Summary
ここでは、外科的鼓膜穿刺による複製導電性難聴誘導を確立するプロトコルを提示し、拍手驚きによる耳鏡可視化と行動評価による検証を行う。
Abstract
伝音難聴(CHL)は、ヒトで一般的な聴覚障害である。プロトコルの目的は、げっ歯類でCHLを誘導するための簡単な外科的処置を記述することです。プロトコルは、鼓膜穿刺によってCHLを示す。CHL手術の検証は、拍手驚くべき応答による耳鏡検査と行動評価によるものであり、複製性と信頼性の高い両方であり、難聴を実証する簡単な方法が生じた。簡単なCHLプロシージャは難聴の研究の異なった追求への再現性および柔軟性のために有利である。外科的アプローチによってCHLを誘導する限界は、外科的処置およびオーディオ検査における自信を行う学習曲線に関連している。CHLによる聴覚障害を誘発すると、難聴の神経症状や行動の結果を容易に研究することができます。
Introduction
小児と成人の難聴の有病率はそれぞれ約19.5%1%と15.2%2である。 しかし、異常聴力スクリーニングを受けた全新生児の約39.3%は、疾病管理センター3の報告に従って修復治療を受けていない。難聴は広く研究されている状態であり、げっ歯類は正常な聴覚および聴覚関連障害を研究するための堅牢なモデルである4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15.導電性難聴(CHL)などの聴覚障害は、聴覚皮質4における短期シナプスうつ病の増加につながり、周波数変調検出閾値に関連するより浅い心理測定勾配をもたらす5.マレウスの外科的除去/変位による導電性難聴モデル、鼓膜(TM)穿刺または耳栓が容易に採用され、難聴モデル5、14の迅速な誘導を可能にする,15,16,17,18.本プロトコルおよび方法の目的は、げっ歯類で簡単で再現性の高いCHLモデルを実証することです。
現在のプロトコルは安価で(すべてのツールで300ドル)、異なる研究の追求に容易に修正できます。ラットは中耳解剖学19、20、21、22、23、外科的アプローチ24、中耳炎媒体25のモデルの詳細な評価を有している。 26、27およびTM穿刺再生16、17、18、28、29、30 、研究に理想的なモデル難聴。ここでは、ラットにおけるクラップ驚き応答による耳鏡および行動評価による検証を行い、難聴の追加の後遺症を探索するために使用することができるという単純なCHL誘導手順について説明する。CHL処置はTMの外科的穿刺によって誘発される。CHL手順の検証は、TMの不在を判定するために耳鏡可視化によって行われる。行動評価は高デシベル(dB)音圧レベル(SPL)手拍子によって行われる。この方法は、以前に様々なげっ歯類に適用されています。複製が容易であり、強固な心理測定の違いと神経生理学的応答の変化を生み出す4,5,16,17,18.
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Protocol
本研究と手続きは、香港市立大学、香港大学、香港特別行政区保健省の動物研究倫理委員会によって承認された。
1. 動物
- 2ヶ月のスプレイグ・ドーリー(SD)ラット(N = 90、200-250 g)を使用します。
注:げっ歯類は、香港大学の認定実験動物ユニットによって提供されました。 - 実験動物研究ユニットで、ラットを一定の25°C温度と60~70%の湿度で維持します。
- 食べ物や飲料水、アドリビタムへのアクセスと12/12-hの光/暗いサイクルで家のげっ歯類.
- CHL手術の少なくとも1日前の住宅環境への順応げげげ。
- スクラップでげっ歯類をピックアップし、腹腔内注射(最終的な濃度として0.5 mLのキシラジンとケタミンの1.0 mLを組み合わせる)を介してケタミンとキシラジン(それぞれ80-100 mg/kg:5-10 mg/kg)のカクテルでげっ歯類を麻酔します。
メモ:23-25G針で1 mLの注射器を使用してください。麻酔の30分間ラットの体重100gあたり約0.2 mLを注入する。 - つま先のピンチを実行して痛みの感覚を確認し、適切な麻酔を腐食します。深いつま先のピンチに対する反応(後肢の離脱による)は、麻酔が不十分であることを示す。
2. 外科的セットアップ
- 手術を開始する前に、オートクレーブまたはホットガラスビーズ滅菌器ですべての機器を殺菌します。70%エタノールで手術領域をきれいにします。
- 手順を開始する前に、ラテックス手袋とラボコートを使用してください。
- 無菌の手術用ドレープをクリーンベンチに置きます(図1A)。
- 耳の感染を最小限に抑えるために、手術前にマイクロハサミと耳鏡を殺菌する(図1B)。
- マイクロハサミとオトスコープを無菌領域に置きます。
- げっ歯類を外科分野に置き、外科医と一致させろ。
- CHLの外科的誘導を進める。
3. 導電性難聴の外科的誘導
- 尾部とげっ歯類の頭部を外科医に最も近い位置に位置合わせします。
- 耳鏡下のげっ歯類の左右の耳を視覚化して、健康な鼓膜を確保する(図2a)。すべてのげっ歯類の右耳と左耳の両方を評価し、CHL誘導の前に健康な状態を確認します。
- 耳のらせんをつかみ、外耳道(すなわち、外耳道、外耳道、本明細書では聴覚外耳道)を拡張し、内部が深さによって隠れ、黒くなる原因となる。ここで、聴覚管は、TMの表面に対して垂直に作られる。
メモ:聴覚のカネルが今すぐ直接平行であり、TMがマイクロハサミの挿入軸で直角を形成していることを確認してください。光のない黒い管として可視化されます。時には聴道は、頭蓋骨の平坦な表面に約15°、わずかな角度で傾ける必要があります。これは外科医の手がTMの表面に対して垂直であることを保障する。 - 聴覚管の中央にマイクロハサミを導入し、聴覚管の組織をスキミングしたりニックしたりしないように注意してわずかに進み、不明瞭の中心から約5mm、TMの中心をゆっくりと前方に突き出します。
注:TM穿刺は、マイクロハサミの先端がTMを穿刺するときにポップ音で確認することができます。ポップ音は、ビデオで約2分52 sで聞くことができます。これははさみの音ではありません。これはTMの穿刺音です。測定後分析として、「ポップ」は、高周波マイクロホンで記録されたバックグラウンドサウンドよりも約20dB SPL大きいと言います。この程度まで「ポップ」音を検証する必要はなく、オトスコープの可視化で十分である。調査官は、各CHL手順の間に「ポップ」が聞こえるように練習する必要があるかもしれません。 - すぐにバネ付きマイクロハサミを開き、TMを穿刺した後に3回回転させて、TMから離れたマレの頭部の変位を確保します(マレウス変位が望ましい場合のみ)。
- マイクロハサミを取り外し、歯付けをオトスコープの下に置いて可視化します。
注:外科的処置の後に重大な出血が起こるべきではないことに注意することが重要です。げっ歯類を安楽死させ、出血が起こった場合は行動評価に進まない。 - 反対側の耳で上記のように進むまでに両側CHLを誘導する。
4. オトスコープの可視化
- げっ歯類の中耳を視覚化するために小径鏡を使用して耳鏡で成功したCHL手術を確認します。
- 耳鏡の下のCHLの外科的処置の前後のすべてのげっ歯類を評価する。CHL誘導後に正常なTM(図2a)と損傷したTMの確認を確認します(図2b)。
-
げっ歯類の術後ケア
- 暖かいランプの下にホームケージにげっ歯類を置きます。
- げっ歯類の権利そのものまで、げっ歯類のポストCHL誘導を観察してください。
- 歯類にブドウ糖(デキストロース/生理食リン)血清を注入して意識を回復させ、回復のためにホームケージにげっ歯類を置きます。
注:10 mLの注射器を備えた23G針を使用して、CHL手術後に5mLの生理塩水を注入します。 - 24時間の回復期間中に抗菌エンロフロキサシン0.05 mg/kgで筋肉内を介してげっ歯類を注射します。
- 手術後の痛みの挙動や症状については、げっ歯類を定期的に観察してください。
5. 行動評価(CHL誘導の検証) - 拍手驚くべき応答
- 腐食性CHL(耳鏡確認後)24時間は、拍手驚き試験からなる行動評価を伴う手術後。
- CHL誘導ラットを通常のラットの隣に2つの別々の隣接ケージに配置します。
- げっ歯類を静かな部屋に置きます。
- げっ歯類から約0.5m離れた場所に立ち、同じ間隔で何度も拍手を続けます(5拍手が選択され、1秒以上間隔を空けます)。
メモ:手拍子で生成された拍手の驚きは、高周波マイクロホンで記録されたバックグラウンドサウンドよりも40 dB SPL大きいです。
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Representative Results
単純なCHL処置は90匹のラットに対して行われ、このグループ2のうち有意な出血があり、2は行動拍手の驚きによって評価された翌日難聴を有しなかった。この4匹のラットは廃棄された。ラットは、合併症のために議論の理由によって説明されているように廃棄されるべきである。TM穿刺および/またはマレウス変位/除去(図2B)を誘導するとCHLが引き起こされ、行動症状が現れる(すなわちCHL - 大きなdB SPLの驚きに対する応答なし)。ラットは、正常な鼓膜を確保するために手術前および手術後に、鼓膜穿刺を確実にするために、手術前にオトスコープによってチェックされるべきである(図2;補足図 1) 。出血や重大な炎症は起こってはならないことに注意してください(補足図2)。CHL誘導げっ歯類は大きなdB SPLの拍手音に反応しませんが、コントロール聴覚ケージメイトは大きな拍手にジャンプします。CHLラットは音が聞こえないが、CHLを持っているので、微妙な行動の症状が発生する5.コントロール聴覚げっ歯類は、拍手の驚きのような大きなdB SPL音に飛躍して激しく反応します。ジャンプ/驚くべき応答は、CHL誘導ラットが応答しない間、聴覚ケージメイトからのビデオではっきりと見えます。CHLラットの動作は微妙かもしれません。代表的なCHLラットおよびコントロールヒアリングラットに対する一般的な拍手驚き反射を実証する。時間が経つにつれて、CHL手術後に、いくつかのラットは拍手の驚くべき応答を取り戻すことがあります。
CHL手順を用いて、以前の研究は難聴の神経症状を調査した。例えば、手順に従う難聴の程度は、聴覚誘発電位15、16、17、ラウンドウィンドウ記録4、18、および行動聴覚しきい値5.CHLに続く神経活動は、2-デオキシグルコース法および全細胞記録4、16、17で検討されている。聴覚神経活動もラウンドウィンドウ記録18で調べられた。周波数変調検出閾値は、動作5を研究されている。このCHL手順は難聴の詳細な研究のための実験方法の広い範囲と明確に互換性がある。
図1: 外科的セットアップ A)手術用ランプのある明るい場所にげっ歯類を置きます。げっ歯類を麻酔する。小さい方がうまくいかない場合は、マイクロハサミの品揃えを準備する、より大きなペアは、TMパンクを保証することができます。オートスコープの準備ができていることを確認します。B)スプリングロードマイクロハサミ。実験者が開閉を制御できる場合、ピンセットで十分です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:代表的な鼓膜 A)穿刺前の鼓膜(TM)。B)穿刺後のTM。耳鏡でCHLおよびTM穿刺確認を行う場合、まずマレウスの頭部を注意し、CHL誘導後に、TMの除去と穿刺に成功することが不可欠である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足情報図1: 耳鏡で可視化したCHL手術前後同一ラットにおけるCHL手術前後の耳鏡可視化(即時)。図の左欄は、正常なTMおよび中耳耳小胞を有する耳鏡によってCHL処置の前に可視化された代表的なラット聴覚管である。図の右の列は、穿刺されたTMおよび変位した中耳耳小胞を有するオトスコープによってCHL手順後に可視化された代表的なラット聴覚管である。有意な出血は耳の血液蓄積から成る。手順19、20、21、22、23、24、25を実行する前にげっ歯類の中耳解剖学を研究する 。26、27、28、29 .手術後24時間の間、聴鏡可視化を行った。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足情報図2: CHL手術後のラット聴道を、ヒストロジーによって評価した場合の制御及び後コントロールおよびCHL手術後の中耳の組織学的見解(Bar = 500 μm)。聴覚管は、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)およびマッソンのトリクロム(MT)染色をコントロールおよび24時間後CHL手術で処理した。図の左列は、対照ラットにおける聴覚管の代表的な組織学的セクションである。図の右の列は、CHL手順後の聴覚管の代表的な組織学的セクションである。なお、CHL手術後に重大な炎症は起こらない。1週間までの違いは見当たらない。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ラットにおける耳鏡可視化と行動拍手驚き応答を用いた検証によるCHLの単純な外科的誘導について説明する。ここではラットに対する方法を実証し、以前はこの方法がガービルおよびマウスに適用された。この方法は、他のげっ歯類に容易に採用することができる。CHLの誘導は、聴覚皮質変化および心理物理学的行動所見4、5、16、17、18に現れる微妙な形態の難聴の研究を可能にする.
CHL を誘導できないのは、以下に示すいくつかの理由が考えられます。いずれの場合も、ラットを廃棄することをお勧めします。片方の耳が出血している場合は、ラットを安楽死させる。出血は、はさみが聴道と接触し、外科的アプローチがきれいでないことを示す。さもなければ、穿刺が好ましいよりも深く、内部損傷、おそらく脳損傷を引き起こすことを意味する。内部損傷は、深い挿入または聴覚管のニッキングを意味する可能性があります。手順は、低侵襲鼓膜および/またはマレウス除去/変位です。したがって、有意な出血は起こってはならない(補足図1)。重大な出血が生じた場合は、ラットを安楽死させる。鼓膜穿刺中に「ポップ」音が聞こえない場合は、CHLが悪いことを示している可能性があり、これはハサミが鼓膜に直接接触しなかったことを意味する。グループからげっ歯類を破棄し、安楽死させる。耳鏡を用いて、視覚が中耳がコントロール耳に類似していることを可視化した場合、これは鼓膜が穿刺されていないことを示す。CHLは誘導されなかったため、げっ歯類は廃棄されるべきである。げっ歯類が拍手音テストに応答する場合は、廃棄する必要があります。CHL誘導げっ歯類がクラップ音の後に跳躍またはジャンプした場合、ケージメイトと同様に、これは外科的処置が成功しなかったことを示す。拍手音に対する応答は、CHLが発生しておらず、ラットを廃棄または安楽死させる必要があることを示します。外科的アプローチによるCHL誘導の制限は、外科的処置を行う学習曲線と音響検査における自信19、20、22、23、 27、28、29 .さらに、このプロトコルは、聴覚手順に精通していない科学者のための簡単なプロトコルを確立するために、難聴15を評価するためにABRまたはDPOAEを使用しませんでした。音声学的手順ABRとDPOAEは、CHL15のさらなる評価を望む科学者のために使用することができます。
技術の変更は、マレウス変位とTM穿刺を使用しています。初心者にとっては、これは確立するのが難しいかもしれませんが、マレウスは、ほぼすべてのげっ歯類の耳の耳鏡で明確に視覚化されています。TMは光を透過するろく外観を有する繊維状膜である。以前の文献19、20、22、23、27、28、29に基づいて一貫した可視化を確立するためのオトスコープ検証を実践する.マレウスの可視化に自信を持った後、手術中の変位は、≥2分52sで聞くことができるように、大きな「ポップ」によって容易に確認されます。このポップは、バネ付きマイクロハサミのねじれの前に約20 dB SPLのオーディオファイルの大きなdB SPL変更です。大きなポップは、聴覚管を損傷することなく、TMの穿刺と成功を確認します。外科的処置の2つの側面は注意して行われなければならない:1)マイクロはさみが聴覚管の中心に置かれるようにし、2)マイクロはさみの角度が下向きの穿刺の間に聴覚管と平行であることを保障する。穿刺運動が速く、聴覚管の開口部から約5mm下向きに推力していることを確認します。必要に応じて、マレウス変位のマイクロハサミを回転させて開きます。
CHLプロトコルの重要なステップは、TM穿刺を保証し、行動拍手の驚きを検証することです。TMのマレウス除去/穿刺の検証を確実に行い、CHLが行われたことを確認する。検証は、オトスコピック検査を通じて行われます。行動評価の重要なステップは、げっ歯類が驚くべきほど大きな拍手を確保することです。CHLラットが聴力ラットと同様のケージに入れられるとき、違いが指摘されている。ここでは、ラットが音を聞くことができない場合でも、一方のラットは他方に驚かされます。驚いたネズミ/げっ歯類はしばしばジャンプまたはホップしますが、これは基準ではありません。観察できるように、CHLラットは拍手に移動しません。TM穿刺はCHLであるため、db SPLサウンドの異なるレベルはげっ歯類5によって聞こえるかもしれません。
この単純なCHL法の主な意義は、わずかなリソースであっても、幅広い研究者が行うことができることです。難聴の検証は、ラットにおける耳鏡の可視化および行動拍手の驚き応答によって行われる。ここではラットに対する方法を実証し、以前はこの方法がガービルおよびマウスに適用された。この方法は、他のげっ歯類に容易に採用することができる。CHLの誘導は、聴覚皮質変化および心理物理学的行動所見4、5、16、17、18に現れる微妙な形態の難聴の研究を可能にする本技術は、電気生理学および行動技術と組み合わせて、難聴研究31に大きな関心を示す難聴の皮質的結果を決定することができる。
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Disclosures
著者は、利害の財政的または非財政的な対立を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、香港研究助成協議会、早期キャリアスキーム、プロジェクト#21201217からC.L.、聴覚および騒音公害研究におけるアプリケーションを用いた脳マッピング誘導電気生理学によって部分的にサポートされました。我々は、ポストグラド・エン・シエンシアス・ビオメディカ、ナシオナル・アウトノマ・デ・メヒコ大学(UNAM)のニューロバイオロジー・インスティトゥート、コンセホ・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジア(CONACyT)に対するメディコに感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Latex, polyvinyl or nitrile gloves | AMMEX | Use unpowdered gloves 8-mil | |
| Micro spring scissors (see Fig. 1b) | RWD Life Science | S11035-08 | 8.0 cm total length, with 3.5mm cutting edge, or similar micro forceps. Standard tweezers with spring action will suffice |
| Otoscope mini 3000 | HEINE | D-008.70.120M | Standard LED otoscope will suffice |
| Rat or mouse | JAX labs | Any small rodent | |
| Small rodent cage | Tecniplast | 1284L | Need two cages to separate CHL rodent from hearing rodent. If rodents are in direct contact with one-another, they will startle each other. Cage dimensions 365 x 207 x 140 mm, floor area: 530 cm2/82.15 in2 |
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