Summary
هنا يصف لنا إجراء لإزالة الأنسجة ووسم الفلورسنت والتصوير على نطاق واسع لانسجة المخ الماوس الذي، وبالتالي يمكن تصور منظمة ثلاثية الأبعاد لأنواع الخلايا في اللحاء الجديد.
Abstract
يتكون اللحاء الجديد الثدييات من أنواع عديدة من الخلايا العصبية ضادات والمثبطة، كل منها مع الخصائص الكهربية والبيوكيميائية، اتصالات متشابك، و في فيفو الوظائف، ولكن الأساسية الوظيفية والتشريحية المنظمة من الهاتف الخلوي إلى نطاق الشبكة هو غير مفهومة. هنا يصف لنا طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي عبر مناطق واسعة من الدماغ لتحقيق المنظمة الخلوية القشرية. أنواع معينة من الخلايا العصبية المسماة بحقن الفلورسنت تتبع الخلايا العصبية إلى الوراء أو تعبير البروتينات الفلورية في الفئران المعدلة وراثيا. عينات كتلة الدماغ، مثلاً، نصف الكرة الغربي، أعد بعد التثبيت، التي تتسم بالشفافية مع أنسجة تطهير الطرق، ويتعرضون إلى إيمونولابيلينج الفلورية لأنواع محددة من الخلايا. يتم تفحص مناطق كبيرة باستخدام مجاهر [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مجهزة بعمل كبير المسافة الأهداف والمراحل مزودة بمحركات. هذا الأسلوب يمكن حل المنظمة الدوري microcolumn الخاصة بنوع الخلية الوحدات الوظيفية في اللحاء الجديد الماوس. يمكن أن يكون هذا الإجراء مفيداً لدراسة البنية الخلوية ثلاثية الأبعاد في مجالات متنوعة من الدماغ والأنسجة المعقدة الأخرى.
Introduction
اللحاء الجديد الثدييات يتكون من عدد كبير من أنواع الخلايا، كل مع أنماط التعبير الجيني محددة، الخصائص البيوكيميائية والكهربية، والاتصالات متشابك، و في فيفو وظائف1،2 ،3،،من45،،من67. ما إذا كان يتم تنظيم أنواع هذه الخلية في هياكل المتكررة كانت غير واضحة. أعمدة القشرية، بما في ذلك الأعمدة المرئية التوجه وبرميل somatosensory، كررنا الهياكل، ولكن منظمتهم الخلوية ما زال غير واضح8،9. هذه موجودة في المناطق القشرية محددة ولا نظام على مستوى الدماغ.
وتصنف في طبقة نيوكورتيكال 5، الغالبية العظمى من الخلايا العصبية إلى أربعة أنواع رئيسية. نوع رئيسي من ضادات الخلايا العصبية، الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط، مشاريع محاور عصبية لأهداف subcortical منها بونس والحبل الشوكي، ووالاكيميه متفوقة، وعليه، يمثل مسار الإخراج القشرية الرئيسية10. الإسقاط القشرية الخلايا العصبية، نوع رئيسي آخر من ضادات الخلايا العصبية، يعصب قشرة10. الخلايا العصبية المثبطة تحتوي أيضا على الفئات الرئيسية هما: الخلايا الإعراب عن بارفالبومين والإعراب عن سوماتوستاتين11.
وتشير التحليلات الأخيرة إلى أن يتم تنظيم أنواع الخلايا الأربع في هياكل المتكررة12،،من1314. تنظيم الإسقاط الدماغي دون الخلايا العصبية12،،من1314 والإسقاط القشرية الخلايا العصبية14 في ميكروكولومنس نوع من الخلايا المحددة التي يبلغ قطرها 1-2 الخلايا. محاذاة الخلايا الإعراب عن بارفالبومين والإعراب عن سوماتوستاتين على وجه التحديد مع ميكروكولومنس من الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط ولكن ليس مع ميكروكولومنس من الإسقاط القشرية الخلايا العصبية14. ميكروكولومنس أنفسهم محاذاة دورياً للنموذج سداسية شعرية الصفيف14 وهي موجودة في المناطق القشرية متعددة بما في ذلك المناطق المرئية وسوماتوسينسوري والحركية في الدماغ الماوس12،14 وفي اللغة مناطق الدماغ البشري13. الخلايا العصبية في microcolumn الفردية، معرض الأنشطة المتزامنة واستجابات حسية مشابهة14. هذه الملاحظات تشير إلى أن تنظيم الطبقة 5 أنواع الخلايا في بنية شعرية microcolumn الذي يمثل أول منظمة على مستوى الدماغ المعروفة من تكرار وحدات وظيفية.
ميكروكولومنس دائرة نصف قطرها حوالي 10 ميكرون ويكون تواتر مكانية لحوالي 40 ميكرومتر. وبالإضافة إلى ذلك، اتجاه ميكروكولومنس موازية dendrites قمي والتغييرات تبعاً لموقفها في قشرة14. ولذلك، من الصعب النظام microcolumn لتحليل استخدام شرائح القشرية التقليدية مع سمك نموذجي من بضع عشرات من ميكرومتر. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب تحليل تواتر البيانات ثلاثية الأبعاد من مجموعة واسعة من مناطق الدماغ، وبالتالي، منطقة التصوير نموذجية للفحص المجهري [كنفوكل] أو في فيفو التصوير 2-فوتون ضيقة للغاية.
في الآونة الأخيرة، تم وضع تقنيات لمسح أنسجة سميكة15،16. هنا يصف لنا تطبيق هذه الأساليب للحصول على صور ثلاثية الأبعاد على نطاق واسع، ومن أنواع الخلايا الرئيسية في طبقة نيوكورتيكال الماوس 5 التي تشمل نظام microcolumn. الإسقاط سوبسيريبرال الخلايا العصبية المسماة بالتالي إلى الوراء أو بالتعبير عن البروتين الفلورية الخضراء المعززة في الفئران المعدلة وراثيا اجفب كريم 12، والإسقاط القشرية المسماة الخلايا العصبية التي أما رجعية وضع العلامات أو بتعبير تدتوماتو في Tlx3-لجنة المساواة العرقية/Ai9 الفئران17. الإعراب عن بارفالبومين والإعراب عن سوماتوستاتين الخلايا المسماة إيمونوهيستوتشيميستري. يستخدم الأسلوب (جسم مقياس S) أبسكاله18 لجسم تلطيخ التجارب، في حين يتم استخدام أسلوب سيدب (انظر الدماغ العميق)19 لتجارب أخرى. التغلب على الصعوبات المشار إليها أعلاه من أساليب التصوير التقليدية هذه الأساليب وتكشف عن تنظيم طبقة 514دقيقة الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت عليها اللجنة التجارب الحيوانية واكو بتبريد والتجربة المؤتلف الوراثية بتبريد سلامة اللجنة جميع الإجراءات التجريبية وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية من مرافق الحيوانات العلوم الدماغ بتبريد المعهد.
1-التحضير للتصوير الدوائر
-
تصوير الدائرة19
- استخدام أوراق المطاط سيليكون، إعداد دائرة بسمك حوالي 5 مم والطابق لوحات من سمك مختلف. كما أن إعداد أطباق بيتري مع أو بدون من أسفل زجاج (الشكل 1A).
-
فاصل شريحة
- إعداد الفواصل لإجراء عينات، واستخدام أوراق المطاط سيليكون بسمك 0.5 ملم (الشكل 1).
2-الراسم حقن
ملاحظة: إجراء الحقن في بونس (2.1) أو متفوقة والاكيميه (2.2). حقن في الخلايا العصبية الدماغية دون إسقاط التسمية بونس في منطقة واسعة من الدماغ بما في ذلك في المناطق البصرية والحركية، في حين حقن في الخلايا العصبية الدماغية دون إسقاط تسميات والاكيميه متفوقة في المجال المرئي. لمراقبة التجارب، حقن المحلول الملحي بدلاً من الكوليرا المسمى فلوريسسينتلي السمية فرعية ب للحفاظ على حالة معقمة استخدام معدات معقمة وقفازات بلاستيك تنظيفها مع الإيثانول.
-
جعل الحقن إلى بونس من الفئران الكبار.
- رسم 1 ميليلتر الكوليرا المسمى فلوريسسينتلي السمية فرعية ب (25 ميكروغرام/ميليلتر في برنامج تلفزيوني) في محقن هاملتون ز 26.
- مكان مضخة حاقن في المحاقن.
- وضع المحقن ومضخة على حامل أداة مناور وضعها في أداة ستيريوتاكسيك. إمالة مناور 12 درجة جيدة من المحور العمودي.
- تخدير ماوس البالغين الذكور أو الإناث (C57BL/6J أو Tlx3-cre/Ai9) عن طريق حقن بينتوباربيتال الصوديوم إينترابيريتونيلي (60 مغ/كغ من وزن الجسم) أو عن طريق إدارة إيسوفلوراني (2-3%). انتظر حتى الماوس يجعل أي استجابة عندما يتم مقروص ذيله مع الملقط، مما يشير إلى أن يتم تخديره الماوس تماما.
- ضع الماوس على الأداة ستيريوتاكسيك.
- بعناية إزالة الشعر باستخدام شفرة حلاقة لمنع العدوى وقطع 10 ملم من فروة الرأس حيث أن بريجما وامدا مرئية. إدارة 0.1 مل يدوكائين 1% استخدام ماصة. تعيين زاوية الرأس بضبط الموضع العمودي للناطقة باسم الصك ستيريوتاكسيك حيث يكون بريجما وامدا نفس المستوى z.
- ضبط موضع المناور بتحريكه على الصك ستيريوتاكسيك حيث يكون غيض المحاقن قريبة بريجما وتسجيل موقف المناول. سحب المحاقن بتحريك حامل أداة على المناور.
- الانتقال المناور 5.4 مم الخلف و 0.4 ملم أفقياً. تقدم المحاقن حيث أن التلميح يقع بالقرب من نقطة دخول في الجمجمة. سحب المحاقن، وعلامة نقطة الإدخال.
- في موقف واضح، حفر حفرة قطرها حوالي 1 مم.
- إدراج تلميح حقنه من خلال الثقب حيث يكون عمق نصيحة 6.9 ملم أكثر من أن تقاس في بريجما.
- حقن 1 ميليلتر لتتبع استخدام المضخة في 0.2 ميليلتر/دقيقة.
- إزالة المحاقن من الدماغ.
- إذا لزم الأمر، تغطي الدماغ المكشوفة بشظايا صغيرة من هيموستات ميكروفيبريلار ولاصق الفورية.
- شطف في الدماغ يتعرض استخدام المحلول الملحي تسليمها مع ماصة لمنع العدوى وخياطة فروة الرأس.
- إزالة الماوس من الصك ستيريوتاكسيك. تسمح الماوس للتعافي من التخدير في حاضنة في ˚C 30، عادة ح 1. لا تترك الماوس غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. العودة الماوس لشركة الحيوانات الأخرى بعد قد تعافي تماما.
- الحفاظ على الماوس لمدة 3 – 7 أيام.
-
إجراء الحقن في والاكيميه متفوقة من الفئران الكبار.
- إعداد ماصة زجاج نصيحة قطرها 30-50 ميكرون.
- قم بتوصيل ماصة زجاجية حقنه هاميلتون عن طريق أنبوب بلاستيكي (الشكل 2A).
- تعبئة ماصة زجاجية وأنبوب من البلاستيك، والمحاقن هاملتون بالسائل البارافين.
- مكان مضخة حاقن في المحاقن.
- ضع ماصة زجاجية على المناور وآماله مناور 60 درجة جيدة من المحور الرأسي (الشكل 2).
- أداء 2.1.4–2.1.9. وموقف المناور 1.4 مم الخلفي، الجانبي 0.5 مم إلى لامدا.
- ضع فيلم بارافين بلاستيكية صغيرة في الجمجمة، ثم وضع حوالي 1 ميليلتر من الحل الراسم على ذلك. بسرعة تقدم ماصة زجاجية وملء مع مالا يقل عن 0.5 ميليلتر من الحل الراسم.
- إدراج الماصة الزجاجية حيث يكون عمق نصيحة 3.0 مم من سطح الدماغ.
- حقن 0.5 ميليلتر لتتبع استخدام المضخة في 0.2 ميليلتر/دقيقة.
- إزالة ماصة زجاجية من الدماغ.
- أداء 2.1.13–2.1.16.
3-التثبيت والتشذيب
- حقن الصوديوم بينتوباربيتال (60 مغ/كغ من وزن الجسم) إينترابيريتونيلي ماوس (C57BL/6J أو Tlx3-/Ai9لجنة المساواة العرقية، مع أو بدون حقن التتبع كما هو موضح في الخطوة 2. انتظر حتى الماوس يجعل أي استجابة عندما يتم مقروص ذيله مع الملقط، مما يشير إلى أن يتم تخديره الماوس تماما.
- Euthanize الماوس إنسانية قبل بيرفوسينج ترانسكارديالي الماوس20 مع المالحة 0.9 في المائة.
- إصلاح الماوس20 من بيرفوسينج بارافورمالدهيد 4% (PFA) في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (درجة الحموضة 7.5).
-
قص فروة الرأس باستخدام مقص لفضح الجمجمة ك وصف20.
- قطع خط الوسط الجمجمة المكشوفة باستخدام زوج من مقص. إزالة الجمجمة باستخدام الملقط.
- إذا كان من الضروري تمييز موقف بريجما وامدا، قم أولاً بإزالة واحدة نصف الكرة الأرضية للجمجمة. إدراج الإبر التنغستن رقيقة في الدماغ في مواقف بريجما وامدا في الجمجمة المتبقية على الدماغ، ثم إزالة الجمجمة المتبقية.
ملاحظة: يمكن تخزين الدماغ في برنامج تلفزيوني في 4 ˚C.
-
القيام بتلوين الأجسام المضادة للخلايا العصبية المثبطة، قطع عينات المخ إلى شرائح.
- وضع العينة الدماغ على فيبرتوم.
- قطع شرائح يصل إلى 500 ميكرومتر سميكة في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة، والانتقال إلى الخطوة 5 (أبسكاله أسلوب).
- إذا كان جسم تلطيخ لا لزوم لها، عينة الدماغ لكتل تريم (تصل إلى 3 مم) باستخدام شفرة حلاقة (الشكل 3)، والانتقال إلى الخطوة 4 (أسلوب سيدب).
ملاحظة: المخ يمكن تخزين في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية بعد القص أو التشذيب. الأسلوب سيدب الأفضل عندما تلطيخ جسم ليس ضروريا لأنه يتطلب وقتاً أقل من أسلوب هلأبسكا.
4-تطهير دون جسم تلطيخ (أسلوب سيدب)
- نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 20% (w/v) واحتضان من أجل ح 4 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل α-ثيوجليسيرول 0.5% وسكر الفواكه 40% (w/v) واحتضان من أجل ح 4 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 60% (w/v) واحتضان من أجل ح 4 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 80% (w/v) واحتضان من أجل ح 12 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 100% (w/v) واحتضان من أجل ح 12 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 80.2% (w/w) واحتضان من أجل 24 ساعة مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: التعامل مع العينة بعناية للحفاظ على تشوهات صغيرة بقدر الإمكان. عدم احتضان عينات أطول مما ورد، كعينات يمكن أن تصبح بسرعة غير شفاف. - تضمين العينة في دائرة تصوير لشغلها مع الحل سكر 80.2 في المائة (الشكل 1B). إذا لزم الأمر، إصلاح العينة بوضع القطع الصغيرة من المطاط لاصق حولها. إذا كانت الدائرة عميق جداً، وضعت صفيحة الكلمة في الدائرة قبل وضع العينات.
- ضع طبق بيتري مع غطاء زجاج في قاعة التصوير ووضع الماء في طبق، والصورة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مع غمر مياه تعمل منذ فترة طويلة المسافة والهدف. ويرد في الجدول 1موجات الإثارة وعوامل الانبعاثات. إذا لزم الأمر، استخدم مرحلة إليه.
5-تطهير مع جسم تلطيخ (أبسكاله أسلوب)
- إعداد الكواشف كما هو موضح في الجدول 2.
- نقل الشرائح باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيك 5 مل تحتوي على 4 مل من محلول Sca/eS0 واحتضانها لهم ح 12 مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية (الشكل 4 باء).
- إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل من محلول Sca/eA2، واحتضان الشرائح من ح 36 مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية.
- إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل من محلول Sca/eB4، واحتضان الشرائح من 24 ساعة مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية.
- إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل من محلول Sca/eA2، واحتضان الشرائح من ح 12 مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية.
- إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان الشرائح من ح 6 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- بعناية إزالة الشرائح إلى أنبوب بلاستيكي 2 مل باستخدام ملعقة.
- احتضان مع الأجسام الأولية (الجدول 3) في 1 مل من أبسكاله حل ح 48-72 في 37 درجة مئوية (الشكل 4) مع الهز لطيف.
- بعناية إزالة الشرائح إلى أنبوب بلاستيك 5 مل باستخدام ملعقة.
- تبني في 4 مل من أبسكاله حل ح 2 2 مرات في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
- بعناية إزالة الشرائح إلى أنبوب بلاستيكي 2 مل باستخدام ملعقة.
- احتضان مع المسمى فلوريسسينتلي الثانوي الأجسام المضادة (الجدول للمواد، 1: 100) في 1 مل من أبسكاله حل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف.
- بعناية إزالة الشرائح باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيك 5 مل تحتوي على 4 مل من أبسكاله الحل واحتضان الشرائح من ح 6 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة إضافة 4 مل من أبسكاله الحل واحتضان الشرائح من ح 2 2 مرات مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل 4% منهاج عمل بيجين، واحتضان الشرائح من ح 1 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان الشرائح من ح 1 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل الحل Sca/eS4، واحتضان الشرائح من ح 12 مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية.
- مكان فاصل على شريحة زجاجية ووضع الشرائح في المباعدة وتزج الشرائح مع الحل Sca/eS4. ختم فاصل مع زجاج الغطاء (الشكل 1).
- وضع المياه في تغطية الزجاج والصورة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مع غمر مياه تعمل منذ فترة طويلة المسافة والهدف. إذا لزم الأمر، استخدم مرحلة إليه.
ملاحظة: التحقق من ما إذا كانت الأجزاء العميقة من العينة المسماة المثل إلى أجزاء سطحية للتأكد من عدم وجود تحيز كبير وضع العلامات.
ملاحظة: يتم وصف الاختراق من الأجسام المضادة التي تم اختبارها في الجدول 3.
6-خلية تحديد الموقع
- لكل موقف في الصور الممسوحة ضوئياً، حساب قيم الارتباط باستخدام تصفية صورة ثلاثية الأبعاد14 (الشكل 5A-5D).
- تحديد مواقف قمم قيمة الارتباط (الشكل 5).
- التحقيق الصور حول قمم لتحديد موقع الخلايا (الشكل 5E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن المسماة الخلايا العصبية القشرية الإسقاط بالتعبير عن تدتوماتو في Tlx3-لجنة المساواة العرقية/Ai9 الفئران المحورة وراثيا وتصور الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط عن طريق حقن الراسم إلى الوراء CTB488 في بونس. تعرضت للأسلوب سيدب نصف الكرة الأيسر من الدماغ وتفحص باستخدام مجهر اثنين-فوتون مزودة الماء غمر تعمل منذ فترة طويلة المسافة الهدف (25 X، 1.1 N.A.، المسافة العمل 2 مم) ومرحلة إليه. كومة من الصور 401 (512 × 512 بكسل؛ وحجم بكسل = 0.99 ميكرومتر) في خطوة z = 2.8 ميكرومتر في كل من 30 مسح مواقع تم الحصول عليها. الهيئات الخلية من أنواع الخلايا اثنين كانت مرئية عبر طائفة واسعة من مناطق الدماغ (الشكل 6)، وأقسام الضوئية أظهر ميكروكولومنس الدوري (الشكل 7 أ). وباﻹضافة إلى ذلك، مسح بواسطة الأسلوب سيدب أدمغة الفئران اجفب كريم (المحافظة ك heterozygotes مع خلفية C57BL/6J) وتصويرها على النحو المذكور أعلاه. الهيئات الخلية و dendrites قمي للتعبير عن اجفب الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط كانت مرئية في الأجزاء البصرية (الشكل 7).
كما أجرينا وسم تراجعية من الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط في الفئران C57BL/6J باستخدام CTB488. كان مقطعة شرائح الاكليلية مع سماكة حوالي 500 ميكرومتر الدماغ ثابتة وتعرض للأسلوب أبسكا هللتسمية الخلايا معربا عن بارفالبومين (المضادة بارفالبومين، 1: 1000؛ الماوس المضادة IgG فلوريسسينتلي المسمى،). كومة صور (512 × 512 بكسل، حجم بكسل = 1.24 ميكرومتر؛ z-خطوة = 2.17 ميكرومتر، والصور/مكدس 268) تم الحصول عليها باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] مع غمر مياه تعمل منذ فترة طويلة المسافة والهدف (20 س، N.A. 1.0، العمل عن بعد 2 مم). إذ تعرب عن بارفالبومين الخلايا والخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط على حد سواء مرئية في الشرائح (الشكل 7).
رقم 1: التصوير الدوائر والفواصل. (أ) أعلى: اليدوية زجاجية بيتري طبق (يمين) وطبق بيتري دون أسفل زجاج (إلى اليسار). أسفل: دائرة (يمين) ولوحات الكلمة (يسار) مصنوعة من صفائح السيليكون. (ب) نصف الكرة الماوس يتعرض للأسلوب سيدب بعد تعيين ضخ CTB555 في والاكيميه العليا في الدائرة. هو ثابت العينة بقطعة لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام. (ج) الشريحة الزجاجية (أعلى) وفاصل مصنوعة من ورقة السيليكون مع سمك 0.5 مم (أسفل). (د) شريحتين الاكليلية الدماغ الماوس إلى فاصل، ومغطاة بغطاء زجاج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: حقن الراسم. ماصة زجاجية (A) A متصل بحقنه هاميلتون عن طريق أنبوب بلاستيكي. يتم وضع الماوس (ب) على أداة ستيريوتاكسيك. ماصة زجاجية يميل نحو 60 درجة جيدة من المحور الرأسي لحقن في والاكيميه متفوقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التشذيب من عينات المخ. (أ) عينة الجامعة الدماغ بعد حقن CTB555 إلى والاكيميه متفوقة والتثبيت. وتميزت بريجما وامدا مع التنغستن الإبر (رؤوس الأسهم). (ب) نفس العينة اقتطاعها للحصول على نصف الكرة. علما بأن تظل الإبر التنغستن (رؤوس الأسهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: غمر العينات الدماغ في الحلول لأساليب هلسيدب وأبسكا. A (A) نصف الكرة الغربي عينة مغمورة في 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 20% (w/v) للأسلوب سيدب. (ب) شرائح الاكليلية منغمسين في حل Sca/eA2 لأسلوب هلأبسكا. (ج) شرائح الاكليلية منغمسين في أبسكاله حل الذي يحتوي على أجسام مضادة لأسلوب هلأبسكا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تحديد وظائف الخلية. كانت تسمية الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط عن طريق حقن الراسم إلى الوراء CTB488 في بونس في 5 أسابيع عمر. كان تعرض للأسلوب سيدب نصف الكرة الأيسر وتفحص بالميكروسكوب اثنين-فوتون (512 × 512 بكسل، حجم بكسل = 0.99 ميكرومتر؛ z-خطوة = 2.8 ميكرون، والصور/مكدس 601). (أ) بصورة واحدة. (ب) خمس صور من كومة صورة مفردة. (ج) الصورة عامل التصفية المستخدم للكشف عن الخلايا العصبية الإسقاط الدماغي الفرعي المسمى الحظر الشامل للتجارب. (د) حساب قيم الارتباط لخمس صور في (ب) باستخدام عامل التصفية في (ج). (ه) أمثلة للإسقاط الدماغي دون الكشف عن الخلايا العصبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: نتائج تمثيلية للتصوير على نطاق واسع- كانت المسماة الخلايا العصبية الإسقاط القشرية (الأخضر) بالتعبير تدتوماتو في Tlx3-لجنة المساواة العرقية/Ai9 الفئران المعدلة وراثيا، وكانت تصور الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط (أرجواني) عن طريق حقن الراسم إلى الوراء CTB488 في بونس في 7 أسابيع من العمر. تعرض نصف الكرة الأيسر للأسلوب سيدب وميكرومتر منطقة 1,250 إلى 2,690 مكم الجانبي وميكرون-3,400 على مكم 1,230 عرفت بريجما تم مسحها ضوئياً باستخدام الفحص المجهري اثنين-فوتون. (أ) عرض أعلى. وعرضت مواقف التقريبي للمناطق القشرية. (ب–د) عرض منحرف من الأسفار 488 الحظر الشامل للتجارب تظهر الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط (ب)، تدتوماتو fluorescence يظهر الإسقاط القشرية الخلايا العصبية (ج)، والصورة المدمجة (د). ج: الأمامي؛ P: الخلفي؛ م: الآنسي؛ دال: الظهرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: صور تضخم عالية لنتائج الممثل. (أ) قسم بصري للصورة في الشكل 6. صورة سمك = 20 ميكرومتر. (ب) الإسقاط الدماغي الفرعي المسمى اجفب الخلايا العصبية في ماوس اجفب كريم متخالف في 6 أسابيع عمر. صورة سمك = 30 ميكرومتر. (ج) سوبسيريبرال الإسقاط كانت تسمية الخلايا العصبية (أرجواني) عن طريق حقن CTB488 في بونس الفئران C57BL/6J في يوم الولادة 49، وإذ تعرب عن بارفالبومين الخلايا (الأخضر) كانت تصور بطريقة أبسكاله. صورة سمك = 55 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| فلوروفوري | خروج (nm) | عامل تصفية (nm) |
| اجفب | 910 | 500-550 (FF03-525/50-25، سيمروك) |
| تدتوماتو | 1,000 | 578-633 (D605/55 م، وصفاء) |
| فلور أليكسا 488 | 750 | 500-550 (FF03-525/50-25، سيمروك) |
| فلور أليكسا 555 | 750 | 563-588 (FF03-575/25-25، سيمروك) |
| فلور أليكسا 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56، سيمروك) |
| DAPI | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25، سيمروك) |
الجدول 1: موجات الإثارة ومرشحات للفحص المجهري اثنين-فوتون.
الجدول 2: المواد الكاشفة لأسلوب ه أبسكال. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
| مستضد | الحيوان المحصنين | معرف المنتج | تركيز | كتلة 3 مم | شريحة 500 ميكرومتر |
| NeuN | الماوس | MAB377 | 1: 500 | وفيات المواليد | + |
| NeuN | الأرنب | ABN78 | 1: 500 | وفيات المواليد | + |
| CTIP2 | فأر | ab18465 | 1: 100 | L1-L6 | + |
| Statb2 | الماوس | ab51502 | 1: 100 | - | - |
| GAD67 | الماوس | MAB5406 | 1: 200 | وفيات المواليد | + |
| غابا | الأرنب | A2052 | 1: 100 | - | - |
| بارفالبومين | الماوس | 235 | 1: 1000 | وفيات المواليد | + |
| بارفالبومين | ماعز | PV-اذهب--Af460 | 1: 100 | L1-L2/3 | + |
| بارفالبومين | الماوس | P3088 | 1: 1000 | وفيات المواليد | + |
| بارفالبومين | الأرنب | ab11427 | 1: 500 | وفيات المواليد | - |
| سوماتوستاتين | الأرنب | T-4103 | 1: 1000 | L1-L2/3 | + |
| ج-المنحدر | الأرنب | PC38 | 1: 1000 | وفيات المواليد | + |
الجدول 3: اختراق الأجسام المضادة التي تم اختبارها. يتم عرض النتائج عن 3 مم سميكة كتل كما يلي؛ L1-L6: اختراق سمك القشرية عموما؛ L1-L2/3: اختراق وصولاً إلى طبقة 2/3؛ -: لا وضع العلامات؛ ND: لم يحدد. يظهر نتائج ل 500 ميكرومتر سميكة شرائح كما يلي؛ +: تسمية موحدة؛ -: لا يوجد أو محدودة في وضع العلامات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد قدمنا إجراءات للحصول على صور ثلاثية الأبعاد الواسعة النطاق للمنظمة خلية نوع معين من أنواع الخلايا الرئيسية في طبقة نيوكورتيكال الماوس 5. مقارنة لتلطيخ شريحة التقليدية، يكون الأسلوب أكثر فائدة في تحديد منظمة ثلاثية الأبعاد من اللحاء الجديد. الأسلوب الذي يتيح الحصول على الصور من نطاق أوسع وأعمق مناطق الدماغ مقارنة نموذجية في فيفو 2-فوتون مجهرية أو مجهرية [كنفوكل] التقليدية، وبالتالي، يمكن السماح بالتحليل الشامل للخلوي نيوكورتيكال المنظمة.
خطوة حاسمة للأسلوب هو إيلاج جسم. مجموعة فرعية من الأجسام المضادة يظهر ضعف اختراق العينات سميكة (الجدول 3)، وذلك، لا يمكن استخدام لأسلوب هلأبسكا. للحصول على تصنيف موحد مع الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة، من الضروري خفض الدماغ إلى 500 ميكرومتر شرائح. استخدام أصغر أجزاء جسم، مثل القوات المسلحة البوروندية أو الشظايا F(ab') 2، و/أو أخرى مسح أساليب21،،من2223،24،،من2526، ،من 2728 قد يحسن النتائج.
جسم مستضد ملزمة خصوصية يتميز عادة بشرائح رقيقة من الأنسجة ولكن قد تكون مختلفة في أنسجة سميكة المجهزة للمقاصة. للتحكم لخصوصية جسم، المشترك المسمى الأنسجة مع التعبير الجيني الحقن وعلامة التتبع في الحيوانات المحورة وراثيا، وأجرى أيضا حظر تجارب استخدام مستضد الببتيدات والبروتينات14. ينبغي أن تكون هذه الإجراءات والتجارب تحكم استخدام الحيوانات المسخ تفتقر إلى المستضدات المستهدفة مفيدة لتأكيد الطابع الخاص للأجسام المضادة.
تحديد الأسلوب أن بعض التشوه للعينة لا مفر منه بسبب التعامل مع العينات المجمعة الناعمة. الحصول على الصور في فيفو قبل تثبيت واستخدام هذه الصور كمراجع سوف تساعد على تصحيح هذه التشوهات.
وصممت هذه الإجراءات لتحليل طبقة نيوكورتيكال 5. التحليلات الأخيرة حددت العديد من المؤشرات الجزيئية أن أنواع الخلايا العصبية التسمية في سائر الطبقات4،5،،من67، وقد تمكن تطبيق هذه صناع للأسلوب الحالي تحديد مهمة المنظمة الخلوية في الطبقات الأخرى. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يكون من الممكن إجراء تحليلات مماثلة في مناطق الدماغ خلاف اللحاء الجديد وفي الأجهزة عدا المخ، للتحقيق في ما إذا كان هو منظمة خلوية دقيقة شبيه ميكروكولومنس موجود.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نشكر أتسوشي ميياواكي وحماه هيروشي لمشورتها على تجارب هلأبسكا، تشارلز يوكوياما لتحرير المخطوطة، Eriko Ohshima وكيشينو ميوكي للمساعدة التقنية التي تقدمها. هذا العمل كان تدعمها أموال البحوث من بتبريد T.H. ومعونة "البحث العلمي" من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون) من اليابان إلى T.H. (المجالات المبتكرة "Mesoscopic نيوروسيركويتري"؛ 22115004) و س. س. (25890023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
