Summary
여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.
Abstract
포유류 피 질 흥분 성의 억제 신경, 각각 특정 electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 종류의 구성 그리고 vivo에서 기능, 하지만 그들의 기본 기능과 해 부 조직 세포에서 네트워크 규모를 제대로 이해 하 고 있습니다. 여기 우리는 대뇌 피 질의 세포 조직의 조사에 대 한 두뇌의 큰 영역에 걸쳐 붙일 표시 된 신경 세포의 3 차원 영상에 대 한 메서드를 설명합니다. 특정 유형의 신경 형광 퇴행 성 신경 추적기의 주입 또는 유전자 변형 쥐에 형광 단백질의 식에 의해 표시 됩니다. 블록 뇌 샘플, 예, 반구, 고정 후 준비, 청소 방법, 조직으로 투명 하 게 만들 있으며 형광 immunolabeling는 특정 종류의 세포를 받게. 큰 지역 대형 작업 거리 목표 및 자동화 한 단계 또는 두 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 검색 합니다. 이 메서드는 마우스 피 질에는 셀 형식 관련 microcolumn 기능 모듈의 주기적인 조직을 해결할 수 있습니다. 절차는 다른 복잡 한 조직과 다양 한 뇌 영역에 3 차원 세포 구조의 연구에 대 한 유용할 수 있습니다.
Introduction
포유류 피 질 세포 유형, 각각 특정 유전자 표현 패턴, electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 수의 구성 및 기능을 vivo에서 1,2 3,,45,,67. 이러한 세포 유형 반복 구조로 구성 됩니다 여부 되었습니다 분명. 시각적인 방향 열과 somatosensory 배럴을 포함 하 여 대뇌 피 질의 열 구조, 반복 하지만 그들의 세포 조직 남아 불분명8,9. 이들은 특정 대뇌 피 질의 영역에 존재 하 고 뇌 전체 시스템을 않습니다.
Neocortical 계층 5, 뉴런의 대다수는 4 개의 주요 유형으로 분류 됩니다. 주요 유형의 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 흥분 성의 뉴런 프로젝트 폰, 척수, 및 우량한 colliculus 바꾸어 대상에 축 삭 그리고, 따라서,10주요 외피 출력 경로 나타냅니다. 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런 흥분 성의 뉴런의 다른 주요 유형10피 질 자극. 금지 신경 또한 두 개의 주요 클래스를 포함: parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 세포11.
최근 분석 나타냅니다 4 셀 유형 반복된 구조12,,1314로 구성 됩니다. 하위 대뇌 프로젝션 뉴런12,,1314 및 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런14 직경 1-2 셀의 셀 타입 특정 microcolumns로 구성. Parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 셀 정렬 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 microcolumns로 아니라 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런14microcolumns. Microcolumns 스스로 형태는 6 각형 격자 배열14 와 마우스 뇌12,14 와 언어 somatosensory, 시각과 모터 분야를 포함 한 여러 피 질 지역에 있는지를 주기적으로 정렬 인간의 뇌는13의 지역입니다. 개별 microcolumn에 신경 동기화 된 활동을 전시 하 고 비슷한 감각 반응이14. 이러한 관측 레이어 5 셀 유형 반복 기능 모듈의 첫 번째 알려진된 뇌 전체 조직을 나타내는 microcolumn 격자 구조로 구성 나타냅니다.
Microcolumns 약 10 µ m의 반지름을가지고 있고 약 40 µ m의 공간 주기. 또한, microcolumns의 방향을 피14에서 그들의 위치에 따라 그들의 변화와 꼭대기 dendrites 평행 하다. 따라서, microcolumn 시스템은 마이크로 미터의 몇 수만의 전형적인 두께가 기존의 대뇌 피 질의 조각을 사용 하 여 분석 하기가 어렵습니다. 또한, 주기 분석 3 차원 데이터는 다양 한 뇌 영역, 그리고, 그러므로, confocal 현미경 검사 법의 일반적인 이미징 영역에서에서 또는 vivo에서 2 광자 영상 너무 좁고입니다.
최근, 기술 두꺼운 조직15,16를 개발 되었습니다. 여기는 microcolumn 시스템을 구성 하는 주요 셀 형식 마우스 neocortical 레이어 5에서에서의 대규모, 3 차원 이미지를 얻기 위해 이러한 방법을 응용 프로그램에 설명 합니다. Subcerebral 프로젝션 뉴런 역행 표시 또는 Crym egfp 유전자 변형 쥐12, 그리고 대뇌 피 질의 프로젝션 뉴런에는 레이블로 역행에 향상 된 녹색 형광 단백질의 식으로 표시 됩니다. 라벨 또는 Tlx3-cre/Ai9 마우스17에 tdTomato 식으로. Parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 셀 immunohistochemistry에 의해 표시 됩니다. (깊은 뇌 참조) SeeDB 방법19 다른 실험 사용 된다 실험, 얼룩이 지는 항 체 (항 체 규모 S) AbScale 방법18 사용 됩니다. 이러한 방법은 기존의 이미징 방법의 위에서 언급 한 어려움을 극복 하 고 레이어 514의 정확한 세포 조직 공개.
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Protocol
모든 실험 절차 RIKEN와 코 동물 실험 위원회 RIKEN 유전자 재조합 실험 안전 위원회에 의해 승인 되었고 RIKEN 뇌 과학의 동물 시설 기관 지침에 따라 수행 연구소입니다.
1입니다. 이미징 챔버의 준비
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영상 실19
- 실리콘 고무 시트를 사용 하 여 다양 한 두께의 약 5 m m와 바닥 플레이트의 두께 챔버를 준비 합니다. 또한, 접시와 유리 하단 (그림 1A) 없이 준비 합니다.
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스페이서를 슬라이스
- 스페이서 두께 0.5 m m (그림 1C)의 실리콘 고무 시트를 사용 하 여 샘플을 준비 합니다.
2. 추적 프로그램 삽입
참고: 폰 (2.1) 또는 우량한 colliculus (2.2)에 주사를 합니다. 우량한 colliculus에 주입 하는 동안 시각 및 모터 지역 등 다양 한 뇌 영역에 폰 레이블 하위 대뇌 프로젝션 뉴런에 주입 시각적 영역에 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 라벨. 붙일 레이블 콜레라 독 소 단위 B. 대신 식 염 수 주입 제어 실험에 대 한 멸 균 상태 유지에 대 한 소독된 장비 및 에탄올으로 청소 플라스틱 장갑을 사용 합니다.
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성인 쥐의 주사는 폰으로 확인 합니다.
- 붙일 레이블 콜레라 독 소 단위 B의 1 µ L를 그리기 (25 µ g / µ L PBS에) 26 G 해밀턴 주사기로.
- 주사기에는 인젝터 펌프를 배치 합니다.
- Stereotaxic 악기에 퓰 레이 터의 도구 홀더에 주사기와 펌프를 배치 합니다. 조작자 12 ° 수직 축에서 뒤로 기울입니다.
- Intraperitoneally 나트륨 pentobarbital을 주입 하 여 남성 또는 여성 성인 마우스 (C57BL/6J 또는 Tlx3-cre/Ai9) anesthetize (60 밀리 그램/kg 체중) 또는 isoflurane (2-3%)을 투여 하 여. 마우스 마우스 완전히 취 나타내는 집게와 꼬리 슬쩍가 때 응답 하 게 될 때까지 기다립니다.
- Stereotaxic 악기에 마우스를 놓습니다.
- 감염 방지 및 bregma 및 람다 표시 되도록 두 피의 10 m m를 잘라 면도날을 사용 하 여 머리를 조심 스럽게 제거. 1 %lidocaine 피 펫을 사용 하 여 0.1 mL를 관리 합니다. 있도록 bregma 및 람다 동일한 z 레벨 stereotaxic 악기에 떠 벌이의 수직 위치를 조정 하 여 머리의 각도 설정 합니다.
- 주사기의 팁은 bregma 가까이 stereotaxic 악기에 슬라이딩 하 여 조작자의 위치를 조정 하 고 조작자의 위치를 기록 합니다. 조작자에 도구 홀더를 이동 하 여 주사기를 철회.
- 조작자 이동 5.4 m m 뒤로 및 0.4 m m 옆. 팁은 두개골에 진입점 가까이 있도록 주사기를 사전. 주사기를 철회 하 고 진입점을 표시 합니다.
- 표시 된 위치에서 약 1 m m의 직경을 가진 구멍을 드릴 합니다.
- 팁 깊이 6.9 m m 보다는 bregma에 측정 하는 구멍을 통해 주사기 끝을 삽입.
- 추적기는 펌프를 사용 하 여 0.2 µ L/분의 1 µ L을 주입.
- 두뇌에서 주사기를 제거 합니다.
- 필요한 경우 microfibrillar hemostat 및 인스턴트 접착제의 작은 파편으로 노출 된 뇌를 커버.
- 감염을 방지 하 고 두 피를 봉합 하는 피 펫 제공 하는 염 분을 사용 하 여 노출 된 뇌를 씻어.
- Stereotaxic 악기에서 마우스를 제거 합니다. 일반적으로 1 시간에 30 ˚C에 인큐베이터에 마 취에서 회복 하기 위해 마우스를 허용 합니다. 두지 마십시오 마우스 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 완전히 복구 되었습니다 후에 다른 동물의 회사를 마우스를 반환 합니다.
- 3-7 일에 대 한 마우스를 유지.
-
성인 쥐의 우량한 colliculus에 주사를 확인 합니다.
- 팁 직경 30-50 µ m의 유리 피 펫을 준비 합니다.
- 플라스틱 튜브 (그림 2A)를 통해 해밀턴 주사기를 유리 피 펫을 연결 합니다.
- 파라핀 액체 유리 피 펫, 플라스틱 튜브, 그리고 해밀턴 주사기를 채우십시오.
- 주사기에는 인젝터 펌프를 배치 합니다.
- 조작자에 유리 피 펫을 놓고 조작 수직 축 (그림 2B)에서 뒤로 60 ° 기울기.
- 2.1.4–2.1.9을 수행 합니다. 조작자의 위치는 1.4 m m 후부, 람다를 0.5 m m 옆.
- 두개골에 작은 플라스틱 파라핀 영화 장소 다음 그것에 추적 솔루션의 약 1 µ L를 넣어. 신속 하 게 사전 유리 피 펫 및 추적 솔루션의 적어도 0.5 µ L로 그것을 채우십시오.
- 팁 깊이 뇌 표면에서 3.0 m m 유리 피 펫을 삽입 합니다.
- 추적기는 펌프를 사용 하 여 0.2 µ L/분의 0.5 µ L을 주입.
- 두뇌에서 유리 피 펫을 제거 합니다.
- 2.1.13–2.1.16을 수행 합니다.
3. 고정 및 트리밍
- Sodium pentobarbital (60 밀리 그램/kg 체중) 마우스 (C57BL/6J 또는 Tlx3-cre/Ai9, 또는 2 단계에서 설명한 대로 추적 프로그램 주입 없이 intraperitoneally 주입. 마우스 마우스 완전히 취 나타내는 집게와 꼬리 슬쩍가 때 응답 하 게 될 때까지 기다립니다.
- 0.9% 식 염 수와 마우스 transcardially20 perfusing에 의해 마우스를 고통 없이 안락사.
- Perfusing 여 마우스20 수정 4 %paraformaldehyde (PFA) 0.1 M 인산 버퍼 (pH 7.5).
-
설명된20으로 두개골 폭로 위를 사용 하 여 두 피를 잘라.
- 가 위를 사용 하 여 노출 된 두개골의 중간을 잘라. 집게를 사용 하 여 두개골을 제거 합니다.
- 람다와 bregma의 위치를 표시 하는 것이 필요한 경우 먼저 두개골의 한 반구를 제거 합니다. 뇌에 남아 있는 두개골에 람다와 bregma의 위치에 두뇌에 얇은 텅스텐 바늘을 삽입 한 다음 나머지 해골을 제거.
참고: 뇌 수에 저장 PBS 4 ˚C에서.
-
항 체 억제 뉴런의 얼룩을 수행 하려면 두뇌 샘플 조각으로 잘라.
- 장소는 vibratome에 뇌 샘플입니다.
- 실 온에서 PBS에 두께가 500 µ m까지 조각을 삭감 하 고 단계 5 (AbScale 방법)를 진행.
- 항 체 얼룩이 필요 하지 않은 경우, 트림 뇌 샘플을 차단 (최대 3 밀리미터 두꺼운) 면도날 (그림 3)를 사용 하 여 및 단계 4 (SeeDB 메서드)를 수행 하십시오.
참고: 두뇌 저장할 수 있습니다 PBS에 4 ° C에서 절단 또는 트리밍 후. SeeDB 메서드를 사용 하면 항 체 염색 법은 불필요 한 때 AbScale 방법 보다 적은 시간을 요구 하기 때문에 하는 것이 좋습니다.
4. 항 체 (SeeDB 메서드)를 얼룩 없이 지우기
- 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 20% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.
- 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 40% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.
- 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 60% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.
- 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 80% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 12 h에 품 어.
- 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 100% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 12 h에 품 어.
- 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 80.2% (w/w)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 24 h에 대 한 그것을 품 어.
참고: 샘플 변형 가능한 작게 유지을 신중 하 게 처리 합니다. 샘플 신속 하 게 불투명 될 수 있는 이상, 샘플을 품 어 하지 마십시오. - 80.2%과 당 솔루션 (그림 1B)으로 가득 이미징 약 실에 샘플을 포함 합니다. 필요한 경우 주변 고무 접착제의 작은 조각을 넣어 샘플을 수정. 챔버 너무 깊은 경우 샘플을 배치 하기 전에 챔버에는 바닥에 접시를 넣어.
- 이미징 챔버에 유리 커버와 함께 페 트리 접시를 놓고 접시, 물 침수 긴 작동 거리 목표와 또는 2 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지에 물을 넣어. 여기 파장 및 방출 필터 표 1에서 설명 합니다. 필요한 경우, 전동된 스테이지를 사용 합니다.
5. 항 체 (AbScale 방법) 얼룩을 지우기
- 표 2에 설명 된 대로 시 약을 준비 합니다.
- Sca/eS0 솔루션의 4 mL를 포함 하는 5 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 분할 영역을 전송 하 고 37 ° C (그림 4B)에서 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 그들을 품 어.
- 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/eA2 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 36 h에 대 한 슬라이스를 품 어
- 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 및 Sca/eB4 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 24 h에 대 한 슬라이스를 품 어
- 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/eA2 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 슬라이스를 품 어
- 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 추가 4 mL PBS의 실 온에서 부드러운 떨고와 6 h에 대 한 슬라이스를 품 어.
- 조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 2 mL 플라스틱 튜브에 조각.
- AbScale 솔루션 부드러운 떨고와 37 ° C (그림 4C)에서 48-72 시간의 1 mL에 1 차 항 체 (표 3)와 품 어.
- 조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 5 mL 플라스틱 튜브에 조각.
- AbScale 솔루션 2 번 부드러운 진동으로 실 온에서 2 h 4 mL에 품 어.
- 조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 2 mL 플라스틱 튜브에 조각.
- 붙일 표시 2 차 항 체 (테이블의 자료, 1: 100) AbScale 솔루션 부드러운 떨고와 37 ° C에서 48 h의 1 mL에 함께 품 어.
- 조심 스럽게 AbScale 솔루션의 4 mL를 포함 하는 5 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 분할 영역을 제거 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 6 h에 대 한 슬라이스를 품 어.
- 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 AbScale 솔루션의 4 개 mL를 추가 2 h 2 시간 실 온에서 부드러운 흔들어 대 한 슬라이스를 품 어.
- 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 4%의 4 개 mL를 추가 PFA 고 실 온에서 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 슬라이스를 품 어.
- 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 추가 4 mL PBS의 실 온에서 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 슬라이스를 품 어.
- 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/e s 4 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 슬라이스를 품 어
- 유리 슬라이드에는 스페이서를 배치 하 고 슬라이스는 공백에 놓고 Sca/e s 4 솔루션 분할 영역을 담가. 커버 유리 (그림 1D)와 공백 인감.
- 커버 글라스와 물 침수 긴 작동 거리 목표와 또는 2 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지에 물을 넣어. 필요한 경우, 전동된 스테이지를 사용 합니다.
참고: 중요 한 라벨 바이어스의 부재를 확인 표면 부분에는 샘플의 깊은 부분 마찬가지로 표시 여부를 확인 하십시오.
참고: 테스트 항 체의 침투는 표 3에 설명 되어 있습니다.
6. 셀 위치 결정
- 스캔된 된 이미지에서 각 위치에 대 한 3 차원 이미지 필터14 (그림 5A-5D)를 사용 하 여 상관 관계 값을 계산 합니다.
- 상관 관계 값 (그림 5D)의 봉우리의 위치를 결정 합니다.
- 찾을 셀 (그림 5E) 봉우리 이미지 조사.
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Representative Results
우리 /Ai9 유전자 변형 마우스 Tlx3-cre에 tdTomato의 식으로 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런을 표시 하 고 하위 대뇌 프로젝션 뉴런은 폰으로 역행 추적 프로그램 CTB488를 주입 하 여 시각. 두뇌의 왼쪽된 반구 SeeDB 메서드를 복종 되었다 및 물 침수 긴 작동 거리 목표를 갖춘 2 광자 현미경을 사용 하 여 스캔 (25 X, N.A. 1.1 작동 거리 2 m m)와 전동된 스테이지. 401 이미지의 스택 (512 x 512 픽셀; 픽셀 크기 = 0.99 µ m) z-단계 = 2.8 µ m 각 30 검색 위치에서 얻은. 두 종류의 세포 세포 시체 뇌 영역 (그림 6), 그리고 정기 microcolumns (그림 7A)를 보여 광학 섹션의 넓은 범위에 보였다. 또한, Crym egfp 마우스 (C57BL/6J 배경 heterozygotes 유지)의 두뇌는 SeeDB 방법에 의해 삭제 되었고 위에서 몇 군데. 셀 바디와 EGFP 표현 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 꼭대기 dendrites 광학 섹션 (그림 7B)에 볼 수 있었다.
우리는 또한 역행 C57BL/6J 쥐 CTB488를 사용 하 여 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 라벨을 수행 합니다. 고정된 뇌 약 500 µ m의 두께와 코로나 조각으로 잘라 되었고 AbScale 메서드 parvalbumin 표현 셀 (안티-parvalbumin, 1:1000;을 대상 반대로 마우스 IgG 붙일 레이블이)입니다. 이미지 스택 (512 x 512 픽셀, 픽셀 크기 = 1.24 µ m; z 단계 = 2.17 µ m, 268 이미지/스택) 물 침수 긴 작동 거리 목표와 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 가져온 (20 X, N.A. 1.0, 작동 거리 2 m m). 하위 대뇌 프로젝션 뉴런을 표현 하는 parvalbumin 세포 둘 다 조각 (그림 ℃)에 표시 했다.
그림 1: 챔버와 스페이서 이미지. (A) 가기: 수 제 유리 바닥 페 트리 접시 (오른쪽)와 페 트리 접시 유리 하단 (왼쪽) 없이. 하단: 챔버 (오른쪽)와 바닥 플레이트 (왼쪽) 실리콘 시트 했다. (B) 마우스 반구 우량한 colliculus CTB555 주입 챔버로 설정 후 SeeDB 메서드를 받게. 샘플 재사용 접착제의 조각으로 고정 됩니다. (C) 유리 슬라이드 (위)와 두께 0.5 m m (아래)와 실리콘 시트를 만든다. (D) 두 코로나 조각 마우스 뇌의 공백 요소에 설정 하 고 커버 유리로 덮여 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 추적 프로그램 삽입. (A) A 유리 피 펫 플라스틱 튜브를 통해 해밀턴 주사기에 연결 (B) 마우스 stereotaxic 악기에 배치 됩니다. 유리 피 펫을 기울이면 우량한 colliculus 주입에 대 한 수직 축에서 뒤로 약 60 °. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 뇌 샘플의 트리밍. (A) 우량한 colliculus 고정으로 CTB555의 주입 후 뇌 샘플. Bregma와 람다 텅스텐 바늘 (화살촉)로 표시 했다. (B) 같은 샘플 반구를 손질 합니다. 텅스텐 바늘 (화살촉) 유지 하는 참고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: SeeDB 및 AbScale 메서드에 대 한 솔루션에서 뇌 샘플의 침수. (A) A 반구 샘플에 0.5% α-thioglycerol 및 SeeDB 메서드에 대 한과 당 20% (w/v). (B) 코로나 조각 AbScale 메서드에 대 한 Sca/eA2 솔루션에. (C) 코로나 조각 AbScale 방법에 대 한 항 체를 포함 하는 AbScale 솔루션에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 셀 위치의 결정. 하위 대뇌 프로젝션 뉴런은 나이의 5 주에는 폰에 역행 추적 프로그램 CTB488를 주입 하 여 분류 했다. 왼쪽된 반구 SeeDB 메서드를 받게 되었고 두 광자 현미경으로 검사 (512 x 512 픽셀, 픽셀 크기 = 0.99 µ m; z 단계 = 2.8 µ m, 601 이미지/스택). (A)는 단일 이미지입니다. 단일 이미지 스택에서 이미지를 (B) 5. (C) 이미지 필터 CTB 표시 된 하위 대뇌 프로젝션 뉴런을 감지 하는 데 사용. (D) (C)에서 필터를 사용 하 여 5 개의 이미지 (B)에 대 한 상관 관계 값 계산. 검색 된 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 (E) 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 대규모 화상의 대표적인 결과. 대뇌 피 질의 프로젝션 뉴런 (녹색) tdTomato- Tlx3-cre/Ai9 유전자 변형 마우스에 있는 식으로 표시 했다 그리고 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 (마젠타)의 7 주에는 폰에 역행 추적 프로그램 CTB488를 주입 하 여 구상 했다 나 이입니다. 좌 반구는 SeeDB 메서드를 복종 되었다 그리고 2,690 µ m 옆에 지역 1, 250 µ m 및-3,400 µ m 1230 µ m는 bregma에 앞쪽에 두 광자 현미경을 사용 하 여 스캔 했다. (A) 최고 볼 수 있습니다. 대뇌 피 질의 영역의 대략적인 위치를 표시 했다. (DB-) CTB 488 형광 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 (B), 보여주는 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런 (C), (D) 병합 된 이미지를 보여주는 tdTomato 형광의 간접 보기. A: 앞쪽; P: 후부; M: 중간; D: 등입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 대표 결과의 높은 확대 사진. (A) 그림 6D에 이미지의 광학 섹션. 이미지 두께 = 20 µ m. (B) 나이의 6 주에 heterozygous Crym egfp 마우스에서 EGFP 표시 된 하위 대뇌 프로젝션 뉴런. 두께 이미지 = 30 µ m. (C) Subcerebral 프로젝션 뉴런 (마젠타) 49, 및 parvalbumin 표현 셀 (녹색) AbScale 방법으로 시각화 했다 출생 후 하루에서 C57BL/6J 쥐의 폰으로 CTB488를 주입 하 여 분류 했다. 두께 이미지 = 55 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| Fluorophore | 예 (nm). | 필터 (nm) |
| EGFP | 910 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| tdTomato | 1000 | 578-633 (D605/55 m, 크로마) |
| 알 렉 사 Fluor 488 | 750 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| 알 렉 사 Fluor 555 | 750 | 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock) |
| 알 렉 사 Fluor 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56, Semrock) |
| DAPI | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock) |
표 1: 여기 파장 고 두 광자 현미경 검사 법에 대 한 필터.
표 2: AbScale 방법에 대 한 시 약. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| 항 원 | 예방 접종된 동물 | 제품 ID | 농도 | 3 m m 블록 | 500 μ m 조각 |
| NeuN | 마우스 | MAB377 | 1: 500 | ND | + |
| NeuN | 토끼 | ABN78 | 1: 500 | ND | + |
| CTIP2 | 쥐 | ab18465 | 1: 100 | L1-L6 | + |
| Statb2 | 마우스 | ab51502 | 1: 100 | - | - |
| GAD67 | 마우스 | MAB5406 | 1: 200 | ND | + |
| GABA | 토끼 | A2052 | 1: 100 | - | - |
| Parvalbumin | 마우스 | 235 | 1:1000 | ND | + |
| Parvalbumin | 염소 | PV-가 서-Af460 | 1: 100 | L1-L2/3 | + |
| Parvalbumin | 마우스 | P3088 | 1:1000 | ND | + |
| Parvalbumin | 토끼 | ab11427 | 1: 500 | ND | - |
| Somatostatin | 토끼 | T-4103 | 1:1000 | L1-L2/3 | + |
| c-Fos | 토끼 | PC38 | 1:1000 | ND | + |
표 3: 테스트 항 체의 침투. 3 m m 두꺼운 블록에 대 한 결과 표시 다음과 같습니다. 전체 피 질 두께;으로 L1-L6: 침투 계층 2/3;까지 L1-L2/3: 침투 -: 라벨; ND: 결정 되지. 500 µ m 두께 조각에 대 한 결과 표시 다음과 같습니다. +: 균일 한 라벨; -: 없음 또는 라벨.
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Discussion
우리는 마우스 neocortical 레이어 5에에서 주요 세포 유형의 셀 형식 관련 조직의 대규모 3 차원 이미지를 얻기 위해 절차를 제시. 기존의 조각 얼룩에 비해, 메서드는 결정 하는 피 질의 3 차원 조직에 더 유용 합니다. 메서드를 사용 하는 더 넓은에서 이미지 수집 그리고 깊은 두뇌 지구 2 광자 현미경 전형적인 vivo에서 또는 전통적인 confocal 현미경 검사 법에 비해, 따라서 neocortical 휴대의 포괄적인 분석을 허용할 수 있다 조직입니다.
방법의 중요 한 단계는 항 체 침투 이다. 항 체의 하위 집합으로 두꺼운 표본 (표 3), 불 쌍 한 침투를 보여줍니다 그리고, 따라서, AbScale 방법에 사용할 수 없습니다. 이 연구에 사용 된 항 체와 균일 한 라벨을 얻기 위해 500 µ m 조각으로 두뇌를 잘라 하는 데 필요한 했다. 작은 항 체 파편, 예를 들어, 팹 F(ab') 2 조각, 또는 다른 방법21,22,23,,2425,26, 비운의 사용 , 2728 결과 향상 시킬 수 있습니다.
항 체 항 원 묶는 특이성은 일반적으로 얇은 조직 조각에서 특징만 처리 될 수 있습니다 다른 두꺼운 조직에서 지우기에 대 한. 항 체 특이성에 대 한 제어, 공동 조직 추적 프로그램 주입 및 마커 유전자 발현 유전자 변형 동물에서을 표시 하 고 또한 항 원 단백질 및 펩 티 드14를 사용 하 여 차단 실험을 수행. 이러한 절차와 제어 실험 대상 항 부족 돌연변이 동물을 사용 하는 항 체의 특이성을 확인 하는 데 유용 해야 합니다.
방법의 한계는 시료의 일부 변형 부드러운 대량 샘플의 처리 때문에 불가피 하다입니다. Vivo에서 고정 및 참조 수정 같은 개 악 하는 데 도움이 됩니다 이러한 이미지를 사용 하 여 이전 이미지를 얻는.
현재 절차 neocortical 레이어 5의 분석을 위해 설계 되었습니다. 최근 분석 많은 분자 마커 다른 레이어4,5,,67, 그 레이블 신경 세포 유형 식별 및 현재 메서드에 이러한 제조 업체의 응용 프로그램 사용 다른 계층에 중요 한 세포 조직의 식별입니다. 또한, 그것은 정확한 세포 조직 microcolumns와 유사한 존재 인지를 조사 하는 뇌 이외의 장기에는 피 질 외 뇌 지역에 유사한 분석을 수행 가능 해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사 미 야와 키 아츠 시와 히로시 하 마 원고, 편집에 대 한 찰스 요코야마 AbScale 실험에 그들의 조언을 에리코 Ohshima 및 그들의 기술 지원에 대 한 미유키 Kishino. 이 작품은 과학적 연구에서 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT) 일본의 남에 대 한 남 및 연구비 RIKEN에서 연구 자금에 의해 지원 되었다 (혁신적인 지역 "생체 Neurocircuitry"; 22115004)와 S.S. (25890023)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
References
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