Summary
Her beskriver vi en prosedyre for vev fjerne fluorescerende merking og store avbilding av musen hjernevev som gir dermed, visualisering av tredimensjonale organisasjonen celletyper i neocortex.
Abstract
Pattedyr neocortex består av mange typer eksitatoriske og inhibitory neurons, hver med bestemte elektrofysiologiske og biokjemiske egenskaper, synaptic tilkoblinger, og vivo fungerer, men deres grunnleggende funksjonelle og anatomisk organisasjonen cellular nettverk skala er dårlig forstått. Her beskriver vi en metode for tredimensjonale avbilding av fluorescently-merket neurons over store områder av hjernen for etterforskningen av kortikale mobilnettet organisasjonen. Bestemte typer nerveceller merket av injeksjon av fluorescerende retrograd neuronal tracers eller uttrykk fluorescerende proteiner i transgene mus. Blokkere hjernen prøvene, f.eks en halvkule, utarbeidet etter fiksering, laget gjennomsiktig med vev fjerne metoder og underlegges fluorescent immunolabeling de spesifikke celletyper. Store områder er skannet med AC confocal eller to-fotonet mikroskop utstyrt med store arbeider avstand mål og motorisert stadier. Denne metoden kan løse periodiske organiseringen av celle type-spesifikk microcolumn funksjonelle modulene i musen neocortex. Prosedyren kan være nyttig for studier av tredimensjonale mobilnettet arkitektur i ulike hjernen områder og andre komplekse vev.
Introduction
Pattedyr neocortex består av en rekke celletyper, hver med bestemte genet uttrykk mønstre, elektrofysiologiske og biokjemiske egenskaper, synaptic tilkoblinger, og vivo fungerer1,2 ,3,4,5,6,7. Om disse celletyper organiseres i gjentatte strukturer er uklart. Kortikale kolonner, inkludert visuell retning kolonner og somatosensory fat, har gjentatt strukturer, men organisasjonen mobilnettet forblir uklart8,9. Disse finnes i bestemte kortikale områder og er ikke en hjerne systemoppetid.
I neocortical lag 5, er det store flertallet av neurons klassifisert til fire hovedtyper. En hovedtype av eksitatoriske neurons, sub cerebral projeksjon neurons, prosjekter axons å subkortikal mål inkludert pons, ryggmargen og overlegen colliculus, og representerer derfor den store kortikale utgang sti10. Kortikale projeksjon neurons, en annen stor type av eksitatoriske neurons, innervate cortex10. Hemmende neurons inneholder også to store klasser: parvalbumin-uttrykke og somatostatin-uttrykke celler11.
Siste analyser viser at de fire celletyper organiseres i gjentatte strukturer12,13,14. Både sub cerebral projeksjon neurons12,13,14 og kortikale projeksjon neurons14 organisere i celle-type spesifikke microcolumns med en diameter på 1 – 2 celler. Parvalbumin-uttrykke og somatostatin-uttrykke cellene justeres med microcolumns sub cerebral projeksjon neurons, men ikke med microcolumns av kortikale projeksjon neurons14. Microcolumns seg justerer regelmessig til et Sekskantet gitteret matrise14 og finnes i flere kortikale områder inkludert visuelle, somatosensory og motor i musen hjernen12,14 og språk områder av hjernen13. Nerveceller i den personlige microcolumn utstilling synkronisert aktivitet og har lignende sensoriske svar14. Disse observasjonene indikerer at lag 5 celletyper organisere i en microcolumn gitter struktur representerer den første kjente hjerne hele organisasjonen gjentatte funksjonelle modulene.
Microcolumns har en radius på ca 10 µm og en romlig periodisitet av ca 40 µm. I tillegg er retningen for microcolumns parallell til apikale dendrites og endres avhengig av sin posisjon i cortex14. Microcolumn systemet er derfor vanskelig å analysere ved hjelp av konvensjonelle kortikale skiver med en vanlig tykkelse på noen titalls mikrometer. I tillegg analyse av periodisitet krever tredimensjonale data fra en rekke hjernen områder, og derfor typisk tenkelig området AC confocal mikroskopi eller i vivo 2-fotonet imaging er for smal.
Nylig er teknikker utviklet for å fjerne tykk vev15,16. Her beskriver vi bruk av disse metodene for å få store, tredimensjonale bilder av de store celletyper i musen neocortical lag 5 som utgjør microcolumn systemet. Subcerebral projeksjon neurons er merket retrograd merking eller uttrykk for forbedret grønne fluorescerende proteinet i Crym-egfp transgene mus12og kortikale projeksjon neurons er merket med enten av retrograd merking eller ved det tdTomato uttrykket i Tlx3-grobunn/Ai9 mus17. Parvalbumin-uttrykke og somatostatin-uttrykke celler er merket av immunhistokjemi. (Antistoff skala S) AbScale metoden18 brukes antistoffer flekker eksperimenter, mens (se dypt hjernen) SeeDB metoden19 brukes for andre eksperimenter. Disse metodene overvinne nevnte vanskelighetene av konvensjonelle tenkelig metoder og avsløre nøyaktig mobilnettet organisasjonen lag 514.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av RIKEN ham til dyr eksperimenter komiteen og RIKEN genetisk rekombinant eksperiment sikkerhetskomite og utført i henhold til institusjonelle retningslinjer dyr fasiliteter RIKEN hjernen vitenskap Instituttet.
1. forberedelse Imaging Chambers
-
Imaging kammer19
- Bruker silikon gummi ark, forberede et kammer med en tykkelse på ca 5 mm og gulvet plater av ulike tykkelser. Også forberede Petri retter med og uten et glass bunn (figur 1A).
-
Skjær spacer
- Forberede avstandsstykker å holde prøver, silikon gummi ark med en tykkelse på 0,5 mm (figur 1 c).
2. tracer injeksjon
Merk: Kontroller injeksjoner i enten pons (2.1) eller overlegen colliculus (2.2). Injeksjon i pons etiketten sub cerebral projeksjon neurons i en bred hjernen regionen inkludert visuelle og motor, mens injeksjon i overlegen colliculus etiketter sub cerebral projeksjon neurons i visuelle området. For kontroll eksperimenter, injisere saltvann i stedet for fluorescently-merket kolera gift delenhet B. Bruke sterilisert utstyr og plastikk hansker med etanol for vedlikehold av sterile tilstand.
-
Gjøre injeksjoner i pons voksen mus.
- Trekke 1 µL av fluorescently-merket kolera gift delenhet B (25 µg/µL i PBS) 26 G Hamilton sprøyter til.
- Plass en injektor pumpe på sprøyten.
- Plass sprøyten og pumpen på redskapsholder av en manipulator plassert på et stereotaxic instrument. Vipp manipulatoren 12° posteriorly fra den loddrette aksen.
- Bedøve en mannlig eller kvinnelig voksen mus (C57BL/6J eller Tlx3-grobunn/Ai9) ved å injisere natrium pentobarbital intraperitoneally (60 mg/kg kroppsvekt) eller ved å administrere isoflurane (2-3%). Vent til musen gjør ingen respons når halen er tatt med tang, som angir at musen er fullt anesthetized.
- Plass musen på stereotaxic apparatet.
- Nøye fjerne hår med et barberblad å forhindre infeksjon og kutte 10 mm av hodebunnen slik at bregma og lambda vises. Administrere 0,1 mL 1% lidocaine bruker en pipette. Angi vinkelen på hodet ved å justere den vertikale plasseringen av munnstykket på stereotaxic maskinen slik at bregma og lambda har den samme z-nivået.
- Juster plasseringen av manipulatoren ved å skyve det på stereotaxic apparatet slik at spissen av ligger i bregma og registrere plasseringen av manipulatoren. Trekke sprøyten ved å flytte redskapsholder på manipulatoren.
- Flytte manipulatoren 5.4 mm posteriorly og 0.4 mm sidelengs. Forhånd sprøyten slik at spissen ligger inngangspunkt på skallen. Trekke sprøyten og merke inngangspunkt.
- På den merkede plasseringen, bore hull med en diameter på ca 1 mm.
- Stikk sprøyten gjennom hullet slik at tips dybden er 6,9 mm mer enn som målt på bregma.
- Injisere 1 µL av tracers bruker pumpen på 0,2 µL/min.
- Fjern sprøyten fra hjernen.
- Eventuelt dekk eksponert hjernen med små fragmenter av microfibrillar hemostat og øyeblikkelig limet.
- Skyll eksponert hjernen med saltvann leveres med en pipette å forhindre infeksjon og Sutur hodebunnen.
- Fjerne musen fra stereotaxic apparatet. La musen for å gjenopprette fra anestesi i en inkubator på 30 grader, typisk for 1t. Ikke la musen uovervåket før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Tilbake musen til selskapet av andre dyr når den er fullstendig gjenopprettet.
- Opprettholde musen for 3-7 dager.
-
Gjøre injeksjoner i overlegen colliculus voksen mus.
- Forberede en glass pipette tips diameter på 30-50 µm.
- Koble glass Pipetter til Hamilton sprøyter gjennom et plastrør (figur 2A).
- Fyll glasset pipette, plastrør, og Hamilton sprøyte med parafin væsken.
- Plass en injektor pumpe på sprøyten.
- Plasser glass pipette på manipulatoren og tilt manipulatoren 60° posteriorly fra den loddrette aksen (figur 2B).
- Utføre 2.1.4–2.1.9. Manipulatoren er 1,4 mm bakre, 0,5 mm lateral til lambda.
- Plassere en liten plast parafin film på skallen, og sett ca 1 µL av tracer løsningen på den. Raskt fremme glass pipette og fyll den med minst 0,5 µL av tracer løsningen.
- Sett inn glass pipette slik at tips dybden er 3.0 mm fra hjernen overflaten.
- Injisere 0,5 µL av tracers bruker pumpen på 0,2 µL/min.
- Fjern glass pipette fra hjernen.
- Utføre 2.1.13–2.1.16.
3. fiksering og beskjæring
- Injisere natrium pentobarbital (60 mg/kg kroppsvekt) intraperitoneally i en mus (C57BL/6J eller Tlx3-grobunn/Ai9, med eller uten tracer injeksjon som beskrevet i trinn 2. Vent til musen gjør ingen respons når halen er tatt med tang, som angir at musen er fullt anesthetized.
- Euthanize musen Human av perfusing musen transcardially20 med 0,9% saltløsning.
- Fastsette mouse20 av perfusing 4% paraformaldehyde (PFA) inne 0.1 M fosfatbuffer (pH 7.5).
-
Kuttet hodebunnen med en saks for å avsløre skallen som beskrevet20.
- Kuttet midtlinjen av eksponert skallen med en saks. Fjerne skallen ved hjelp av pinsett.
- Hvis det er nødvendig å merke plasseringen av bregma og lambda, fjerne en halvkule av skallen. Tynn tungsten nåler inn hjernen på posisjonene bregma og lambda på skallen på hjernen, og deretter fjerne gjenværende skallen.
Merk: Hjernen kan lagres i PBS på 4 grader.
-
For å utføre antistoff flekker hemmende neurons, skivet hjernen prøvene.
- Plass prøven hjernen på en vibratome.
- Skiver til 500 µm tykk i PBS ved romtemperatur og Fortsett til trinn 5 (AbScale metoden).
- Hvis antistoff flekker er unødvendig, trim hjernen prøve å blokkerer (opptil 3 mm tykk) bruker et barberblad (Figur 3) og videre til trinn 4 (SeeDB-metoden).
Merk: Hjernen kan lagres i PBS på 4 ° C etter klippe eller trimme. Metoden SeeDB er å foretrekke når antistoff flekker ikke er nødvendig fordi den krever mindre tid enn metoden AbScale.
4. fjerne uten antistoff flekker (SeeDB-metoden)
- Overføre prøven ved hjelp av en slikkepott til et 50 mL plastrør som inneholder 20 mL 0,5% α-thioglycerol og 20% (w/v) fruktose og ruge det 4 h med mild skjelvende ved romtemperatur.
- Overføre prøven ved hjelp av en slikkepott til et 50 mL plastrør som inneholder 20 mL 0,5% α-thioglycerol og 40% (w/v) fruktose og ruge det 4 h med mild skjelvende ved romtemperatur.
- Overføre prøven ved hjelp av en slikkepott til et 50 mL plastrør som inneholder 20 mL 0,5% α-thioglycerol og 60% (w/v) fruktose og ruge det 4 h med mild skjelvende ved romtemperatur.
- Overføre prøven ved hjelp av en slikkepott til et 50 mL plastrør som inneholder 20 mL 0,5% α-thioglycerol og 80% (w/v) fruktose og ruge det 12 h med mild skjelvende ved romtemperatur.
- Overføre prøven ved hjelp av en slikkepott til et 50 mL plastrør som inneholder 20 mL 0,5% α-thioglycerol og 100% (w/v) fruktose og ruge det 12 h med mild skjelvende ved romtemperatur.
- Overføre prøven ved hjelp av en slikkepott til et 50 mL plastrør som inneholder 20 mL 0,5% α-thioglycerol og 80.2% (w/w) fruktose og ruge det 24 h med mild skjelvende ved romtemperatur.
Merk: Håndtere prøven nøye for å holde deformasjoner så liten som mulig. Ikke ruge prøver lengre enn angitt, som prøver kan raskt bli ugjennomsiktig. - Bygge inn prøven i en tenkelig kammer fylt med 80.2% fruktose løsningen (figur 1B). Om nødvendig kan du fikse prøven ved å sette små biter av gummi lim rundt. Hvis kammeret er for dypt, sette en gulvplaten i kammeret før du plasserer prøvene.
- Plasser Petriskål med et glass lokk på tenkelig kammeret og sette vann i fatet og bildet med AC confocal eller to-fotonet mikroskopi med en vann-fordypning arbeide lang avstand mål. Eksitasjon bølgelengder og utslipp filtre er beskrevet i tabell 1. Om nødvendig kan du bruke en motorisert scene.
5. fjerne med antistoff flekker (AbScale metoden)
- Forberede reagenser som beskrevet i tabell 2.
- Overføre skiver med en slikkepott til et 5 mL plastrør som inneholder 4 mL Sca/eS0 løsning og ruge dem 12 h med mild rister på 37 ° C (figur 4B).
- Fjerne løsningen fra røret med en pipette legge 4 mL Sca/eA2 løsning og ruge sektorene for 36 h med mild rister på 37 ° C.
- Fjerne løsningen fra røret med en pipette legge 4 mL Sca/eB4 løsning og ruge sektorene for 24 timer med mild rister på 37 ° C.
- Fjerne løsningen fra røret med en pipette legge 4 mL Sca/eA2 løsning og ruge sektorene for 12 h med mild rister på 37 ° C.
- Fjerne løsningen fra røret med en pipette og Legg 4 mL PBS og ruge sektorene for 6 h med mild skjelvende ved romtemperatur.
- Fjern forsiktig sektorene til et 2 mL plastrør ved hjelp av en slikkepott.
- Inkuber med primære antistoffer (tabell 3) i 1 mL av AbScale løsning for 48-72 h på 37 ° C (figur 4C) med mild risting.
- Fjern forsiktig sektorene til et 5 mL plastrør ved hjelp av en slikkepott.
- Inkuber i 4 mL av AbScale løsning for 2t 2 ganger ved romtemperatur med mild risting.
- Fjern forsiktig sektorene til et 2 mL plastrør ved hjelp av en slikkepott.
- Inkuber med fluorescently-merket sekundære antistoffer (Tabell av materialer, 1: 100) i 1 mL av AbScale løsning for 48 h på 37 ° C med mild risting.
- Nøye fjerne skiver med en slikkepott til et 5 mL plastrør som inneholder 4 mL av AbScale løsningen og ruge sektorene for 6 h med mild skjelvende ved romtemperatur.
- Fjerne løsningen fra røret med en pipette og Legg 4 mL av AbScale løsningen og ruge sektorene for 2t 2 ganger med mild skjelvende ved romtemperatur.
- Fjern løsningen fra røret med en pipette og tilsett 4 mL 4% PFA og Inkuber skiver 1t med mild skjelvende ved romtemperatur.
- Fjerne løsningen fra røret med en pipette og Legg 4 mL PBS og ruge skiver 1t med mild skjelvende ved romtemperatur.
- Fjerne løsningen fra røret med en pipette legge 4 mL av Sca/eS4 løsningen og ruge sektorene for 12 h med mild rister på 37 ° C.
- Plasser mellomlegget på et glass lysbilde og plassere skiver i avstandsstykket og fordype skiver med Sca/eS4 løsning. Forsegle underlagsskive med et cover glass (figur 1 d).
- Sett vannet på dekselet glass og bildet med AC confocal eller to-fotonet mikroskopi med en vann-fordypning arbeide lang avstand mål. Om nødvendig kan du bruke en motorisert scene.
Merk: Se om de dype delene av prøven er merket tilsvarende til overfladiske deler å bekrefte fraværet av en betydelig merking skjevhet.
Merk: Gjennomtrengning av testet antistoffer er beskrevet i tabell 3.
6. celle posisjon besluttsomhet
- For hver posisjon i de skannede bildene, beregne korrelasjon verdier ved hjelp av et tredimensjonalt bilde filter14 (figur 5A-5D).
- Bestemme plasseringen av toppene correlation-verdi (figur 5 d).
- Undersøke bilder rundt toppene å finne cellene (figur 5E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi merket kortikale projeksjon neurons med uttrykk for tdTomato i Tlx3-grobunn/Ai9 transgene mus og visualisert sub cerebral projeksjon neurons ved å injisere den retrograd tracer CTB488 inn pons. Venstre halvkule av hjernen ble utsatt for metoden SeeDB og skannet med to-fotonet mikroskop utstyrt med en vann-fordypning arbeide lang avstand mål (25 X N.A. 1.1, arbeidsavstand 2 mm) og en motorisert scene. En stabel av 401 bilder (512 x 512 bildepunkter, pikselstørrelsen = 0,99 µm) på z-trinn = 2.8 µm ved hver 30 skanning stillinger ble innhentet. Cellen legemer de to celletyper var synlig over et bredt spekter av hjernen områder (figur 6) og optiske inndelinger viste periodiske microcolumns (figur 7A). I tillegg var hjernen av Crym-egfp mus (opprettholdt som heterozygotes med C57BL/6J bakgrunn) ryddet av metoden SeeDB og fotografert som ovenfor. Cellen legemer og apikale dendrites av EGFP-uttrykke sub cerebral projeksjon neurons var synlig i optisk deler (figur 7B).
Vi har også utført retrograd merking av sub cerebral projeksjon neurons i C57BL/6J mus ved hjelp av CTB488. Fast hjernen var skivet koronale med en tykkelse på ca 500 µm og utsatt for metoden AbScale å merke parvalbumin-uttrykke celler (Anti-parvalbumin, 1:1000; Anti-mus IgG-fluorescently merket,). Stable bilder (512 x 512 bildepunkter, pikselstørrelsen = 1,24 µm; z-trinn = 2.17 µm 268 bilder/stack) ble oppnådd med AC confocal mikroskopi med en vann-fordypning arbeide lang avstand mål (20 X, na 1.0, arbeidsavstand 2 mm). Sub cerebral projeksjon neurons og parvalbumin-uttrykke celler var begge i skiver (figur 7C).
Figur 1: Imaging kamre og avstandsstykker. (A) topp: håndlaget glassbunn Petriskål (høyre) og en Petriskål uten et glass bunn (til venstre). Bunnen: Et kammer (høyre) og gulvet plater (venstre) laget av silikon ark. (B) en mus halvkule utsatt for metoden SeeDB etter injeksjon av CTB555 i overlegen colliculus er satt inn i kammeret. Prøven er fast med et stykke av gjenbrukbare limet. (C) en objektglass (øverst) og en spacer laget av silikon arket med en tykkelse på 0,5 mm (nederst). (D) to koronale skiver av musen hjernen ble satt inn avstandsstykket og dekket med et cover glass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Tracer injeksjon. (A) A glass pipette koblet til Hamilton sprøyter gjennom et plastrør. (B) en mus er plassert på et stereotaxic instrument. Glass pipette beveges ca 60° posteriorly fra den loddrette aksen for injeksjon i overlegen colliculus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Trimming av hjernen prøver. (A) hele hjernen eksempel etter injeksjon av CTB555 i overlegen colliculus og fiksering. Den bregma og lambda ble merket med tungsten nåler (pilspisser). (B) samme prøven trimmet for å få en halvkule. Merk at tungsten nålene forblir (pilspisser). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Nedsenking av hjernen prøver i løsninger for SeeDB og AbScale metodene. (A) A halvkule eksempler på 0,5% α-thioglycerol og 20% (w/v) fruktose for metoden SeeDB. (B) koronale skiver i Sca/eA2 løsning for metoden AbScale. (C) koronale skiver på AbScale løsning som inneholder antistoffer for metoden AbScale. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bestemmelse av cellen posisjoner. Sub cerebral projeksjon neurons var benevnt ved å injisere den retrograd tracer CTB488 inn pons for 5 ukens av alderen. Venstre halvkule ble utsatt for metoden SeeDB og skannet med to-fotonet mikroskopi (512 x 512 bildepunkter, pikselstørrelsen = 0,99 µm; z-trinn = 2,8 µm, 601 bilder/stack). (A) A enkeltbilde. (B) fem bilder fra en enkelt bildestakk. (C) bildet filter brukes til å oppdage CTB-merket sub cerebral projeksjon neurons. (D) korrelasjon verdiene beregnes for fem bildene i (B) bruker filteret c. (E) eksempler på oppdaget sub cerebral projeksjon neurons. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: representant resultatene av storskala bildebehandling. Kortikale projeksjon neurons (grønn) ble merket av tdTomato-uttrykk i Tlx3-grobunn/Ai9 transgene mus, og sub cerebral projeksjon neurons (rosa) var visualisert ved å injisere den retrograd tracer CTB488 inn pons 7 uker alder. Venstre halvkule ble utsatt for metoden SeeDB og området 1250 µm til 2,690 µm lateral og-3,400 µm til 1,230 µm anterior til bregma ble skannet med to-fotonet mikroskopi. (A) ovenfra. Omtrentlige plasseringen av kortikale områder ble vist. (B-D) Skrå visning av CTB 488 fluorescens viser sub cerebral projeksjon neurons (B) tdTomato fluorescens kortikale projeksjon neurons (C) og det sammenslåtte bildet (D). A: fremre; P: bakre; M: mediale; D: Dorsal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: forstørring fotografier av representant resultater. (A) en optisk del av bildet i figur 6D. Bilde tykkelse = 20 µm. (B) EGFP-merket sub cerebral projeksjon neurons i en heterozygote Crym-egfp mus for 6 ukens av alderen. Bilde tykkelse = 30 µm. (C) Subcerebral projeksjon neurons (rosa) ble merket ved å injisere CTB488 inn pons C57BL/6J mus på postnatal dag 49 og parvalbumin-uttrykke celler (grønn) var visualisert ved metoden AbScale. Bilde tykkelse = 55 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Fluorophore | Ex. (nm) | Filtrere (nm) |
| EGFP | 910 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| tdTomato | 1000 | 578-633 (D605 / 55m, Chroma) |
| Alexa Fluor 488 | 750 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 555 | 750 | 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56, Semrock) |
| DAPI | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock) |
Tabell 1: Eksitasjon bølgelengder og filtre for to-fotonet mikroskopi.
Tabell 2: reagenser for metoden AbScale. Klikk her for å laste ned denne filen.
| Antigen | Vaksineres dyr | Produkt-IDen | Konsentrasjon | 3 mm blokk | 500 μm skive |
| NeuN | Mus | MAB377 | 1:500 | ND | + |
| NeuN | Kanin | ABN78 | 1:500 | ND | + |
| CTIP2 | Rotte | ab18465 | 1: 100 | L1-L6 | + |
| Statb2 | Mus | ab51502 | 1: 100 | - | - |
| GAD67 | Mus | MAB5406 | 1:200 | ND | + |
| GABA | Kanin | A2052 | 1: 100 | - | - |
| Parvalbumin | Mus | 235 | 1:1000 | ND | + |
| Parvalbumin | Geit | PV-Go-Af460 | 1: 100 | L1-L2/3 | + |
| Parvalbumin | Mus | P3088 | 1:1000 | ND | + |
| Parvalbumin | Kanin | ab11427 | 1:500 | ND | - |
| Somatostatin | Kanin | T-4103 | 1:1000 | L1-L2/3 | + |
| c-Fos | Kanin | PC38 | 1:1000 | ND | + |
Tabell 3: gjennomtrengning av testet antistoffer. Resultater for 3 mm tykt kvartaler vises som følger; L1-L6: gjennomtrengning i hele kortikale tykkelsen; L1-L2/3: penetrasjon til layer 2/3; -: ingen merking; ND: ikke bestemt. Resultater for 500 µm tykke skiver vises som følger; +: uniform merking; -: ingen eller begrenset merking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har presentert prosedyrer for å få store tredimensjonale bilder av celle type-spesifikk organisasjonen de store celletyper i musen neocortical lag 5. Sammenlignet med den konvensjonelle skive flekker, er metoden mer nyttig å bestemme tredimensjonale organiseringen av neocortex. Metoden gjør det mulig for image oppkjøpet fra den bredere og dypere hjernen regioner i forhold til den typiske i vivo 2-fotonet mikroskopi eller konvensjonelle AC confocal mikroskopi og, dermed kan tillate av neocortical mobilnettet organisasjon.
En kritisk skritt av metoden er antistoff penetrasjon. Et delsett av antistoffer viser dårlig gjennomtrengning i tykke prøver (tabell 3), og derfor kan ikke brukes for metoden AbScale. For å få jevn merking med antistoffer brukt i denne studien, var det nødvendig å skivet hjernen 500 µm. Bruk av mindre antistoff fragmenter, f.eks Fab eller F(ab') 2 fragmenter eller andre fjerne metoder21,22,23,24,25,26, 27,28 kan forbedre resultatene.
Antistoff antigen bindende spesifisitet er vanligvis preget i tynne vev skiver, men kan være forskjellige i tykk vev behandlet for clearing. Bestemme for antistoff spesifisitet, vi co merket vev med tracer injeksjon og markør genuttrykk hos transgene dyr og opptrådt blokkerer eksperimenter ved hjelp av antigen proteiner og peptider14. Disse prosedyrer og kontroll eksperimenter ved hjelp av mutant dyr mangler målet antigener bør være nyttig for å bekrefte spesifisitet av antistoffer.
En begrensning av metoden er at noen deformasjon av prøven er uunngåelig på grunn av håndtering av myke bulk prøver. Innhenting i vivo bilder før fiksering og bruker disse bildene som referanser hjelper deg for å løse slike deformasjoner.
De finnes prosedyrene ble utformet for analyse av neocortical lag 5. Siste analyser har identifisert mange molekylære markører som etiketten nevrale celletyper i andre lag4,5,6,7, og anvendelse av disse beslutningstakere til stede metoden kan aktivere Identifikasjon av viktige mobilnettet organisasjonen i andre lag. I tillegg bør det være mulig å utføre lignende analyser i hjernen regioner enn neocortex og organer enn hjernen, for å undersøke om det finnes en presis mobilnettet organisasjon som ligner microcolumns.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Atsushi Miyawaki og Hiroshi Hama for deres råd om AbScale eksperimentene, Charles Yokoyama for redigering av manuskriptet, Eriko Ohshima og Miyuki Kishino for deres kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra RIKEN th og Grants-in-Aid for vitenskapelig forskning fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) i Japan for å th (nyskapende områder "Mesoskopisk Neurocircuitry", 22115004) og SS (25890023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
