过程中听到"爆音"。
5. 立即打开弹簧式微剪刀，在刺穿 TM 后旋转三次，以确保马略头从 TM 移开（仅当需要马鲁斯位移时）。
6. 取出微剪刀，将啮齿动物置于眼镜下方进行可视化。
   注意：请务必注意，在外科手术后不应出现明显的出血。对啮齿动物实施安乐死，如果发生出血，则不进行行为评估。
7. 通过在相反的耳朵中按上述方式操作，诱导双边 CHL。

4. 内窥镜可视化

1. 使用小直径镜检查，用耳镜确认成功的 CHL 手术，以可视化啮齿动物的中耳。
2. 在耳镜下方进行 CHL 外科手术前后，评估每只啮齿动物。确保确认正常TM（图2a）和CHL感应后损坏的TM（图2b）。
3. 啮齿动物术后护理
   1. 将啮齿动物放在家庭笼子里，放在温暖的灯下。
   2. 观察啮齿动物在CHL后感应，直到啮齿动物权利本身。
   3. 用葡萄糖（葡萄糖/盐水）血清给啮齿动物注射，以恢复意识，并将啮齿动物放入家笼中进行恢复。
      注：在CHL手术后，使用带10 mL注射器的23G针注射5 mL的盐水。
   4. 在24小时恢复期间，通过肌肉内注射啮齿动物，使用抗菌的Enrofxacin0.05mg/kg两次。
   5. 定期观察啮齿动物在手术后的疼痛行为或症状。

5. 行为评估（CHL 感应验证） - 拍手启动响应

1. 经证实CHL（在耳镜确认后）24小时手术后与行为评估包括拍拍测试。
2. 将CHL诱导大鼠放在两个独立相邻的笼子里，放在普通大鼠旁边。
3. 把啮齿动物放在一个寂静的房间里。
4. 站在距离啮齿动物约0.5米的地方，在相等的持续时间内长时间鼓掌（选择5拍，间隔超过1秒）。
   注： 由测量的手拍产生的拍手启动声 = 40 dB SPL 大于高频麦克风录制的背景声音。

Representative Results

简单的CHL程序对90只大鼠进行，在组2有显性出血，2没有听力损失的第二天评估的行为拍手。这四只老鼠被丢弃了。由于并发症，在讨论中的原因说明，应该丢弃大鼠。诱导TM穿刺和/或马勒鲁斯位移/去除（图2B）导致CHL，导致行为表现（即CHL - 对响亮的dB SPL起动无反应）。大鼠在手术前应接受子宫内窥镜检查，以确保子宫膜正常，术后应确保鼓膜穿刺（图2;补充图1。注意，不应出现出血或严重炎症 （补充图 2）。CHL 诱导啮齿不会响应响亮的 dB SPL 拍手声，而控制听力笼伴侣会跳到响亮的拍手。CHL大鼠不是失聪的声音，但有一个CHL，因此微妙的行为表现^发生5。控制性听力啮齿动物以跳跃的巨响（如拍拍声）强烈反应。在听力笼伴侣的视频中，跳跃/启动反应清晰可见，而CHL诱导大鼠则不作反应。CHL 大鼠的行为可能更微妙。我们演示了具有代表性的CHL大鼠和控制听力大鼠的一般拍拍反射。随着时间的推移，CHL手术后，一些大鼠可能会重新获得拍手的启动反应。

使用CHL程序，早期的研究已经研究了听力损失的神经表现。例如，通过测量听觉唤起电位 15、16、17、圆窗记录^4、18和行为听力阈值⁵。CHL之后的神经活动已经研究使用2脱氧葡萄糖法和全细胞记录4，16，17。听觉神经活动也检查与圆窗^记录18。频率调制检测阈值已经研究在^行为5。这种CHL程序与广泛的实验方法明确兼容，用于听力损失的详细研究。

图1：外科设置。 A） 用手术灯将啮齿动物放在光线良好的区域。麻醉啮齿动物。准备各种微型剪刀，如果最小的不工作，更大的一对可以确保TM穿刺。确保示波器已准备就绪。B） 弹簧加载微型剪刀。如果实验者能够控制打开和关闭，钳子就足够了。请点击此处查看此图的较大版本。

图2：代表性鼓膜。 A） 穿刺前的鼓膜 （TM）.B） 穿刺后TM。当使用耳镜执行 CHL 和 TM 穿刺确认时，必须首先注意脑膜的头部和 CHL 感应后，成功去除和刺穿 TM。请点击此处查看此图的较大版本。

补充信息图1：由耳镜可视化的CHL手术前后。同一大鼠在CHL手术前后（立即）的耳镜可视化。图的左柱是具有代表性的大鼠听觉管，在CHL手术前通过具有正常TM和中耳囊的耳镜进行可视化。右图列是具有代表性的大鼠听觉管，在CHL手术后通过带穿刺TM和移位中耳囊的耳镜进行可视化。大量出血包括耳朵的血液积累。在进行手术前，先研究啮齿动物的中耳解剖结构，然后进行^{手术19、20、21、22、23、24、25 26，27，28，29}.手术后24小时进行内窥镜可视化。请点击此处下载此图。

补充信息图2：由机构学评估的CHL手术后鼠听觉管。控制中耳和 CHL 手术后（棒 = 500 μm）的组织学视图。听觉管道由血氧素和欧辛（H&E）和马森的三铬（MT）染色控制处理，CHL手术后24小时处理。左柱数字是控制大鼠听觉运河的代表性组织学部分。右列数字是CHL程序后听觉管道的代表性组织学部分。请注意，CHL 手术后没有明显炎症。在一个星期内没有发现任何差异。请点击此处下载此图。

Discussion

我们描述了一个简单的手术诱导CHL与验证使用耳镜可视化和行为拍拍启动反应在大鼠。在这里，我们演示了方法在大鼠和以前这种方法已经应用于鼠和小鼠。该方法可以很容易地被采用到其他啮齿动物。CHL的诱导允许研究一种微妙的听力损失形式，它表现在听觉皮质改变和心理物理行为^{发现4，5，16，17，18}.

导致 CHL 失败的原因如下。在每种情况下，我们建议丢弃大鼠。如果其中一只耳朵在流血，就给老鼠安乐死。出血表明剪刀与听觉管接触，手术方法不干净。否则，它可能意味着穿刺比首选更深，造成内部损伤，可能脑损伤。内部损坏可能意味着深插入或划伤听觉管。该程序是微创性鼓膜和/或马略去除/置换;因此，不应发生大出血 （补充图 1）。如果发生大出血，对大鼠实施安乐死。如果在鼓膜穿刺过程中听不到"爆裂"声音，这可能表示 CHL 较差，这意味着剪刀未直接接触鼓膜。将啮齿动物从组中丢弃并安乐死。使用耳镜，如果可视化确认中耳类似于控制耳朵，这表示鼓膜没有被刺穿。没有诱导CHL，因此啮齿动物应被丢弃。如果啮齿动物响应拍声测试，则应丢弃。如果CHL诱导啮齿动物跳跃或跳跃后拍拍的声音，类似于它的笼伴侣，这表明外科手术不成功。对拍手声的响应表明没有发生 CHL，应丢弃或安乐死大鼠。通过手术方法诱导CHL的局限性与执行外科手术的学习曲线和对听力检查19、20、22、23^{的信心有关。 27，28，29}.此外，该协议没有使用ABR或DPOAE来评估听力^损失15，以便为不熟悉听力程序的科学家建立一个简单的协议。听力程序ABR和DPOAE可用于科学家谁想要进一步评估CHL^15。

该技术的修改是使用TM穿刺与马鲁斯位移。对于新手来说，这也许很难确定，但几乎所有啮齿动物耳朵上都有耳镜，可以清楚地显示这种眼镜。TM是一种纤维膜，具有透射光的透光外观。实践窥镜验证，以建立一致的可视化基于以前的文献^{19，20，22，23，27，28，29}.在一个人对Malleus可视化有信心后，它在手术过程中的位移很容易被一个响亮的"爆"来确认，因为可以听到2分52秒。此弹出是在大约 20 dB SPL 的音频文件中的响亮 dB SPL 变化之前，弹簧加载的微型剪刀扭曲。响亮的爆裂证实了TM穿刺和成功，而不会损坏听觉管。手术的两个方面必须小心进行：1） 确保微剪刀放置在听觉管的中心;2） 确保微剪刀的角度与向下穿刺期间的听觉管平行。确保穿刺运动快速，从听觉管的开口处向下推力约为 5 mm。如果需要，旋转并打开微剪刀，用于马勒鲁斯位移。

CHL 协议的关键步骤是确保 TM 穿刺和验证行为拍拍。确保验证TM的除刺/穿刺确认CHL已执行。验证是通过镜检查完成的。行为评估的关键步骤是确保足够响亮的拍手声，使啮齿动物大吃一顿。当CHL大鼠被放置在与听鼠相似的笼子里时，已经注意到差异;在这里，一只老鼠被另一只老鼠吓了一步，即使老鼠听不到声音。吓了一跳的老鼠/老鼠经常跳或跳，但这不是一个标准。正如可以观察到的，CHL 大鼠不会移动到拍片。由于TM穿刺是CHL，不同级别的db SPL声音可能听到啮^{齿动物5。}

这种简单的CHL方法的主要意义是，它可以由广泛的研究人员执行，即使只有少量的资源。听力损失的验证通过耳镜可视化和行为拍拍反应在大鼠。在这里，我们演示了方法在大鼠和以前这种方法已经应用于鼠和小鼠。该方法可以很容易地被采用到其他啮齿动物。CHL的诱导允许研究一种微妙的听力损失形式，它表现在听觉皮质改变和心理物理行为^{发现4，5，16，17，18}本技术可结合电生理学和行为技术来确定听力损失的皮质后果，这对听力^{损失研究具有}十分重要的意义。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Latex, polyvinyl or nitrile gloves	AMMEX		Use unpowdered gloves 8-mil
Micro spring scissors (see Fig. 1b)	RWD Life Science	S11035-08	8.0 cm total length, with 3.5mm cutting edge, or similar micro forceps. Standard tweezers with spring action will suffice
Otoscope mini 3000	HEINE	D-008.70.120M	Standard LED otoscope will suffice
Rat or mouse	JAX labs		Any small rodent
Small rodent cage	Tecniplast	1284L	Need two cages to separate CHL rodent from hearing rodent. If rodents are in direct contact with one-another, they will startle each other. Cage dimensions 365 x 207 x 140 mm, floor area: 530 cm2/82.15 in2