Summary
Det här protokollet beskriver en procedur för att extrahera och berika phosphopeptides från prostata cancer cellinjer eller vävnader för en analys av den phosphoproteome via mass spectrometry-baserad proteomik.
Abstract
Phosphoproteomics innebär storskaliga studier av fosforyleras proteiner. Protein fosforylering är ett viktigt steg i många cellsmedierade reaktioner och är hårt reglerad av kinaser och fosfataser. Därför kan karaktärisera phosphoproteome ge insikter i att identifiera nya mål och biomarkörer för onkologiska terapi. Masspektrometri ger ett sätt att globalt påvisa och kvantifiera tusentals unika fosforylering händelser. Phosphopeptides är dock mycket mindre rikliga än icke-phosphopeptides, att göra bioanalys mer utmanande. För att kringgå den här begränsningen krävs metoder för att berika phosphopeptides före masspektrometri analysen. Vi beskriver en procedur för att extrahera och smälta proteiner från vävnad att ge peptider, följt av en anrikning för phosphotyrosine (pY) och phosphoserine/treonin (pST) peptider med en antikropp-baserade eller titandioxid (TiO2)-baserat anrikning-metoden. Efter provberedning och masspektrometri, vi därefter identifiera och kvantifiera phosphopeptides med liquid chromatography-masspektrometri och analysprogram.
Introduction
Uppskattningsvis 165 000 nya fall och cirka 29.000 dödsfall inträffar 2018 på grund av prostatacancer, som representerar de vanligaste cancerformen och näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i män i USA1. Tidiga stadier av prostatacancer är behandlingsbara med resektion eller strålning terapi av orgel-slutna sjukdom, där tio år Återfallsfrekvensen är mellan 20 och 40% för patienter som genomgår prostatektomi och mellan 30% och 50% för patienter som får strålning behandling2. Eftersom prostatacancer är beroende av androgen signalering för tillväxt, är kirurgisk och kemisk kastrering terapier också anställd för högriskpatienter. Dock inträffar återfall när cancern inte längre svarar på androgen deprivationsterapi vilket framgår av biokemiska återfall, där prostataspecifikt antigen i serum stiger igen. Vid denna tidpunkt i sjukdomsförloppet upptäcks metastaser ofta också. Detta framskridet stadium, kallas metastaserad kastrationsresistent prostatacancer, representerar den dödliga formen av sjukdomen där prognosen är taget medianöverlevnad på mindre än två år3. Få behandlingsalternativ finns i sent stadium sjukdomen, inklusive andra generationens antiandrogener som enzalutamid och abirateron, samt taxanbaserad kemoterapi som docetaxel. Trots tillgängliga behandlingar fortskrider sjukdomen ofta. Upptäckten och utvecklingen av nya behandlingsmetoder är därför nödvändigt att förbättra omhändertagandet av prostatacancerpatienter med avancerad sjukdom.
Masspektrometri (MS)-baserade metoder ge en global analys av proteomet genom påvisande av hundratals till tusentals peptid analyter4. I synnerhet kan upptäckten proteomik, även känd som data-beroende förvärv (DDA), ge identifiering och kvantifiering av tusentals peptider4,5. MS-baserad upptäckt proteomik kan avgränsas ytterligare in uppifrån proteomik, där intakta proteiner karakteriseras, och nedifrån och upp (även kallat shotgun) proteomik, där peptider analyseras för att karakterisera proteiner5. I shotgun proteomik, således sker en proteolys steg i provberedningen föregår MS analysen att klyva proteiner till peptider. I slutet utförs en databas sökning för att mappa peptiderna tillbaka till proteinerna för identifiering. Etikett-fria såväl som flera isotop-märkning [e.g., stabil isotop märkning av aminosyror i cellkultur (SILAC)] kan metoder användas att kvantitativt jämföra peptider mellan prover6,7. Medan isotopen märkning tekniker guldmyntfoten, etikett-fria metoder har visat liknande kvantifiering exaktheter8,9 och har jämförbar kompromisser mellan känslighet och specificitet10. Etikett-fri kvantitering ger större täckning och möjliggör jämförelser mellan många fler prover, medan etikettbaserade metoder begränsas av kostnaderna och multiplexering kapacitet6,7,8.
Dessutom kan hagelgevär MS också användas för att förhöra post-translationella modifieringar (PTMs) såsom fosforylering11. På grund av lägre stökiometrisk hur phosphopeptides jämfört med totala peptider, används flera metoder för att berika för phosphopeptides, inklusive antikroppsbaserade immunoprecipitation av phosphotyrosine (pY) peptider, titandioxid (TiO2 ), och orörlig metall affinitet kromatografi (IMAC)5,12. Eftersom protein fosforylering är ett viktigt steg i många cell signalering vägar, shotgun phosphoproteomics tillåter forskare att undersöka cell signalering förändringar i olika cancerformer, inklusive bröstcancer13, prostata14, nedsatt15, och cystor,16,17 att bättre förstå cancerbiologi och att identifiera potentiella nya mål för behandling.
Denna etikett-gratis shotgun phosphoproteomic var byggd och raffinerade baserat på tidigare arbete av Graeber grupp18,19,20. Detta protokoll börjar med att beskriva utvinning och nedbrytning av proteiner och phosphoproteins från vävnad i peptider. Vi sedan detalj anrikningen av pY peptider med specifika phosphotyrosine antikroppar och TiO2. Vi beskriver också anrikningen av phosphoserine/treonin (pST) peptider med stark ering exchange (SCX) följt av TiO2. Detta protokoll avslutas med inlämning av prover till en MS-anläggning och användning av MS analysprogramvara för att identifiera och kvantifiera phosphopeptides och deras motsvarande phosphoproteins. Tillämpningen av detta protokoll kan sträcka sig bortom prostatacancer i fälten utanför onkologi och andra cancerformer.
Protocol
Experiment med xenograft tumörer godkändes av Rutgers University institutionella djur vård och användning kommittén enligt fram enligt riktlinjerna i National Institutes of Health.
1. protein utvinning
- Förbereda lyseringsbuffert (tabell 1). (Volymen beror på antalet prover som skall skördas.) För in vitro- cellprover, Fortsätt till steg 1.2. För tumörvävnad, Fortsätt till steg 1.3.
-
Skörda celler
- Samla in cellerna i en 50 mL konisk tub och snurra dem vid 700 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och hålla pelleten på is. Upprepa detta för alla rätter att samla cellerna i en pellet. (Normalt ca 5 nästan konfluenta 15-cm rätter av celler behövs för 5 mg av protein, men detta kan vara beroende av den cellen fodrar och behöver empiriskt bestämmas varje utredare.)
- Tvätta pelleten med 30 mL kylt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och snurra vid 700 x g i 5 minuter vid 4 ° C före aspirera PBS. Tillsätt 1,5 mL lyseringsbuffert per 5 mg protein brukade cellpelleten. Pipettera upp och ner ett par gånger. Hoppa till steg 1.4.
-
Skörda vävnader
- Väga tumören och tillsätt 2 mL av iskall lyseringsbuffert för varje 100 mg av vävnad i en kultur provrör. (Vanligtvis behövs 50 till 150 mg av vävnad våtvikt.)
- Homogenisera den lysate med hjälp av en handhållen eller bänkmonterade Homogenisatorer (puls 2 x 15 s.) Rengöra homogenisatorn före det första provet och mellan prover med 10% blekmedel, 70% etanol och avjoniserat vatten i följd.
- Att minska och alkylat, värma de homogeniserade proverna vid 95 ° C i 5 min. Kyl dem sedan på is i 15 min. På isen, Sonikera lysate 3 x (dvs, puls för 30 s med 60 s pauser mellan pulser). Provet bör inte vara trögflytande eller klumpiga på denna punkt. Värm den lysate vid 95 ° C i 5 min21.
- Centrifugera det lysate i samma ultraljudsbehandling tube med en swing hink rotor vid 3 500 x g vid 15 ° C för 15 min. samla supernatanten och kassera pelleten.
- Bestämma proteinkoncentration genom att utföra en Bradford assay22. Vid behov späd den lysate 5 mg/ml med en lyseringsbuffert. Förvara den vid-20 ° C.
Obs: Experimentet kan pausas här. Frysa proverna vid-80 ° C och fortsätta vid ett senare tillfälle.
2. lysate matsmältningen
- Späd provet 12 gånger med 100 mM Tris (pH = 8,5) att minska mängden guanidinium. Späd prover som är alla till samma volym att minimera effekterna av ojämlika matsmältningen. Spara 12,5 µg av de osmälta lysate bekräfta det till en Coomassie-färgade gel23.
- 5 mg protein, lägger till 10 µg av Iysyl Endopeptidase (Lys-C) och odla det i rumstemperatur för 5-6 h. Justera pH till 8.0 genom untitrated att lägga till 1 M Tris (pH ~ 11).
- Bereda 1 mg/mL L-1-tosylamido-2-phenylethyl klormetyl keton (TPCK)-behandlade trypsin i 1 mM HCl (med 20 mM CaCl2). Tillsätt trypsin i förhållandet 1: 100 trypsin: protein och inkubera det vid 37 ° C i 3 h.
- Tillsätt samma mängd färska trypsin som i steg 2,3. Inkubera vid 37 ° C det över natten.
- Spara 12,5 µg av den smält lysate bekräfta fullständig nedbrytning på en Coomassie-färgade gel23.
3. omvänd fas utvinning
- Spela in lysate volymen. Filtrera urvalet med hjälp av en 15 mL 10 kDa cutoff filter. Centrifugera provet vid 3500 x med swing hink rotorn (eller 3 500 x g i en fast vinkel rotor) vid 15 ° C tills den retentate volymen är mindre än 250 µL (detta tar ungefär 45-60 min). Samla genomströmmande och kassera retentate.
Obs: Experimentet kan pausas här. Frysa proverna vid-80 ° C och fortsätta vid ett senare tillfälle. - För att syrsätt provet, tillsätt ca 20 µL 5% trifluorättiksyra (TFA) per mL lysat. Blanda dem väl och mät provets pH med pH-remsor. Justera pH till 2.5 använder 5% transfettsyror.
- Anslut den korta änden av en C-18 kolumn till ett vakuum samlingsrör. Ange vakuumet mellan 17 och 34 kPa (eller enligt tillverkarens instruktioner). Med glas pipetter, våta kolumnen med 3 mL 100% acetonitril (ACN). Låt inte kolumnen torka.
- Pipetter med glas och jämvikta kolonnen med 6 mL 0,1% transfettsyror tillämpade som 2 x 3 mL. Ladda surgjord provet till kolonnen. Lägg inte till mer än 3 mL i taget. Justera vakuumet för att rikta ca 1-2 droppar per sekund.
- Använda glas pipetter, Tvätta kolonnen med 9 mL av 0,1% transfettsyror tillämpade som 3 x 3 mL. Eluera kolumnen med 2 mL 40% ACN, 0,1% transfettsyror. Samla in två 2 mL fraktioner i glasrör kultur . Kassera kolumnen.
- Täck eluatet rören med parafilm och 3-5 hål på omslaget med en 20G nål. Frysa eluatet på torris i minst 30 min tills den är helt solid.
- Lyophilize fraktioner över natten. Kontrollera att proverna är helt torra innan du stoppar lyophilizer på följande dag. Förvara rören i en 50 mL konisk tub med delikat våtservetter vid-80 ° C.
Obs: Experimentet kan pausas här.
4. Immunoprecipitation och anrikning av pY peptider24
- Återsuspendera det frystorkade pulvret med 0,5 mL iskallt immunoprecipitation (IP) bindande buffert i respektive fraktion. Pool fraktioner genom att överföra 0,5 mL resuspension volymen från den andra fraktionen till den första fraktionen och spara pipettspetsen. Kraftfullt vortex (i stället för pipettering upp och ner) att se till att provet löses helt innan den överförs till en 3,6 mL skruvlock cryotube.
- Som i steg 4.1., skölj frystorka den rören med ytterligare 0,5 mL IP bindande buffert (tabell 1) i varje rör. Överför lösningen till 3,6 mL skruvlock röret med samma pipettspetsen för att minimera prov förlust. Upprepa den sköljningen 1 x mer, att göra den slutliga resuspension volymen 2 mL (för 5 mg protein). Mät provets pH så att det är ca 7,4. Om det är för surt, iterativt tillsätt 10 µL av 1 M Tris (untitrated, pH ~ 11). Om det är alltför grundläggande, iterativt tillsätt 10 µL utspädd HCl (1:25 eller 1: 100).
-
Förtvätt pY pärlorna (för 5 mg börjar lysate)
- per prov behövs 25 µg 4 g 10 antikroppar och 12,5 µg 27B10.4 antikroppar. Efter att ha använt en p200 pipett med skuren spets att överföra antikropparna i separata mikrocentrifugrör, tvätta antikroppar med 450 µL av iskall IP bindande buffert 2 x. Centrifugera dem 100 x g för 1 min vid 4 ° C och aspirera ut supernatanten.
- Återsuspendera pärlor för att en stock koncentration av 0,5 mg/mL med hjälp av IP-bindande buffert. (Gör inte vortex pärlorna.) Efter alikvotering nödvändiga slam (50 µL av 4 g 10 antikropp flytgödsel och 25 µL 27B10.4 antikropp flytgödsel per prov) i ett enda rör, snurra ner lager Centrifugera rören vid 200 x g i 1 min vid 4 ° C. Tvätta sidoväggarna med supernatanten innan han återvände pärlorna till förvaring i kylskåp.
- Lägga till förtvättat pY pärlor återsuspenderade provlösningen i den skruvlock frysrör. Inkubera vid 4 ° C på en över slut rotator dem över natten.
- Placera den skruvlock frysrör i ett 50 mL centrifugrör fodrad med en delikat torka. Snurra ner pärlorna på 100 x g för 1 min. Spara supernatanten, som används för att berika för pST peptider. (Berikning för pST börjar vid steg 7 och kan utföras parallellt på pY peptid behandling).
- Återsuspendera pärlorna med 300 µL av IP-bindande buffert. Överföra dem till en 2 mL mikrocentrifug rör och snurra dem ner på 100 x g för 1 min vid 4 ° C.
- Skölj ruvning rör 3 x med 200 µL IP bindande buffert. Över innehållet till samma mikrocentrifug rör varje gång. Sedan snurra dem ned.
- Tvätta pärlorna i mikrocentrifug rör 3 x med 500 µL av IP-bindande buffert och snurra dem ner på 100 x g för 1 min. Tvätta sedan pärlorna 4 x med 450 µL av 25 mM NH4HCO3, pH 7,5 och spinn ner dem vid 100 x g i 1 min. Använd en färsk 25 mM NH4HCO3 lösning från pulver varje gång.
- Centrifugera pärlorna på 1 500 x g för 1 min. Använd en gel-lastning tips ta bort supernatanten helt genom att doppa spetsen av gel-lastning spetsen något under pärlorna yta.
- Lägga till 4 x pärla volym 0,1% TFA till pärlorna (dvs, tillsätt 300 µL 0,1% TFA för 75 µg pY pärla slurry). Blanda dem väl och inkubera blandningen i en thermomixer vid 1000 rpm under 15 minuter vid 37 ° C.
- Överföra resuspension till ett 0,2 µm spin filter. Snabbt snurra ner eluering röret och överföra återstående volymen till samma spin filter använder en P10 Pipettera. Varva ner filtret spin på 850 x g för 1 min. överföra elueringen till ett lågt protein-bindande mikrocentrifug rör. Vakuum koncentrera eluatet till torrhet över natten vid 40 ° C och med en värme på 300 min.
Obs: Experimentet kan pausas här. Frysa proverna vid-80 ° C och fortsätta vid ett senare tillfälle.
5. titandioxid anrikning25 i pY peptider
- Återsuspendera den torkade ner phosphopeptides i 200 µL av 50% ACN, 0,1% transfettsyror. Vortex och centrifugera dem 10 000 x g i 30 s. Upprepa detta 1 x för att resuspendera dem väl.
- Förbereda de TiO2 pärlor i tips som har en kapacitet för 200 µL prov.
- Knacka på den lilla tips-sidan av spetsen att flytta materialet därför. Skölj spetsen genom att lägga till 200 µL av 100% ACN, följt av Invertera spetsen och snärta den lilla änden för att flytta flytanden in mot den gemensamma jordbrukspolitiken.
- Med ett rakblad, skär små spetsen av spetsen och placera den över en låg proteinbindning tube. (Undvik att använda polystyren rör eftersom TiO2 fastnar på sidorna av tuben.) Ta av locket och sätt en mikropipett för att kasta ut de återstående ACN. Upprepa tvätten med 200 µL av 100% ACN. TiO2 pärlorna sitter numera i låg proteinbindning röret för följande steg.
- Förutsättning TiO2 med 500 µL av 100% ACN 2 x. Pipettera att blanda pärlor med lösningsmedel. Centrifugera dem 100 x g för 1 min.
- Villkor TiO2 med 500 µL 0,2 M natrium fosfatbuffert (pH ~ 7) 2 x. Tvätta pärlorna med 300 µL av Jämviktstiden buffert 3 x. Eftersom TiO2 är mycket tät, kvittar pärlorna snabbt.
- Tillsätt 400 µL av 50% ACN, 0,1% transfettsyror i låg proteinbindning röret, följt av att lägga till 84 µL av mjölksyra. Överföra den återsuspenderade phosphopeptides i låg proteinbindning röret och inkubera dem för 1 h i rumstemperatur med en över slut rotator.
- Centrifugera pärlorna på 100 x g för 1 min till pellet dem. Tvätta dem med 300 µL av Jämviktstiden buffert (tabell 1), 2 x och snurra dem ner på 100 x g för 1 min.
- Skölj pärlorna med 300 µL av sköljning buffert 2 x. Överföra dem till ett 0,2 µm spin filter. Snurra dem vid 1500 x g i 1 min.
- Överföra filterenheten till en ren 1,5 mL låg proteinbindning tub. Eluera innehållet 2 x med 200 µL 0,9% NH3 H2O. mäta pH med pH-remsor, som bör vara mellan 10 och 11. Vakuum koncentrera eluatet till torrhet över natten avdunstat ammoniak.
6. avsaltning pY peptider för MS Analyses
- Rekonstruera phosphopeptides med 15 µL 0,1% TFA genom vortexa och centrifugering dem vid 10 000 x g i 30 s att resuspendera dem. Upprepa detta 1 x för att resuspendera dem väl. Pipettera inte upp och ner.
- Rengöra provet med en C-18 spets med en bindande kapacitet på 5 µg och följ tillverkarens protokollet.
- Helt torr elutionsvolymen av vakuum koncentration. Det tar 1-2 h. Återsuspendera de torkade phosphopeptides i 12,5 µL masspektrometri lösning (se tabell 1) (eller som rekommenderas av forskarens MS proteomik core facility). Vortex och kort snurra lösningen ner vid 10 000 x g för 30 s. Upprepa detta 2 x att resuspendera dem väl. Proverna är redo för inlämning till en masspektrometri anläggning (steg 11).
Obs: Följande stegen nedan är relaterade till pST peptid anrikning endast.
7. omvänd fas utvinning av pST peptider
- Mätning av peptid koncentrationen av supernatanten förvärvade från steg 4,6 genom att utföra en peptid analys. Ett tillräckligt belopp för pST masspektrometri är 2,5 mg.
- Justera pH till 3.5 med 5% transfettsyror.
- Anslut den korta änden av en C-18 kolumn till ett vakuum samlingsrör. Ange vakuumet mellan 17 och 34 kPa (eller enligt tillverkarens instruktioner). Våt kolumnen med 3 mL 100% ACN. Låt inte kolumnen torka.
- Jämvikta kolonnen med 6 mL 0,1% transfettsyror tillämpade som 2 x 3 mL. Ladda surgjord provet till kolonnen. Lägg inte till mer än 3 mL i taget. Justera vakuumet för att rikta ca 1-2 droppar per sekund.
- Tvätta kolonnen med 9 mL av 0,1% transfettsyror tillämpade som 3 x 3 mL. Eluera kolumnen med 2 mL 40% ACN, 0,1% transfettsyror. Samla in två 2 mL fraktioner i glasrör kultur. Kassera kolumnen.
- Täck eluatet rören med parafilm och 3-5 hål på omslaget med en 20G nål. Frysa eluatet på torris i minst 30 min tills den är helt solid.
- Lyophilize valda fraktioner över natten. Kontrollera att proverna är helt torra innan du stoppar lyophilizer på följande dag. Förvara rören i en 50 mL konisk tub med delikat våtservetter vid-80 ° C.
Obs: Experimentet kan pausas här.
8. stark ering Exchange (SCX) av pST peptider
- Återsuspendera frystorkade peptiderna i 2 mL buffert A (tabell 1). Poolen fraktioner för varje prov. (Lösningen blir grumlig.)
- Förbereda vakuum grenröret. Anslut en SCX-kolumn till en 3 mL spruta med kolven tas bort. Ange vakuumet mellan 17 och 34 kPa (eller enligt tillverkarens instruktioner).
- Villkor kolumnen SCX med 4 mL ACN, följt av 4 mL buffert A.
- Ladda de 2 mL av provet från steg 8,1 och samla eluatet omedelbart. Ladda 3 mL buffert a: b (80.9:19.1) och samla eluatet. Poolen på eluat av varje prov och alikvotens dem in 2 mL låg proteinbindning rören.
- Vakuum koncentrera alla prover tills en cirka 30% av volymen. (Detta steg tar cirka 2-4 h.) Pool i alikvoter i 1 låg proteinbindning röret för varje prov.
- Anslut den korta änden av en C-18 kolumn till ett vakuum samlingsrör. Ange vakuumet mellan 17 och 34 kPa (eller enligt tillverkarens instruktioner). Våt kolumnen med 3 mL 100% ACN 2 x. Gör inte låt kolumnen torr.
- Jämvikta kolonnen med 3 mL 0,1% TFA 2 x. Fyll provet till kolonnen. Lägg inte till mer än 3 mL i taget. Justera vakuumet för att rikta ca 1-2 droppar per sekund.
- Tvätta kolonnen med 3 mL 0,1% TFA 2 x. Eluera kolumnen med 4 mL 50% ACN, 0,1% transfettsyror.
9. titandioxid anrikning av pST peptider
-
Förbereda de TiO2 pärlor i tips som har en kapacitet för 200 µL prov
- Knacka försiktigt på små tips sida i spetsen att flytta pärlorna därför. Ta av locket och häll en polypropylen 15 mL koniska rör pärlorna.
- Skölj spetsen genom att lägga till 200 µL av 100% ACN, Invertera spetsen ett par gånger och snärta den lilla änden för att flytta flytanden in mot den gemensamma jordbrukspolitiken. Med ett rakblad, skär små spetsen av spetsen och placera den över polypropylen 15 mL koniska röret. Ta av locket och sätt en mikropipett för att kasta ut de återstående ACN. Upprepa tvätten med 200 µL av 100% ACN. De TiO2 pärlorna ligger nu i 15 mL koniska röret för följande steg.
- Förutsättning TiO2 med 500 µL av 100% ACN 2 x. Pipettera att blanda pärlor med lösningsmedel. Centrifugera dem 100 x g för 1 min.
- Villkora TiO2 med 500 µL 0,2 M natrium fosfatbuffert (pH ~ 7) två gånger. Tvätta pärlorna med 300 µL av Jämviktstiden buffert 3 x.
- Överföra de eluerade phosphopeptides i polypropylen 15 mL koniska röret. Lägg till 560 µL av mjölksyra och inkubera det 1 h i rumstemperatur med en över slut rotator.
- Centrifugera blandningen på 100 x g för 1 min till pellet pärlorna. Tvätta dem med 300 µL av Jämviktstiden buffert (tabell 1), 3 x. Snurra dem ner på 100 x g för 1 min.
- Skölj pärlorna med 300 µL av sköljning buffert 2 x. Överföra dem till ett 0,2 µm spin filter. Snurra dem ner på 1 500 x g för 1 min.
- Överföra filterenheten till en ren 1,5 mL låg proteinbindning tub. Eluera innehållet 2 x med 200 µL 0,9% NH3 H2O. Låt lösningen sitta på phosphopeptides i 2 min innan eluering dem. Mäta pH-värdet, vilket bör vara mellan 10 och 11.
- Vakuum koncentrera eluatet till torrhet över natten avdunstat ammoniak.
10. avsaltning pST peptider för MS analyser
- Knacka på den lilla tips-sidan av spetsen att flytta materialet därför. Skölj spetsen genom att lägga till 200 µL av 100% ACN, följt av Invertera spetsen och snärta den lilla änden för att flytta flytanden in mot den gemensamma jordbrukspolitiken.
- Använda ett rakblad, skär små spetsen av spetsen och placera den över en polypropylen 15 mL konisk slang. Ta av locket och sätt en mikropipett för att kasta ut de återstående ACN. Upprepa tvätten med 200 µL av 100% ACN. TiO2 pärlorna sitter numera i polypropylen 15 mL koniska röret för följande steg.
- Rengöra provet med en C-18 spets med en bindande kapacitet på 100 µg. (följ tillverkarens instruktioner.)
- Helt torr elutionsvolymen av vakuum koncentration. Det tar 1-2 h.
- Återsuspendera de torkade phosphopeptides i 12,5 µL av masspektrometri lösning (eller som rekommenderas av forskarens MS proteomik core facility). Vortex och centrifugera dem 10 000 x g för 30 s. Upprepa 2 x att resuspendera dem väl. (Pipettera inte upp och ner.)
11. masspektrometri analys
- Skicka proverna till MS proteomik core facility att utföra liquid chromatography-tandem MS (LC-MS/MS) med deras rekommenderade inställningar. Exempel inställningarna är följande (se tabell 2 för sammanfattningen):
- Ladda 5 µL av proverna på en fälla kolumnen (2 cm lång x 75 µm diameter) och tvätta dem med 0,1% TFA för 5 min med en flödeshastighet av 5 µL/min.
- Ta fällan i linje med en nano Analyskolonn (20 cm x 75 µm) med en flödeshastighet av 300 nL/min.
- De segmenterade linjära Övertoningarna (procent av 0,16% myrsyra, 80% ACN i 0,2% myrsyra) skiljer mellan pY och pST prover:
- För pY prover, eluera dem med en gradient av 4-15% i 5 min, 15-50% i 40 min och 50-90% i 5 min.
- För pST prover, eluera dem med en gradient av 4-15% i 30 min, 15-25% i 40 min, 25-50% i 44 min och 50-90% i 11 min.
- Förvärva MS data i data-beroende förvärv läge med en cyklisk serie en fullständig skanning med en upplösning på 120.000 följt av MS/MS (HCD, relativa kollision energi på 27%) av de 20 mest intensiva jonerna och en dynamisk utslagning varaktighet på 20 s.
- Efter MS kör slutförandet, importera MS raw-filer till en MS analys programvara att identifiera och kvantifiera phosphopeptides. (MaxQuant programvara8,26,27 används i detta experiment. ”Om anges i tabell 3, användes standardinställningarna.)
Representative Results
Det här protokollet beskriver i detalj en metod för protein utvinning och matsmältningen följt av phosphopeptide anrikning och efterföljande MS analys (figur 1). Kompositioner av alla buffertar och lösningar som används i detta protokoll är listade i tabell 1. Sekventiell användning av Lys-C och trypsin ger en effektiv matsmältning. En Coomassie-färgade gel av pre sammandrag lysate bekräftar närvaron av proteiner, medan färgning av efter smält lysate bekräftar komplett matsmältningen (figur 2A). För en komplett matsmältning visas inga band ovanför 15 kDa, utom den 30 kDa och 23,3 kDa band för Lys-C och trypsin, respektive. Tillägg av Lys-C minskar också antalet missade Klyvningar (figur 2B). Eftersom pY peptider utgör endast 2% av de phosphoproteome28, är immunoprecipitation av pY peptiderna med en pY-specifika antikroppen det första steget av pY peptid anrikning. Resulterande supernatanten blir ingången för pST peptid anrikning. Den pY immunoprecipitation separerar effektivt pY peptider från pST peptider där i genomsnitt 85 procent av de phosphopeptides som identifieras från pY förberedelse är pY (figur 3A) och över 99% av de phosphopeptides som identifieras från pST förberedelse är pST (figur 3B). Titanium dioxid används för att berika för phosphopeptides i båda preparat. Den beräknade andelen peptider i MS-klar förberedelserna som är fosforyleras är mellan 30-50% (figur 4A). Variabiliteten i procentandelen phosphopeptide anrikning kan bli större i pY preparatet till följd av att många färre pY peptider än pST peptider. När det gäller phosphopeptide arter har majoriteten av de phosphopeptides som upptäckts en enkel eller dubbel phosphorylen grupp (figur 4B).
Efter att ha utfört masspektrometri, laddas MS raw-filer i en MS analysprogram. Parameterinställningarna som används i experimentet listas i tabell 3 men varierar från program till program och kan variera från version till version. De parametrar som inte anges var kvar som standard, däribland en FDR cutoff på 1% för matchande peptid-spektrum (PSM) med en minsta Andromeda Poäng 40 för identifiering av modifierade peptider27. Ställa in en lokalisering sannolikhet cutoff av större än 0,75 filter ut cirka 5% av de pY peptiderna och 15% och 34% av pS och pT peptider, respektive (figur 5A). Efter tillämpning av dessa filter, är det förväntade antalet phosphopeptide identifieringar i slutet av MS analysen cirka 300 pY peptider (för 5 mg av proteinet start) och ca 7.500 pS peptider och 640 pT peptider (för 2,5 mg av start peptiden belopp) från respektive anrikning förberedelserna (figur 5B). Antalet replikat och variabilityen av phosphopeptide signal intensiteten avgör tillräcklig strömförsörjning för statistiska jämförelser. I fyra separata experiment med grupper som innehåller antingen biologiska dubbletter eller exemplar, beräknades de procentuella variationskoefficienter (CV %) för upptäckta phosphopeptides. Distributioner av lägre variabilitet (t.ex., pST grupper 1-5 i figur 5 c) visar att provtagning, förberedelse och masspektrometri körningar var konsekvent. Å andra distributioner av högre variabilitet (t.ex., pST grupp 6 i figur 5 c) anger bullrigare data som skulle kräva större vik-förändringar att upptäcka signifikanta skillnader i nedströms differentiell analyser.
Figur 1: arbetsflödesdiagram. Proteiner från prover extraheras och rötas. Peptiderna utvinns genom fasta fasen extraktion (SPE) och phosphotyrosine (pY) peptider är immunoprecipitated. Parallellt är phosphoserine/treonin (pST) peptiderna berikad från supernatanten i pY immunoprecipitation steg. Stark ering exchange (SCX) utförs på supernatanten ta bort laddad peptider för att minska den ion dämpning12. Båda preparat genomgår phosphopeptide berikning via titandioxid (TiO2). Efter provet rensning utförs liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) för att mäta phosphopeptide överflöd. Raw-data läses sedan in i en MS analys programvara för att identifiera phosphopeptides. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: utvärdering av matsmältning. (A) tre prover med 12,5 µg av lysat före matsmältningen, post-Lys-C matsmältningen, och efter trypsin matsmältningen visas. Coomassie gel-fläcken test visar en ren matsmältning efter sekventiell användning av Lys-C och trypsin. Molekylvikt (MW) storlek markörerna är kilodaltons (kDa). (B) A minskning av missade Klyvningar observeras efter Lys-C lades till protokollet. Andelen phosphopeptides utan missade Klyvningar ökat från 48% till 64% och 60% till 84 procent i genomsnitt för pY och pST anrikning preparat, respektive. Graferna sammanfatta data från två experiment som utförs utan Lys-C och fem experiment som utförs med Lys-C. Felstaplar är standardavvikelser som representerar 38 pY och 38 pST prover från 2 separata experiment (utan Lys-C) och 62 pY och 60 pST prover från 5 separata experiment (med Lys-C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: anrikning av pY och pST phosphopeptides. Dessa paneler Visa procentsatserna för pSTY phosphopeptides från antingen (A) den pY eller (B) pST anrikning förberedelserna. PY anrikningen av pY immunoprecipitation och titandioxid resulterat i 85% phosphopeptides att vara i pY peptider, medan endast 0,1% av phosphopeptides i pST berikning är pY. Dessa värden drogs från att pröva Phospho (STY)Sites.txt-fil för en representativ experiment efter filtrera bort föroreningar, omvänd sekvenser och phosphopeptides med lokalisering sannolikheter mindre än 0,75. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Phosphopeptide anrikning med titandioxid. (A) andelen upptäckta phosphopeptides (i förhållande till totala peptider) från prover i fyra separata experiment visas. (B) denna panel visar den genomsnittliga sammansättningen av mono-, dubbel- och multi-fosforyleras peptider i fyra separata experiment. Felstaplar i panel A är standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: förväntat phosphoresidue identifieringar. (A) denna panel visar fosforylering lokalisering probabilitiesna av IDs från pY anrikning (vänster) och pST anrikning (höger). Genomsnittliga andelen IDs som uppfyller > 0,75 sannolikhet cutoff är 93%, 75% och 52% för pY, pS och pT, respektive. (B) Genomsnittligt antal IDs med en > 0,75 lokalisering sannolikheten är 300 för pY, 7.500 för pS och 640 för pT. (C), denna panel visar violin tomter den procentuell variationskoefficienten (% CV) för phosphopeptides. En utvärdering av % CV utfördes endast om en signal intensitetsvärdet upptäcktes i varje biologisk replikera eller tre exemplar. Data togs från fyra separata experiment. Felstaplar i paneler A och B är standardavvikelser från 34 pY och 34 pST prover från 4 separata experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffert | Volym | Sammansättning | |
| 6 M guanidinium klorid lyseringsbuffert | 50 mL | 6 M guanidinium klorid, 100 mM tris pH 8.5, 10 mM tris (2-carboxyethyl) fosfin, 40 mM chloroacetamide, 2 mM natrium orthovanadate, 2,5 mM natrium pyrofosfat, 1 mM β-glycerofosfat, 500 mg n-octyl-glykosid, ultrarent vatten till volym | |
| 100 mM natrium pyrofosfat | 50 mL | 2.23 g natrium pyrofosfat dekahydratet, ultrarent vatten till volym | |
| 1M β-glycerofosfat | 50 mL | 15.31 g β-glycerofosfat, ultrarent vatten till volym | |
| 5% trifluorättiksyra | 20 mL | Tillsätt 1 mL 100% trifluorättiksyra in 19 mL ultrarent vatten | |
| 0,1% trifluorättiksyra | 250 mL | Tillsätt 5 mL 5% trifluorättiksyra till 245 mL ultrarent vatten | |
| pY eluering buffert | 250 mL | 0,1% syra, CF3COOH 40%-acetonitril, ultrarent vatten till volym | |
| pST eluering buffert | 250 mL | 0,1% syra, CF3COOH 50%-acetonitril, ultrarent vatten till volym | |
| IP-bindande buffert | 200 mL | 50 mM tris pH 7,4, 50 mM natriumklorid, ultrarent vatten till volym | |
| 25 mM hjorthornssalt, pH 7,5 | 10 mL | Lös 19,7 mg i 10 mL Sterilt ultrarent vatten, pH 7.5 med 1 N saltsyra (~ 10-15 µL/10 ml lösning), göra färska | |
| 1M fosfatbuffert, pH 7 | 1000 mL | 423 mL 1 M natriumdivätefosfat, 577 mL 1 M natriumfosfat väte | |
| Jämviktstiden buffert | 14 mL | 6.3 mL acetonitril, 280 µL 5% trifluorättiksyra, 1740 µL mjölksyra, 5,68 mL ultrarent vatten | |
| Skölja buffert | 20 mL | 9 mL acetonitril, 400 µL 5% trifluorättiksyra, 10,6 mL ultrarent vatten | |
| Masspektrometri lösning | 10 mL | 500 µL acetonitril, 200 µL 5% trifluorättiksyra, 9,3 mL ultrarent vatten | |
| Buffert A | 250 mL | 5 mM monokaliumfosfat fosfatbuffert (pH 2,65), 30% acetonitril, 5 mM kaliumklorid, ultra-rent vatten till volym | |
| Buffert B | 250 mL | 5 mM monokaliumfosfat fosfatbuffert (pH 2,65), 30% acetonitril, 350 mM kaliumklorid, ultrarent vatten till volym | |
| 0,9% ammoniumhydroxid | 10 mL | 300 μL 29.42% ammoniumhydroxid, 9,7 mL ultrarent vatten | |
Tabell 1: buffrar och lösningar. Den här tabellen visar kompositioner av den buffrar och lösningar används i detta protokoll.
| LC-MS/MS inställningar | ||
| Parametern | pY inställning | pST inställning |
| Prova lastning (µL) | 5 | |
| Laddar flöde (µL/min) | 5 | |
| Gradient flöde (nL/min) | 300 | |
| Linjär gradient (procentandel 0,16% myrsyra, 80% ACN i 0,2% myrsyra) | 4 - 15% för 5 min | 4 - 15% för 30 min |
| 15 - 50% för 40 min | 15 - 25% för 40 min | |
| 50 - 90% för 5 min | 25 - 50% för 44 min | |
| 50 - 90% för 11 min | ||
| Fullständig genomsökning upplösning | 120.000 | |
| Antal mest intensiva joner valt | 20 | |
| Relativa kollision energi (%) (HCD) | 27 | |
| Dynamiska uteslutning (s) | 20 | |
Tabell 2: LC-MS inställningar. Detta är ett exempel på LC-MS inställningar i en typisk shotgun phosphoproteomic experiment. Proverna var lastas på en fälla kolumn. Fällan fördes i linje med en Analyskolonn. Dessa inställningar var optimerad LC-MS-systemet visas i tabell av material och reagens. Dessa inställningar skulle behöva justeras för andra LC-MS-system.
| MaxQuant parameterinställningar | ||
| Inställningen | Åtgärd | |
| Gruppspecifika parametrar | ||
| Typ | Typ | Välj Standard |
| Multiplicity | Satt till 1 | |
| Matsmältning-läge | Enzymet | Välj Trypsin/P |
| Max. missade Klyvningar | Satt till 2 | |
| Ändringar | Variabel ändringar | Lägg till Phospho (STY) |
| Etikett-fri kvantifiering | Etikett-fri kvantifiering | Välj LFQ |
| LFQ min. baserat på antal | Satt till 1 | |
| Snabb LFQ | Bocka av | |
| Diverse | Re kvantifiera | Bocka av |
| Globala parametrar | ||
| Sekvenser | FASTA filer | Välj fasta fil laddas ner från UniProt |
| Fast ändringar | Lägg till Carbamidomethyl (C) | |
| Adv. identifiering | Matcha mellan körningar | Bocka av |
| Match tidsfönster | Inställd på 5 min | |
| Tidsfönster justering | Inställd på 20 min | |
| Matcha Oidentifierade funktioner | Bocka av | |
| Protein kvantifiering | Min. baserat på antal | Satt till 1 |
| Mapplatser | Ändra därefter | |
Tabell 3: MS analys Programvaruinställningar. I MaxQuant, var gruppspecifika och globala parametrarna i tabellen markeras eller justerat. Alla andra parametrar återstod på standard. Dessa experiment utfördes i version 1.5.3.30. Parametrarna kan variera från en version till och från programvara till programvara.
Discussion
Innan du använder detta protokoll att berika för phosphopeptides, är ett noggrant övervägande av experimentell design kritiskt. Använda biologiska replikat är en mer kostnadseffektiv användning av masspektrometri resurser än tekniska replikat. Antalet replikat som behövs beror delvis på variationer i data. En nyligen genomförd studie visade att medan ökar antalet replikat utöver tre endast marginellt ökar antalet identifieringar, antalet betydande identifieringar mellan grupper ökar med mer replikerar10.
På grund av det lägsta överflödet av phosphoproteins i cellen är tillräckligt protein utgångsbelopp nödvändiga för att erhålla en global phosphoproteome från prostatacancer prover i identifieringsläge. I dessa experiment användes 5 mg protein. Cirka fem nästan konfluenta 15-cm rätter av celler ger tillräckligt med protein som tillförs detta protokoll, även om detta blir cell linje-beroende. När det gäller tumörvävnad är den förväntade avkastningen av protein omkring 6-8% av vävnad vikt. I in vitro- inställningen för är ett positivt kontrollprov överväga tillägg av 1 mM vanadate för 30 min före skörd cellerna. Vanadate, ett konkurrenskraftiga protein phosphotyrosyl fosfatas hämmare, bevarar den tyrosin fosforylering, vilket ökar antalet pY peptid identifieringar29.
Ren matsmältningen är ett viktigt steg för att maximera phosphopeptide identifiering. Förutom Coomassie fläcken testet, kan procent av missade Klyvningar i data användas för att utvärdera matsmältning effektivitet (figur 2). Finns kvalitetskontroll programvara som analyserar missade Klyvningar och andra mått för att bedöma MS data kvalitet30. Medan trypsin är de vanligaste, alternativa proteaser finns genererade5 att åtgärda täckning brister i proteomet där optimal tryptic peptider inte kan vara31. Inställningarna för den MS-analysprogrammet skulle då behöva ändras i enlighet därmed justera för förändringar i proteaser.
Protokollet sysselsätter immunoprecipitation (för pY anrikning) samt titandioxid (TiO2) att berika för phosphopeptides. Alternativa sätt att berika för peptider inkluderar immobiliserade metall affinitetskromatografi (IMAC), andra metalloxider för metalloxid affinitetskromatografi (MOAC) såsom aluminiumhydroxid och polymerbaserade metall Jon affinitet capture (PolyMAC) 5,12. Tidigare studier har visat att olika anrikningsmetoder berika för olika populationer av phosphopeptides32. Exempelvis berikar IMAC fler multi-fosforyleras peptider medan MOAC helst berikar för mono-fosforyleras peptider33. Representativa resultat i detta protokoll speglar denna observation (figur 4B). En ny publikation visat att kombinera IMAC och MOAC använder en hybridmaterial potentiellt skulle kunna ge större täckning av phosphopeptide arter34. Detta protokoll kan således ändras för att utnyttja andra anrikningsmetoder parallellt som möjliggör ännu mer omfattande phosphoproteomic analyser.
MaxQuant26 mjukvaran sviten används för att analysera MS data i detta protokoll, men det finns också kommersiella tillämpningar35 för phosphopeptide identifiering och kvantifiering. Phosphopeptide identifiering tillämpas en lokalisering sannolikhet cutoff. Detta filter utförs för att markera för phosphopeptides med en högt förtroende (dvs.större än 0,75) phosphoresidue identifiering10,28. Med andra ord, är summerade sannolikheten för alla andra rester som kan potentiellt innehålla phospho-gruppen mindre än 0,25. Detta cutoff kan höjas för att öka striktheten hos phosphopeptide valet. När det gäller antalet identifieringar är det förväntade antalet pY peptider i hundratals, medan det förväntade antalet pST peptider är hög tusentals. Dessa värden återspeglar tidigare observerade phosphoproteome distribution där ca 2%, 12% och 86% av phosphosites är pY, pT och pS, respektive28.
Om pY och pST anrikning stegen utförs parallellt, kan provberedningssteg i protokollet slutföras i sex dagar. Genom att para ihop med det kraftfulla verktyget för MS, ger phosphopeptide anrikning protokollen som denna en global strategi för forskare att samla in data för att analysera phosphoproteome inom sina respektive forskningsområden.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar av Drake lab för att ge råd och input på manuskriptet. Vi tackar också ledamöterna i den biologiska Mass Spectrometry anläggning av Robert Wood Johnson Medical School och Rutgers, The State University of New Jersey, för rådgivning och utför masspektrometri på våra prover. Larry C. Cheng stöds av National Institute of General Medical Sciences av det nationella Institutes of Health award nummer T32 GM008339. Thomas G. Graeber stöds av NCI/NIH (SPORE i prostata Cancer P50 CA092131; P01 CA168585) och en American Cancer Society Research Scholar Award (RSG-12-257-01-TBE). Justin M. Drake stöds av den avdelning av försvar prostata Cancer Research Program W81XWH-15-1-0236, prostata Cancer Foundation Young Investigator Award, Stiftelsen New Jersey hälsa och en Precision Medicine initiativ Pilot Award från Rutgers Cancer Institute i New Jersey.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic | MDF-U76V | |
| Freezer -20 °C | VWR | scpmf-2020 | |
| Swing rotor bucket | ThermoFisher Scientific | 75004377 | |
| Vacuum manifold | Restek | 26080 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7420020 | |
| CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| End-over-end rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 620177 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC901024 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-26 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| 20G needle | BD | B305175 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Screw cap cryotube | ThermoFisher Scientific | 379189 | |
| Nunc 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 02-707-181 | |
| Millipore 0.2 µm spin filter | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
| Low protein-binding Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
| 27B10.4 antibody | Cytoskeleton | APY03-beads | |
| Peptide assay kit | Thermo Scientific | 23275 | Step 7 |
| TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Steps 5 and 9 |
| SCX columns (PolySULFOETHYL A) | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| Trifluoracetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI-28904 | |
| Acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific | A21-1 | |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypsin, TPCK Treated | Worthington Biochemicals | LS003740 | |
| Lysyl Endopeptidase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 125-05061 | |
| MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Step 10 |
| ZipTip | MilliporeSigma | ZTC18S096 | Step 6 |
| nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm | Waters | 186008794 | Step 11: analytical column |
| Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns | ThermoFisher Scientific | 164535 | Step 11: trap column |
| Ultimate 3000 RLSCnano System | Dionex | ULTIM3000RSLCNANO | Step 11 |
| Q Exactive HF | ThermoFisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Step 11 |
| MilliQ water | deionized water used to prepare all solutions and bufferes | ||
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | sonicator |
| Polytron System PT | Kinematica AG | PT 10-35 GT | homogenizer |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Paller, C. J., Antonarakis, E. S. Management of biochemically recurrent prostate cancer after local therapy: evolving standards of care and new directions. Clinical Advances in Hematology & Oncology. 11 (1), 14-23 (2013).
- Lowrance, W. T., Roth, B. J., Kirkby, E., Murad, M. H., Cookson, M. S. Castration-resistant prostate cancer: AUA guideline amendment 2015. The Journal of Urology. 195 (5), 1444-1452 (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nature Biotechnology. 28 (7), 710-721 (2010).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R.
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
- Bantscheff, M., Lemeer, S., Savitski, M. M., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: critical review update from 2007 to the present. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (4), 939-965 (2012).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Rubbi, L., et al. Global phosphoproteomics reveals crosstalk between Bcr-Abl and negative feedback mechanisms controlling Src signaling. Science Signaling. 4 (166), ra18 (2011).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Rush, J., et al. Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells. Nature Biotechnology. 23 (1), 94-101 (2005).
- Fila, J., Honys, D.
- Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
- Drake, J. M., et al. Phosphoproteome integration reveals patient-specific networks in prostate cancer. Cell. 166 (4), 1041-1054 (2016).
- Lue, H. W., et al. Metabolic reprogramming ensures cancer cell survival despite oncogenic signaling blockade. Genes & Development. 31 (20), 2067-2084 (2017).
- Francavilla, C., et al. Phosphoproteomics of primary cells reveals druggable kinase signatures in ovarian cancer. Cell Reports. 18 (13), 3242-3256 (2017).
- Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
- Skaggs, B. J., et al. Phosphorylation of the ATP-binding loop directs oncogenicity of drug-resistant BCR-ABL mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (51), 19466-19471 (2006).
- Zimman, A., et al. Activation of aortic endothelial cells by oxidized phospholipids: a phosphoproteomic analysis. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2812-2824 (2010).
- Zimman, A., Berliner, J. A., Graeber, T. G. Phosphoproteomic analysis of aortic endothelial cells activated by oxidized phospholipids. Methods in Molecular Biology. , 53-69 (2013).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Meyer, T. S., Lamberts, B. L. Use of coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochimica el Biophysica Acta. 107 (1), 144-145 (1965).
- Bergstrom Lind, S., et al. Immunoaffinity enrichments followed by mass spectrometric detection for studying global protein tyrosine phosphorylation. Journal of Proteome Research. 7 (7), 2897-2910 (2008).
- Pinkse, M. W., Uitto, P. M., Hilhorst, M. J., Ooms, B., Heck, A. J. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Analytical Chemistry. 76 (14), 3935-3943 (2004).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Olsen, J. V., et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell. 127 (3), 635-648 (2006).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. The Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Bielow, C., Mastrobuoni, G., Kempa, S. Proteomics quality control: quality control software for MaxQuant results. Journal of Proteome Research. 15 (3), 777-787 (2016).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Mueller, M., Domon, B., Aebersold, R. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nature Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
- Leitner, A., Sturm, M., Lindner, W. Tools for analyzing the phosphoproteome and other phosphorylated biomolecules: a review. Analytica Chimica Acta. 703 (1), 19-30 (2011).
- Yang, D. S., et al. Design and synthesis of an immobilized metal affinity chromatography and metal oxide affinity chromatography hybrid material for improved phosphopeptide enrichment. Journal of Chromatography A. 1505, 56-62 (2017).
- Al Shweiki, M. R., et al. Assessment of label-free quantification in discovery proteomics and impact of technological factors and natural variability of protein abundance. Journal of Proteome Research. 16 (4), 1410-1424 (2017).
