Summary
Her beskriver vi en procedure for væv clearing, fluorescerende mærkning og storstilet billeddannelse af musen hjernevæv, som dermed giver mulighed for visualisering af den tredimensionale organisation af celletyper i neocortex.
Abstract
Pattedyr neocortex er sammensat af mange typer af excitatoriske og hæmmende neuroner, hver med specifikke elektrofysiologiske og biokemiske egenskaber, synaptiske forbindelser, og i vivo fungerer, men deres grundlæggende anatomiske og funktionelle organisation fra cellular netværk målestok er dårligt forstået. Her beskriver vi en metode for den tre-dimensionelle billeddannelse af fluorescently mærket neuroner på tværs af store områder af hjernen for undersøgelsen af de kortikale cellulære organisation. Specifikke typer for neuroner er mærket af injektion af fluorescerende retrograd neuronal røbestoffer eller udtryk for fluorescerende proteiner i Transgene mus. Blok hjernen prøver, f.eks. en halvkugle, er udarbejdet efter fiksering, lavet gennemsigtig med væv clearing metoder og underkastes fluorescerende immunolabeling af de specifikke celletyper. Store områder er scannet ved hjælp af Konfokal eller to-foton mikroskoper udstyret med store arbejde afstand mål og motoriseret faser. Denne metode kan løse den periodiske organisation af celle typespecifikke microcolumn funktionelle moduler i mus neocortex. Proceduren kan være nyttig for studiet af tre-dimensionelle cellulære arkitektur i de forskellige hjerne områder og andre komplekse væv.
Introduction
Pattedyr neocortex er sammensat af en lang række celletyper, hver med bestemte gen expression mønstre, elektrofysiologiske og biokemiske egenskaber, synaptiske forbindelser, og i vivo funktioner1,2 ,3,4,5,6,7. Hvorvidt disse celletyper er organiseret i gentagne strukturer har været uklare. Kortikale kolonner, herunder visuel orientering kolonner og somatosensoriske Tønder, har gentaget strukturer, men deres cellulære organisation forbliver uklart8,9. Disse er til stede i de specifikke kortikale områder og er ikke en hjerne-dækkende system.
I neocortical lag 5, er det store flertal af neuroner klassificeret i fire hovedtyper. En større type af excitatoriske neuroner, sub cerebral projektion neuroner, projekter axoner til subkortikale mål herunder pons, rygmarven og overlegen colliculus og derfor repræsenterer store kortikale output vej10. Cortical fremskrivning neuroner, en anden store type excitatoriske neuroner, innerverer cortex10. Hæmmende neuroner også indeholder to store klasser: parvalbumin-udtrykker og somatostatin-udtrykke celler11.
De seneste analyser viser, at de fire celletyper er organiseret i gentagne strukturer12,13,14. Både sub cerebral projektion neuroner12,13,14 og cortical fremskrivning neuroner14 organisere i celletype specifikke microcolumns med en diameter på 1-2 celler. Parvalbumin-udtryk og somatostatin-udtrykke celler Juster specifikt med microcolumns af sub cerebral projektion neuroner, men ikke med microcolumns af cortical fremskrivning neuroner14. Microcolumns sig justere med jævne mellemrum til at danne en sekskantet gittermaster array14 og er til stede i flere kortikale områder herunder visuel, somatosensoriske og motoriske områder i mus hjernen12,14 og sprog områder af menneskets hjerne13. Neuroner i den enkelte microcolumn udviser synkroniseret aktivitet og har lignende sensoriske svar14. Disse observationer viser at lag 5 celletyper organisere i et microcolumn gitterstruktur der repræsenterer den første kendte hjerne-dækkende organisation for at gentage funktionelle moduler.
Microcolumns har en radius på ca. 10 µm og har en rumlig hyppighed af ca 40 µm. Derudover er orienteringen af microcolumns parallel til deres apikale dendritter og skifter, afhængigt af deres placering i cortex14. Microcolumn systemet er derfor vanskeligt at analysere ved hjælp af konventionelle kortikale skiver med en typisk tykkelse på et par snese mikrometer. Derudover analyse af periodicitet kræver tre-dimensionelle data fra en bred vifte af områder i hjernen, og derfor typisk imaging området Konfokal mikroskopi eller i vivo 2-foton imaging er for snæver.
For nylig, teknikker er blevet udviklet for at fjerne tykt væv15,16. Her beskriver vi anvendelsen af disse metoder til at opnå store, tre-dimensionelle billeder af de store celletyper i mus neocortical lag 5, der udgør microcolumn systemet. Subcerebral projektion neuroner er mærket af retrograd mærkningsbestemmelserne eller udtryk for den forbedrede grøn fluorescerende protein i Crym-egfp Transgene mus12og cortical fremskrivning neuroner er mærket af enten den retrograd mærkning eller af tdTomato udtrykket i Tlx3-cre/Ai9 mus17. Parvalbumin-udtryk og somatostatin-udtrykke celler er mærket af Immunhistokemi. (Antistof skala S) AbScale metode18 bruges til antistof farvning eksperimenter, mens (Se Deep Brain) SeeDB metode19 bruges til andre eksperimenter. Disse metoder overvinde de ovennævnte vanskeligheder af de konventionelle Billeddannende metoder og afsløre den nøjagtige cellulære organisation af lag 514.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af RIKEN Wako dyr eksperimenter udvalget og RIKEN genetiske rekombinant eksperiment sikkerhedsudvalg og udført efter de institutionelle retningslinjer for animalske faciliteter, RIKEN hjernen videnskab Institut.
1. forberedelse af Imaging kamre
-
Imaging afdeling19
- Brug af silikone gummi ark, forberede et kammer med en tykkelse på ca 5 mm og gulv plader af forskellige tykkelser. Også, forberede petriskåle med og uden et glas bund (figur 1A).
-
Skive spacer
- Forberede afstandsstykker at afholde prøver, ved hjælp af silikone gummi ark med en tykkelse på 0,5 mm (figur 1 c).
2. tracer injektion
Bemærk: Gøre injektioner i pons (2.1) eller superior colliculus (2.2). Injektion i pons etiket sub cerebral projektion neuroner i en bred hjernen regionen inklusive de visuelle og motoriske områder, mens indsprøjtning i superior colliculus etiketter sub cerebral projektion neuroner i den visuelle område. For kontrol eksperimenter, indsprøjte saltvand i stedet for at fluorescently mærket kolera toksin subunit B. Brug steriliseret udstyr og plastikhandsker rengøres med ethanol til vedligeholdelse i sterile tilstand.
-
Gøre injektioner i pons af voksen mus.
- Trække 1 µL af fluorescently mærket kolera toksin subunit B (25 µg/µL i PBS) ind i en 26 G Hamilton sprøjte.
- Placere en injektor pumpen på sprøjten.
- Placer sprøjte og pumpe på værktøj indehaveren af en manipulator placeret på et stereotaxisk instrument. Vippe manipulator 12° posteriort fra den lodrette akse.
- Bedøver en mandlig eller kvindelig voksne mus (C57BL/6J eller Tlx3-cre/Ai9) ved at indsprøjte natrium pentobarbital intraperitoneal (60 mg/kg kropsvægt) eller ved at administrere isofluran (2-3%). Vent, indtil musen gør ingen svar når halen er klemt med pincet, der angiver, at musen er fuldt bedøvede.
- Placer musen på den stereotaxisk instrument.
- Fjern forsigtigt håret ved hjælp af et barberblad til at forhindre infektion og skære 10 mm i hovedbunden, så bregma og lambda er synlige. Administrere 0,1 mL 1% lidocain ved hjælp af en pipette. Indstille vinklen på hovedet ved at justere den lodrette placering af mundstykket på stereotaxisk instrumentet, så at bregma og lambda har samme z-niveau.
- Juster positionen for manipulatoren ved at skubbe det på den stereotaxisk instrument, således at spidsen af sprøjten er tæt på bregma og registrere placeringen af manipulatoren. Trække sprøjten ved at flytte værktøjsholderen på en manipulator.
- Flytte manipulatoren 5,4 mm posteriort og 0,4 mm sideværts. Drejes sprøjten, så spidsen er tæt på indgang på kraniet. Trække sprøjten og markere Indgangspunktet.
- På den afmærkede position, bore et hul med en diameter på ca. 1 mm.
- Indsætte sprøjte spidsen gennem hullet, så tip dybde er 6,9 mm mere end der måles på bregma.
- Injicér 1 µL af røbestoffer ved hjælp af pumpen på 0,2 µL/min.
- Fjern sprøjten fra hjernen.
- Dække udsatte hjernen med små fragmenter af microfibrillar hemostat og instant klæbestof.
- Skyl de udsatte hjerne ved hjælp af saltvand leveres med en pipette til at forhindre infektion og sutur hovedbunden.
- Fjerne musen fra den stereotaxisk instrument. Tillad den mus hen til genoprette fra anæstesi i en inkubator ved 30 ˚C, typisk for 1 h. Efterlad ikke musen uden opsyn indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency. Returnere musen til selskab med andre dyr, når det er fuldt genoprettet.
- Vedligeholde musen for 3-7 dage.
-
Gøre injektioner i den overlegne colliculus af voksen mus.
- Forbered glas pipette med en spids diameter på 30 – 50 µm.
- Tilslut glas pipette til en Hamilton sprøjte gennem et plastikrør (figur 2A).
- Fyld glasset pipette, plastikrør og Hamilton sprøjte med paraffin væske.
- Placere en injektor pumpen på sprøjten.
- Placer glas pipette på manipulatoren og vippe manipulator 60° posteriort fra den lodrette akse (figur 2B).
- Udføre 2.1.4–2.1.9. Placeringen af manipulatoren er 1,4 mm bageste, 0.5 mm lateral til lambda.
- Placer en lille plast paraffin film på kraniet, og derefter sætte ca 1 µL af tracer løsning på det. Hurtigt fremme glas pipette, og fyld den med mindst 0,5 µL af opløsningen tracer.
- Indsætte glas pipette, så tip dybde er 3,0 mm fra hjernen overflade.
- Injiceres 0,5 µL af røbestoffer ved hjælp af pumpen på 0,2 µL/min.
- Fjerne glas pipette fra hjernen.
- Udføre 2.1.13–2.1.16.
3. fiksering og trimning
- Injicere natrium pentobarbital (60 mg/kg kropsvægt) intraperitoneal i en mus (C57BL/6J eller Tlx3-cre/Ai9, med eller uden tracer injektion som beskrevet i trin 2. Vent, indtil musen gør ingen svar når halen er klemt med pincet, der angiver, at musen er fuldt bedøvede.
- Aflive mus humant af perfusing musen transcardially20 med 0,9% saltvand.
- Fix mus20 af perfusing 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 0,1 M fosfat-buffer (pH 7,5).
-
Skære hovedbunden med en saks til at eksponere kranium som beskrevet20.
- Skære midterlinjen af udsatte kraniet ved hjælp af en saks. Fjerne kraniet med pincet.
- Hvis markerer placeringen af bregma og lambda er nødvendigt, skal du først fjerne en halvkugle af kraniet. Indsætter tynde wolfram nåle ind i hjernen på bregma og lambda på kraniet tilbage på hjernen holdninger, så fjerne de resterende kraniet.
Bemærk: Hjernen kan opbevares i PBS ved 4 ˚C.
-
For at udføre antistoffarvning hæmmende neuroner, skæres hjernen prøver i skiver.
- Hjernen prøven anbringes på en vibratome.
- Skær skiver op til 500 µm tykt i PBS ved stuetemperatur og Fortsæt til trin 5 (AbScale metode).
- Hvis antistoffarvning er unødvendige, trim hjernen prøven blokerer (op til 3 mm tyk) ved hjælp af et barberblad (figur 3) og Fortsæt til trin 4 (SeeDB metode).
Bemærk: Hjernen kan være gemt i PBS ved 4 ° C efter klipning eller trimning. Metoden SeeDB er at foretrække, når antistoffarvning ikke er nødvendigt, da det kræver mindre tid end AbScale metode.
4. clearing uden antistof farvning (SeeDB metode)
- Overføre prøven ved hjælp af en spatel til en 50 mL plastik rør indeholdende 20 mL 0,5% α-thioglycerol og 20% (w/v) fructose og Inkuber det i 4 h med blid ryster ved stuetemperatur.
- Overføre prøven ved hjælp af en spatel til en 50 mL plastik rør indeholdende 20 mL 0,5% α-thioglycerol og 40% (w/v) fructose og Inkuber det i 4 h med blid ryster ved stuetemperatur.
- Overføre prøven ved hjælp af en spatel til en 50 mL plastik rør indeholdende 20 mL 0,5% α-thioglycerol og 60% (w/v) fructose og Inkuber det i 4 h med blid ryster ved stuetemperatur.
- Overføre prøven ved hjælp af en spatel til en 50 mL plastik rør indeholdende 20 mL 0,5% α-thioglycerol og 80% (w/v) fructose og Inkuber det i 12 timer med blid ryster ved stuetemperatur.
- Overføre prøven ved hjælp af en spatel til en 50 mL plastik rør indeholdende 20 mL 0,5% α-thioglycerol og 100% (w/v) fructose og Inkuber det i 12 timer med blid ryster ved stuetemperatur.
- Overføre prøven ved hjælp af en spatel til en 50 mL plastik rør indeholdende 20 mL 0,5% α-thioglycerol og 80,2% (w/w) fructose og der inkuberes i 24 timer med blid ryster ved stuetemperatur.
Bemærk: Håndtere prøve omhyggeligt for at holde deformationer så lille som muligt. Inkuber ikke prøver længere end angivet, som prøver kan hurtigt blive uigennemsigtig. - Integrere prøven i en billeddannelse kammer fyldt med 80,2% fructose løsning (figur 1B). Hvis det er nødvendigt, lave prøven ved at lægge små stykker af gummi lim rundt. Hvis salen er for dyb, sætte en bundpladen i salen før markedsføring prøverne.
- Placer petriskål med et glas dækning på den billeddiagnostiske afdeling og sætte vand i fadet, og billedet ved hjælp af Konfokal eller to-foton mikroskopi med en vand-fordybelse længe arbejde afstand mål. Excitation bølgelængder og emission filtre er beskrevet i tabel 1. Hvis det er nødvendigt, bruge en motoriseret fase.
5. clearing med antistof farvning (AbScale metode)
- Forberede reagenser som beskrevet i tabel 2.
- Overføre skiver ved hjælp af en spatel til et 5 mL plastik rør indeholdende 4 mL af Sca/eS0 opløsning og inkuberes dem i 12 timer med blid ryster ved 37 ° C (figur 4B).
- Fjerne løsningen fra røret ved hjælp af en pipette og tilsættes 4 mL af Sca/eA2 opløsning og inkuberes skiver i 36 timer med blid ryster ved 37 ° C.
- Fjerne løsningen fra røret ved hjælp af en pipette og tilsættes 4 mL Sca/eB4 og inkuberes skiver i 24 timer med blid ryster ved 37 ° C.
- Fjerne løsningen fra røret ved hjælp af en pipette og tilsættes 4 mL af Sca/eA2 opløsning og inkuberes skiver til 12 h med blid ryster ved 37 ° C.
- Fjerne løsningen fra røret ved hjælp af en pipette og tilsættes 4 mL PBS og inkuberes skiver i 6 timer med blid ryster ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt skiver til en 2 mL plastik rør ved hjælp af en spatel.
- Der inkuberes med primære antistoffer (tabel 3) i 1 mL af AbScale løsning i 48-72 timer ved 37 ° C (figur 4 c) med blid ryster.
- Forsigtigt fjerne udsnit til et 5 mL plastik rør ved hjælp af en spatel.
- Inkuber i 4 mL af AbScale løsning for 2 h 2 gange ved stuetemperatur med blid ryster.
- Fjern forsigtigt skiver til en 2 mL plastik rør ved hjælp af en spatel.
- Inkuber med fluorescently mærket sekundære antistoffer (Tabel af materialer, 1: 100) i 1 mL af AbScale løsning i 48 timer ved 37 ° C med blid ryster.
- Omhyggeligt fjerne skiver ved hjælp af en spatel til et 5 mL plastik rør indeholdende 4 mL af AbScale opløsning og inkuberes skiver i 6 timer med blid ryster ved stuetemperatur.
- Fjerne løsningen fra røret ved hjælp af en pipette og tilsættes 4 mL af AbScale opløsning og inkuberes skiver for 2 h 2 gange med blid ryster ved stuetemperatur.
- Fjerne løsningen fra røret ved hjælp af en pipette og tilsættes 4 mL 4% PFA og inkuberes skiver for 1 h med blid ryster ved stuetemperatur.
- Fjerne løsningen fra røret ved hjælp af en pipette og tilsættes 4 mL PBS og inkuberes skiver for 1 h med blid ryster ved stuetemperatur.
- Fjerne løsningen fra røret ved hjælp af en pipette og tilsættes 4 mL af Sca/eS4, og der inkuberes skiver til 12 h med blid ryster ved 37 ° C.
- Placere spacer på et glas dias og placere udsnittene i spacer og fordybe skiver med Sca/eS4 løsning. Forsegle spacer med et cover glas (fig. 1 d).
- Put vand på cover glas og billed benytter Konfokal eller to-foton mikroskopi med en vand-fordybelse længe arbejde afstand mål. Hvis det er nødvendigt, bruge en motoriseret fase.
Bemærk: Kontroller, om de dybe dele af prøven er mærket på samme måde til de overfladiske dele at bekræfte fravær af en betydelig mærkning bias.
Bemærk: Penetration af de testede antistoffer er beskrevet i tabel 3.
6. celle holdning bestemmelse
- For hver position i de scannede billeder, beregne korrelation værdier ved hjælp af en tre-dimensionelle billede filter14 (figur 5A-5D).
- Bestemme holdninger af toppene af korrelation værdi (fig. 5 d).
- Undersøge billeder omkring toppe at finde celler (figur 5E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi mærket cortical fremskrivning neuroner ved ekspression af tdTomato i Tlx3-cre/Ai9 Transgene mus og visualiseret sub cerebral projektion neuroner ved at indsprøjte den retrograd tracer CTB488 i pons. Den venstre hjernehalvdel blev udsat for SeeDB metoden og scannes ved hjælp af en to-foton mikroskop udstyret med en vand-fordybelse længe arbejde afstand mål (25 X, N.A. 1.1, arbejde afstand 2 mm) og en motoriseret fase. En stak af 401 billeder (512 x 512 pixel, pixelstørrelse = 0,99 µm) på z-trin = 2,8 µm på hver 30 scanning holdninger blev opnået. Celle organer af to celletyper blev synlige over en bred vifte af områder i hjernen (figur 6) og optisk sektioner viste periodiske microcolumns (figur 7A). Derudover blev hjerner af Crym-egfp mus (vedligeholdes som heterozygote med C57BL/6J baggrund) ryddet af metoden SeeDB og afbildet som ovenfor. Celle organer og apikale dendrites af EGFP-udtrykker sub cerebral projektion neuroner var synlige i optisk sektioner (figur 7B).
Vi udførte også retrograd mærkning af sub cerebral projektion neuroner i C57BL/6J mus ved hjælp af CTB488. Fast hjernen blev skåret i koronale skiver med en tykkelse på ca. 500 µm og udsat for AbScale metode til at mærke at udtrykke parvalbumin celler (Anti-parvalbumin, 1:1000; Anti-mus IgG-fluorescently mærket). Stable billeder (512 x 512 pixel, pixelstørrelse = 1.24 µm; z-trin = 2.17 µm, 268 billeder/stack) blev opnået med konfokalmikroskopi med en vand-fordybelse længe arbejde afstand mål (20 X, N.A. 1.0, arbejde afstand 2 mm). Sub cerebral projektion neuroner og parvalbumin-udtrykker celler var både synlige i skiver (figur 7C).
Figur 1: Imaging kamre og afstandsstykker. (A) Top: håndlavede glas-bund petriskål (højre) og en petriskål uden glas bund (til venstre). Bund: Et kammer (højre) og gulv plader (venstre) lavet af silikone ark. (B) en mus halvkugle udsat til metoden SeeDB efter injektion af CTB555 i den overlegne colliculus er sat ind i kammeret. Prøven er fast med et stykke af genanvendelige klæbemiddel. (C) en glas dias (øverst) og en spacer lavet af en silikone ark med en tykkelse på 0,5 mm (nederst). (D) to koronale skiver af musen hjernen blev sat i spacer og dækket med et cover glas. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tracer injektion. (A) A glas pipette tilsluttet en Hamilton sprøjte gennem en plastrør. (B) en mus er placeret på et stereotaxisk instrument. Glas pipette vippes ca 60° posteriort fra den lodrette akse for injektion i den overlegne colliculus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: trimning af hjernen prøver. (A) hele hjernen prøve efter injektion af CTB555 i den overlegne colliculus og fiksering. Bregma og lambda er markeret med wolfram nåle (pilespidser). (B) den samme prøve trimmet til at opnå en halvkugle. Bemærk, at wolfram nåle forbliver (pilespidser). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Nedsænkning af hjernen prøver i løsninger til SeeDB og AbScale metoder. (A) A halvkugle prøve nedsænket i 0,5% α-thioglycerol og 20% (w/v) fructose for metoden SeeDB. (B) koronale skiver nedsænket i Sca/eA2 løsning til AbScale metode. (C) koronale skiver nedsænket i AbScale løsning som indeholder antistoffer til AbScale metode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: bestemmelse af celle positioner. Sub cerebral projektion neuroner var mærket ved at indsprøjte den retrograd tracer CTB488 i pons på 5 uger gammel. Venstre hjernehalvdel var udsat for SeeDB metoden og scannet med to-foton mikroskopi (512 x 512 pixel, pixelstørrelse = 0,99 µm; z-trin = 2,8 µm, 601 billeder/stack). (A) A enkelt billede. (B) fem billeder fra en enkelt billedstak. (C) billedet filter anvendes til at påvise CTB-mærket sub cerebral projektion neuroner. (D) korrelation værdier beregnet for de fem billeder i (B) ved hjælp af filteret i (C). (E) eksempler på fundne sub cerebral projektion neuroner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: repræsentative resultater af storstilet imaging. Cortical fremskrivning neuroner (grøn) var mærket af tdTomato-udtryk i Tlx3-cre/Ai9 Transgene mus, og sub cerebral projektion neuroner (magenta) blev visualiseret ved at indsprøjte den retrograd tracer CTB488 i pons på 7 uger af alder. Venstre hjernehalvdel blev udsat for SeeDB metoden og området 1,250 µm til 2,690 µm laterale og-3,400 µm til 1.230 µm foran bregma blev scannet ved hjælp af to-foton mikroskopi. (A) Top view. Omtrentlige positioner af kortikale områder blev vist. (B-D) Skrå visning af CTB 488 fluorescens viser sub cerebral projektion neuroner (B), tdTomato fluorescens viser cortical fremskrivning neuroner (C), og det flettede billede (D). A: forreste; P: posterior; M: mediale; D: dorsale. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: høj forstørrelse fotografier af repræsentative resultater. (A) en optisk sektion af billedet i figur 6D. Billede tykkelse = 20 µm. (B) EGFP-mærket sub cerebral projektion neuroner i en heterozygous Crym-egfp mus henne ved 6 ugens i alder. Billede tykkelse = 30 µm. (C) Subcerebral projektion neuroner (magenta) var mærket ved at indsprøjte CTB488 i pons C57BL/6J mus på postnatal dag 49, og at udtrykke parvalbumin celler (grønne) blev visualiseret ved AbScale metode. Billede tykkelse = 55 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Fluorophore | Ex. (nm) | Filter (nm) |
| EGFP | 910 | 500-550 (FF03 / 525/50 / 25, Semrock) |
| tdTomato | 1.000 | 578-633 (D605 / 55m, Chroma) |
| Alexa Fluor 488 | 750 | 500-550 (FF03 / 525/50 / 25, Semrock) |
| Alexa Fluor 555 | 750 | 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56, Semrock) |
| DAPI | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock) |
Tabel 1: Excitation bølgelængder og filtre til to-foton mikroskopi.
Tabel 2: reagenser til AbScale metode. Venligst klik her for at downloade denne fil.
| Antigen | Immuniseret dyr | Produkt-ID | Koncentration | 3 mm blok | 500 μm skive |
| NeuN | Mus | MAB377 | 1: 500 | ND | + |
| NeuN | Kanin | ABN78 | 1: 500 | ND | + |
| CTIP2 | Rotte | ab18465 | 1: 100 | L1-L6 | + |
| Statb2 | Mus | ab51502 | 1: 100 | - | - |
| GAD67 | Mus | MAB5406 | 1:200 | ND | + |
| GABA | Kanin | A2052 | 1: 100 | - | - |
| Parvalbumin | Mus | 235 | 1:1000 | ND | + |
| Parvalbumin | Ged | PV-Go-Af460 | 1: 100 | L1-L2/3 | + |
| Parvalbumin | Mus | P3088 | 1:1000 | ND | + |
| Parvalbumin | Kanin | ab11427 | 1: 500 | ND | - |
| Somatostatin | Kanin | T-4103 | 1:1000 | L1-L2/3 | + |
| c-Fos | Kanin | PC38 | 1:1000 | ND | + |
Tabel 3: Penetration af de testede antistoffer. Resultater for 3 mm tyk blokke er vist som følger; L1-L6: indtrængen i hele kortikale tykkelse; L1-L2/3: penetration ned til layer 2/3; -: ingen mærkning; ND: ikke fastlagt. Resultater for 500 µm-tykke skiver er vist som følger; +: ensartede mærkning; -: ingen eller begrænset mærkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har udarbejdet procedurer for at opnå store tre-dimensionelle billeder af celle type-specifikke organisation af de store celletyper i mus neocortical lag 5. Sammenlignet med konventionelle skive farvning, er metoden mere nyttigt i fastlæggelse af den tredimensionale organisation af neocortex. Metoden gør det billede erhvervelse fra den bredere og dybere hjernen regionerne i forhold til typiske i vivo 2-foton mikroskopi eller konventionelle Konfokal mikroskopi og således kan tillade, at den omfattende analyse af de neocortical trådløse organisation.
Et kritisk trin i metoden er antistof penetration. En delmængde af antistoffer viser dårlig indtrængen i tyk prøver (tabel 3), og derfor ikke kan bruges til AbScale metode. For at opnå ensartede mærkning med antistofferne anvendes i denne undersøgelse, var det nødvendigt at skære hjernen i 500 µm skiver. Brugen af mindre antistof fragmenter, fx Fab F(ab') 2 fragmenter, og/eller andre clearing metoder21,22,23,24,25,26, 27,28 kan forbedre resultaterne.
Antistof antigen-bindende specificitet er normalt karakteriseret i tynde væv skiver men kan være forskellige i tykt væv forarbejdet for clearing. For at kontrollere for antistof specificitet, vi Co mærket væv med sporstof injektion og markør genekspression i transgene dyr og også udførte blokerende eksperimenter ved hjælp af antigen proteiner og peptider14. Disse procedurer og kontrol eksperimenter ved hjælp af mutant dyr mangler mål antigener er nyttigt for bekræfter specificitet af antistoffer.
En begrænsning af metoden er, at nogle deformation af modellen er uundgåelig på grund af håndtering af blød bulk prøver. At opnå i vivo billeder før fiksering og bruger disse billeder som referencer vil bidrage til at korrigere sådanne deformationer.
De nuværende procedurer blev designet til analyse af neocortical lag 5. De seneste analyser har identificeret mange molekylære markører at etiketten neuronal celletyper i andre lag4,5,6,7, og anvendelsen af disse beslutningstagere på den nuværende metode kan aktivere identifikation af vigtig cellulær organisation i andre lag. Derudover bør det være muligt at udføre lignende analyser i hjerneregioner end neocortex og i organer end hjernen, at undersøge om en præcis cellulære organisation svarende til microcolumns er til stede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Atsushi Miyawaki og Hiroshi Hama for deres råd om AbScale eksperimenter, Charles Yokoyama til redigering af manuskriptet, Eriko Ohshima og Miyuki Kishino for deres tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af forskningsmidler fra RIKEN T.H. og Grants-in-Aid for videnskabelig forskning fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT) af Japan til T.H. (Innovative områder "Mesoskopisk Neurocircuitry", 22115004) og S.S. (25890023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
