Summary
Здесь мы опишем процедуру для очистки ткани, люминесцентные маркировки и крупномасштабных изображений мыши мозговой ткани, которая, таким образом, позволяет визуализации трехмерных организации типов клеток коры головного мозга.
Abstract
Неокортекс млекопитающих состоит из многих типов возбуждающих и ингибирующих нейронов, каждый с конкретными электрофизиологических и биохимических свойств, синаптических связей, и в естественных условиях функции, но их основные функциональные и анатомические плохо понимается Организация от сотовой сети шкалой. Здесь мы описываем метод для трехмерных изображений дневно меченых нейронов через большие участки мозга для расследования кортикального слоя клеточной организации. Конкретные типы нейронов помечены введения флуоресцентных Ретроградная нейрональных Трейсеры или выражением флуоресцентных белков у трансгенных мышей. Блока мозга образцы, например, полушария, готовятся после фиксации, прозрачными с ткани, очистка методов и подвергается флуоресцентный immunolabeling типов конкретных клеток. Большие площади, проверяются с помощью конфокальной или два Фотон Микроскопы, с большого расстояния рабочих целей и моторизованных этапов. Этот метод может решить периодической организации конкретного типа microcolumn функциональных модулей ячейки в коры головного мозга мыши. Процедура может быть полезным для изучения трехмерной сотовой архитектуры в областях различных мозга и других сложных тканей.
Introduction
Неокортекс млекопитающих состоит из большого числа типов клеток, каждый с картин выражения определенного гена, электрофизиологических и биохимических свойств, синаптических связей, и в естественных условиях функции1,2 ,3,4,5,6,7. Ли эти типы клеток организованы неоднократные структуры был неясным. Корковых столбцы, включая столбцы визуальные ориентации и соматосенсорные бочки, повторили структур, но их клеточной Организации остается неясным8,9. Они присутствуют в конкретных областях, коры и не мозг всей системы.
В слое 5 кортикальное значительное большинство нейронов, подразделяются на четыре основных типа. Основной тип возбуждающих нейронов, югу мозгового проекции нейронов, проекты аксоны подкорковых целей, включая Понс, спинного мозга и четверохолмия и, таким образом, представляет основные корковые выходной путь10. Проекции корковых нейронов, другой основной тип возбуждающих нейронов, иннервируют коры10. Ингибирующих нейронов также содержит два основных класса: выражая Парвальбумин и соматостатина выражая клетки11.
Недавние анализы показывают, что типы четыре ячейки организованы в неоднократных структуры12,,1314. Югу мозгового проекции нейронов12,13,14 и корковые проекции нейронов14 организовать в конкретных microcolumns тип ячейки диаметром 1 – 2 клетки. Парвальбумин выражая и соматостатина выражая клетки выровнять специально с microcolumns югу мозгового проекции нейронов, но не с microcolumns проекции корковых нейронов14. Microcolumns, сами периодически выровнять форма шестиугольная решетка массива14 и присутствуют в нескольких корковых областях, включая визуальные и соматосенсорные мотор районы мыши мозга12,14 и на языке области человеческого мозга13. Нейронов в отдельных microcolumn выставку синхронизированной активности и имеют аналогичные сенсорные ответы14. Эти наблюдения показывают, что слой 5 типов клеток организовать в структуру решетки microcolumn, представляющий первый известный мозг всей Организации повторения функциональных модулей.
Microcolumns имеют радиус около 10 мкм и пространственной периодичности приблизительно 40 мкм. Кроме того параллельно с их апикальных дендритов и изменения в зависимости от их позиции в коре14ориентации microcolumns. Таким образом система microcolumn трудно анализировать с помощью обычных корковых ломтики с типичной толщиной в несколько десятков микрометров. Кроме того анализ периодичности требует трехмерных данных от широкий спектр областей мозга и, следовательно, типичный визуализации области конфокальной микроскопии или в естественных условиях 2-фотонных изображений является слишком узким.
Недавно были разработаны методы для очистки толстые ткани15,16. Здесь мы описываем применение этих методов для получения типов основных клеток мыши кортикальное слоя 5 крупномасштабных, трехмерные изображения, которые составляют систему microcolumn. Subcerebral проекции нейронов помечены путем ретроградного маркировки или выражение расширенной Зеленый флуоресцирующий белок в Панамакс egfp трансгенных мышей12и корковые проекции, которые нейронами помечены путем ретроградного маркировки или выражением tdTomato в Tlx3-cre/Ai9 мышей17. Парвальбумин выражая и соматостатина выражая клетки помечены, иммуногистохимия. Метод (антитела шкалы S) AbScale18 используется для антитело пятная экспериментов, в то время как для других экспериментов используется метод SeeDB (см. глубокие мозга)19 . Эти методы преодоления вышеуказанных трудностей обычных методов обработки изображений и выявить точные клеточной организации слой 514.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были одобрены RIKEN Wako животных эксперименты Комитета и Комитета по безопасности RIKEN генетической рекомбинации эксперимент и соответствии организационных руководящих животных зал RIKEN мозга науки Институт.
1. Подготовка изображений камер
-
Изображения камеры19
- Используя Листы резиновые силиконовые, Подготовьте камеру с толщиной около 5 мм и Пол плиты различной толщины. Кроме того готовить Петри с и без низа стекла (рис. 1A).
-
Разделители фрагментов
- Подготовьте распорки для хранения образцов, используя резиновые силиконовые листы толщиной 0,5 мм (рис. 1 c).
2. tracer инъекций
Примечание: Сделать инъекции в Понс (2.1) или четверохолмия (2.2). Инъекции в Понс лейбл югу мозгового проекции нейронов в широкий мозга регионе, включая визуальные и мотор районах, тогда как инъекции в четверохолмия этикетки югу мозгового проекции нейронов в области визуального. Для управления экспериментов придать солевых вместо дневно меченых холеры токсин Субблок б. Для поддержания стерильные условия использования стерилизовать оборудование и резиновые перчатки, очищены с этанолом.
-
Сделайте инъекции в Понс взрослых мышей.
- Нарисуйте 1 мкл дневно меченых холеры токсин Субблок B (25 µг/мкл в PBS) в 26 G Гамильтон шприц.
- Поместите насос форсунки на шприц.
- Поместите шприц и насос на держатель инструмента манипулятора на стереотаксического инструмента. Наклона манипулятора 12° кзади от вертикальной оси.
- Анестезировать мужского или женского пола взрослых мыши (C57BL/6J или Tlx3-cre/Ai9) путем инъекций Пентобарбитал натрия внутрибрюшинно (60 мг/кг массы тела) или управляющими изофлюрановая (2-3%). Подождите, пока мыши делает никакого ответа, когда его хвост ущипнул с щипцами, указав, что мышь полностью под наркозом.
- Поместите курсор мыши на стереотаксического инструмента.
- Осторожно удалите волосы с помощью лезвия бритвы для предотвращения инфекции и вырезать 10 мм волосистой части головы, так что видны bregma и лямбда. Администрировать 0,1 мл 1% лидокаина с помощью пипетки. Задайте угол головы, регулируя вертикальное положение мундштук стереотаксического инструмента так, что bregma и лямбда имеют тот же z уровень.
- Отрегулируйте положение манипулятора, сдвинув ее на стереотаксического инструмента так, что кончик шприца, недалеко от bregma и записать позицию манипулятора. Убрать шприц, перемещая держателя инструмента на манипулятор.
- Переместите манипулятор 5,4 мм кзади и 0.4 мм сбоку. Заранее шприц так, что кончик близка точка входа на черепе. Убрать шприц и отметьте точку входа.
- На помеченную позицию Просверлите отверстие диаметром около 1 мм.
- Вставьте наконечник шприца через отверстие, так, что кончик глубина составляет 6,9 мм больше, чем что измеряется в bregma.
- Придать 1 мкл Трейсеры с помощью насоса в 0.2 мкл/мин.
- Удалите шприц из мозга.
- В случае необходимости, покрытия подвергаются мозга с небольших фрагментов microfibrillar зажим и мгновенного клея.
- Промойте подвергаются мозга с помощью солевых поставляется с пипеткой для предотвращения инфекции и шовные волосистой части головы.
- Удалите из стереотаксического инструмента мышь. Позволяет мыши, чтобы оправиться от анестезии в инкубаторе на 30 градусов, обычно в течение 1 ч. Не оставляйте мыши без присмотра, до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency. Возвращение мыши в компании других животных после того, как он полностью выздоровел.
- Сохранить мыши для 3-7 дней.
-
Сделайте инъекции в четверохолмия взрослых мышей.
- Подготовка стеклянной пипетки с наконечник диаметром 30-50 мкм.
- Подключите стеклянной пипетки к Гамильтон шприцем через пластиковую трубку (рис. 2A).
- Заполните Пипетки стеклянные, пластиковые трубки и Гамильтон шприца с жидкостью, парафин.
- Поместите насос форсунки на шприц.
- Место стеклянной пипетки на манипулятор и наклона манипулятора 60° кзади от вертикальной оси (рис. 2B).
- Выполните 2.1.4–2.1.9. Позиция манипулятора-1,4 мм задняя, 0.5 мм сбоку лямбда-выражения.
- Место небольшой пластиковый парафин фильм на черепе, а затем положить на него примерно в 1 мкл раствора трассирующими. Быстро вперед стеклянной пипетки и заполнить его с по крайней мере 0.5 мкл раствора трассировщик.
- Вставьте стекло пипетки, так что глубина кончик-3,0 мм от поверхности мозга.
- Придать 0.5 мкл Трейсеры с помощью насоса в 0.2 мкл/мин.
- Пипетки стеклянные удалите из мозга.
- Выполните 2.1.13–2.1.16.
3. Фиксация и обрезки
- Внутрибрюшинно привнести Пентобарбитал натрия (60 мг/кг массы тела) в мышь (C57BL/6J или Tlx3-cre/Ai9, с или без инъекций трассирующими, как описано в шаге 2. Подождите, пока мыши делает никакого ответа, когда его хвост ущипнул с щипцами, указав, что мышь полностью под наркозом.
- Усыпить мыши гуманно, perfusing мыши transcardially20 с 0,9% физиологического раствора.
- Исправить мыши20 , perfusing параформальдегида 4% (PFA) в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5).
-
Вырежьте головы с помощью ножниц выставить череп как описано20.
- Вырежьте срединной подвергаются черепа с помощью ножниц. Удаление черепа с помощью щипцов.
- Если необходима маркировка позиции bregma и лямбда, сначала удалите одно полушарие черепа. Вставьте тонкий вольфрамовый иглы в мозг на позиции bregma и лямбда на череп, оставаясь на мозг, а затем удалите оставшиеся черепа.
Примечание: Мозг может храниться в PBS на 4 градусов.
-
Чтобы выполнить антитело пятная ингибирующих нейронов, нарежьте ломтиками образцов мозга.
- Поместите образцы мозга на vibratome.
- Нарезать ломтиками до 500 мкм толщиной в PBS при комнатной температуре и перейдите к шагу 5 (метод elAbSca).
- Если Пятнать антитела является ненужной, отделка образец мозг блокирует (толщиной до 3 мм) с помощью лезвия бритвы (рис. 3) и перейдите к шагу 4 (метод SeeDB).
Примечание: Мозг может храниться в PBS на 4 ° C после резки или обрезки. SeeDB метод является предпочтительным при Пятнать антитела не является необходимым, поскольку он требует меньше времени, чем метод elAbSca.
4. Очистка без антитело пятная (метод SeeDB)
- Передача образца с помощью шпателя до 50 мл пластиковая трубка, содержащая 20 мл 0,5% α-thioglycerol и 20% (w/v) фруктозы и проинкубируйте 4 ч с нежным тряску при комнатной температуре.
- Передача образца с помощью шпателя до 50 мл пластиковая трубка, содержащая 20 мл 0,5% α-thioglycerol и 40% (w/v) фруктозы и проинкубируйте 4 ч с нежным тряску при комнатной температуре.
- Передача образца с помощью шпателя до 50 мл пластиковая трубка, содержащая 20 мл 0,5% α-thioglycerol и 60% (w/v) фруктозы и проинкубируйте 4 ч с нежным тряску при комнатной температуре.
- Передача образца с помощью шпателя до 50 мл пластиковая трубка, содержащая 20 мл 0,5% α-thioglycerol и 80% (w/v) фруктозы и проинкубируйте 12 ч с нежным тряску при комнатной температуре.
- Передача образца с помощью шпателя до 50 мл пластиковая трубка, содержащая 20 мл 0,5% α-thioglycerol и 100% (w/v) фруктозы и проинкубируйте 12 ч с нежным тряску при комнатной температуре.
- Передача образцов, с помощью шпателя для пластиковый Тюбик 50 мл, содержащие 20 мл 0,5% α-thioglycerol и 80,2% фруктозы (w/w) и проинкубируйте 24 ч с нежным тряску при комнатной температуре.
Примечание: Обработка образца тщательно, чтобы держать деформаций как можно меньше. Не Проинкубируйте образцы дольше, чем указано, как образцы могут быстро стать непрозрачным. - Внедрите выборку в тепловизионные камеры, заполненные раствором фруктозы 80,2% (рис. 1B). При необходимости, исправьте образца, поставив небольшие кусочки резиновый клей вокруг. Если Палата является слишком глубоко, положить Пол пластины в камере до размещения образцов.
- Поместите Петри с стеклянной крышкой на тепловизионные камеры и положить воду в блюдо и изображения с помощью конфокальный или два Фотон микроскопии с водой погружение долгий расстояние цель. Волны возбуждения и выбросов фильтры описаны в таблице 1. При необходимости, используйте моторизованного столика.
5. Очистка с антитело пятная (метод elAbSca)
- Подготовка реагентов, как описано в таблице 2.
- Передача с помощью шпателя до 5 мл пластиковая трубка, содержащая 4 мл раствора Sca/eS0 ломтиками и проинкубируйте 12 h с нежным тряску при 37 ° C (рис. 4B).
- Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл раствора Sca/eA2 и инкубации срезов для 36 h с нежным тряску при 37 ° C.
- Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл раствора Sca/eB4 и инкубации срезов для 24 h с нежным тряску при 37 ° C.
- Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл раствора Sca/eA2 и инкубации срезов для 12 h с нежным тряску при 37 ° C.
- Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл PBS и инкубации срезов для 6 h с нежным тряску при комнатной температуре.
- Осторожно удалите кусочками по 2 мл пластиковых труб, с помощью шпателя.
- Проинкубируйте с первичных антител (Таблица 3) в 1 мл AbScale решения для 48-72 ч при 37 ° C (рис. 4 c) с нежным встряхивания.
- Осторожно удалите ломтики в 5 мл пластиковых труб, с помощью шпателя.
- Инкубируйте в 4 мл AbScale решения для 2 h 2 раза при комнатной температуре с нежным встряхивания.
- Осторожно удалите кусочками по 2 мл пластиковых труб, с помощью шпателя.
- Проинкубируйте с дневно меченых вторичные антитела (Таблица материалов, 1: 100) в 1 мл AbScale решения для 48 ч при 37 ° C с нежным встряхивания.
- Тщательно удалить фрагменты с помощью шпателя до 5 мл пластиковая трубка, содержащая 4 мл раствора AbScaле и инкубации срезов для 6 h с нежным тряску при комнатной температуре.
- Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл раствора AbScaле и инкубации срезов для 2 h 2 раза с нежным тряску при комнатной температуре.
- Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл 4% PFA и инкубации срезов для 1 h с нежным тряску при комнатной температуре.
- Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл PBS и инкубации срезов для 1 h с нежным тряску при комнатной температуре.
- Удаление решения из трубки с помощью пипетки и добавить 4 мл раствора Sca/eS4 и инкубации срезов для 12 h с нежным тряску при 37 ° C.
- Поместите прокладку на стеклянное скольжение и место ломтики в распорку и погружать ломтики Sca/eS4 раствором. Уплотнение распорку с покровным стеклом (рис. 1 d).
- Положите воду на Стекло покровное и изображения с помощью конфокальный или два Фотон микроскопии с водой погружение долгий расстояние цель. При необходимости, используйте моторизованного столика.
Примечание: Проверьте ли глубокой части образца помечены аналогично поверхностных частей для подтверждения отсутствия значительных маркировки уклоном.
Примечание: Проникновение протестированных антител описан в таблице 3.
6. Определение положения ячейки
- Для каждой позиции в отсканированные изображения Рассчитайте значения корреляции с помощью трехмерного изображения фильтр14 (Рисунок 5A-5D).
- Определите позиции вершин значение корреляции (рис. 5 d).
- Исследуйте изображения вокруг вершины для обнаружения ячеек (Рисунок 5E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы помечены корковых проекции нейронов выражением tdTomato в Tlx3-cre/Ai9 трансгенных мышей и визуализированы югу мозгового проекции нейронов путем впрыскивать Ретроградная трассировщик CTB488 в Понс. Левое полушарие мозга был подвергнут к методу SeeDB и сканирование с помощью двух Фотон микроскоп оснащен-погружения в воду долгий расстояние цель (25 X, н.а. 1.1, рабочее расстояние 2 мм) и моторизованного столика. Стек 401 изображений (512 x 512 пикселов; размер пикселя = 0,99 мкм) на z шаг = 2.8 мкм в каждом из 30 сканирование позиции был получен. Клетки тела типов двух клеток были видны в широком диапазоне областей головного мозга (рис. 6), и оптических секций показали периодические microcolumns (рис. 7A). Кроме того мозг мышей Панамакс egfp (поддерживаются как heterozygotes на фоне C57BL/6J) были очищены методом SeeDB и образы как указано выше. В оптических секции (рис. 7B) были видны клетки органов и апикальных дендритов EGFP-выражая югу мозгового проекции нейронов.
Мы также провели ретроградной маркировки югу мозгового проекции нейронов в мышей C57BL/6J с помощью CTB488. Фиксированной мозга было нарезать корональные срезы толщиной приблизительно 500 мкм и подвергается AbScale метод для обозначения Парвальбумин выражая клетки (анти Парвальбумин, 1: 1000; Анти мыши IgG дневно помечены,). Стек изображений (512 x 512 пикселей, размер пикселя = 1,24 мкм; z шаг = 2.17 мкм, 268 изображения/стек) были получены с помощью конфокальной микроскопии с водой погружение долгий расстояние цель (20 X, 1.0 н.а., рабочее расстояние 2 мм). Югу мозгового проекции нейронов и выражая Парвальбумин клетки были видны в срезы (рис. 7 c).
Рисунок 1: изображений камер и распорки. (A) Top: ручной прозрачным дном Петри (справа) и Петри блюдо без низа стекла (слева). Внизу: Палата (справа) и половые плиты (слева) из силиконовые листы. (B) мыши полушарие подвергается метода SeeDB после инъекции CTB555 в четверохолмия устанавливается в камеру. Образец фиксируется с куском многоразового использования клея. (C) A стеклянное скольжение (вверху) и прокладку из силикона листа толщиной 0,5 мм (снизу). (D) два корональные срезы мозга мыши были введены в распорку и покрытые стеклом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: трассирующими инъекций. (A) A стеклянной пипетки подключен к Гамильтон шприцем через пластиковую трубку. (B) мыши помещается на стереотаксического инструмента. Пипетки стеклянные наклонена приблизительно 60° кзади от вертикальной оси для инъекций в четверохолмия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Утеска образцов мозга. (A) весь мозг образца после инъекции CTB555 в четверохолмия и фиксации. Bregma и лямбда были отмечены вольфрамовые иглы (стрелки). (B) того же образца подстриженные для получения полушария. Обратите внимание, что Вольфрам иглы остаются (стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Погружение образцов мозга в решения для SeeDB и AbScale методов. (A) A полушария образец погружается в 0,5% α-thioglycerol и 20% (w/v) фруктоза для метода SeeDB. (B) корональных ломтика погружен в Sca/eA2 решения для метода elAbSca. (C) корональных ломтика погружается в AbScale раствор, содержащий антитела для метода elAbSca. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: определение позиции ячейки. Югу мозгового проекции нейронов были помечены путем впрыскивать Ретроградная трассировщик CTB488 в Понс в возрасте 5 недель. Левое полушарие подвергается метода SeeDB и отсканированных с двух Фотон микроскопии (512 x 512 пикселей, размер пикселя = 0,99 мкм; z шаг = 2,8 мкм, 601 изображения/стек). (A) A единый образ. (B) пяти изображений из стека одно изображение. (C) изображения фильтр, используемый для обнаружения CTB-меченых югу мозгового проекции нейронов. (D) рассчитаны значения корреляции для пяти изображений в (B) с помощью фильтра в (C). (E) примеры обнаруженных югу мозгового проекции нейронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: представитель результаты крупномасштабных изображений. Проекции корковых нейронов (зеленый) были помечены tdTomato выражение в Tlx3-cre/Ai9 трансгенных мышей, и югу мозгового проекции нейронов (пурпурный) были визуализированы путем впрыскивать Ретроградная трассировщик CTB488 в Понс на 7 недель возраста. Левое полушарие подвергается метода SeeDB и площадь 1250 мкм до 2690 боковых мкм и-3,400 мкм до 1230 мкм впереди bregma был отсканирован с помощью двух Фотон микроскопии. Вид сверху (A). Были показаны приблизительные позиции корковых областях. (DB–) Косой взгляд ВЗИ 488 флуоресценции показаны югу мозгового проекции нейронов (B), tdTomato флуоресценции показаны проекции корковых нейронов (C) и объединенного изображения (D). A: передней; P: задняя; M: медиальной; D: спинной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: высокое увеличение фотографии представительных результатов. (A) оптическая часть изображения в Рисунок 6 d. Изображение толщина = 20 мкм. (B) EGFP-меченых югу мозгового проекции нейронов в гетерозиготных Панамакс egfp мыши в возрасте 6 недель. Изображение толщина = 30 мкм. (C) Subcerebral проекции нейронов (пурпурный) были помечены путем впрыскивать CTB488 в Понс мышей C57BL/6J в послеродовой день 49 и выражая Парвальбумин клетки (зеленый) были визуализирована методом elAbSca. Изображение толщина = 55 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Флюорофор | Ex. (Нм) | Фильтр (Нм) |
| EGFP | 910 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| tdTomato | 1,000 | 578-633 (D605/55 м, цветность) |
| Alexa Fluor 488 | 750 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| Флуор Alexa 555 | 750 | 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56, Semrock) |
| DAPI | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock) |
Таблица 1: Волны возбуждения и фильтры для двух Фотон микроскопии.
Таблица 2: Реагенты для метода e AbScaл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Антиген | Иммунизированных животных | КОД продукта | Концентрация | блок 3 мм | Ломтик 500 мкм |
| NeuN | Мышь | MAB377 | 1: 500 | ND | + |
| NeuN | Кролик | ABN78 | 1: 500 | ND | + |
| CTIP2 | Крыса | ab18465 | 1: 100 | L1-L6 | + |
| Statb2 | Мышь | ab51502 | 1: 100 | - | - |
| GAD67 | Мышь | MAB5406 | 1: 200 | ND | + |
| ГАМК | Кролик | A2052 | 1: 100 | - | - |
| Парвальбумин | Мышь | 235 | 1: 1000 | ND | + |
| Парвальбумин | Коза | PV-Go-Af460 | 1: 100 | L1-L2/3 | + |
| Парвальбумин | Мышь | P3088 | 1: 1000 | ND | + |
| Парвальбумин | Кролик | ab11427 | 1: 500 | ND | - |
| Соматостатина | Кролик | T-4103 | 1: 1000 | L1-L2/3 | + |
| c Фос | Кролик | PC38 | 1: 1000 | ND | + |
Таблица 3: проникновение протестированных антител. Результаты 3 мм толстой блоков отображается следующим образом; L1-L6: проникновение в целом корковой толщины; L1-L2/3: проникновение вплоть до уровня 2/3; -: нет маркировки; ND: не определена. Результаты для 500 мкм толстые ломтики показан следующим образом; +: единообразной маркировки; -: нет или маркировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представили процедуры для получения крупных трехмерные изображения клетки конкретного типа организации типов основных клеток мыши кортикальное слоя 5. По сравнению с обычных ломтик окрашивание, метод является более полезным в определении трехмерной Организации коры головного мозга. Этот метод позволяет захвата изображений из более широких и более глубоких зонах мозга по сравнению с типичными в естественных условиях 2-Фотон микроскопии или обычных confocal микроскопии и, таким образом, можно разрешить всесторонний анализ кортикальное сотовых Организации.
Важнейшим шагом метода является проникновение антитела. Подмножество антител показывает плохое проникновение в толстых образцах (Таблица 3) и, таким образом, не может использоваться для метода elAbSca. Для получения единообразной маркировки с антителами, используемые в данном исследовании, было необходимо вырезать мозг ломтиками 500 мкм. Использование меньших фрагментов антитела, например, Fab или фрагменты F(ab') 2, или другие методы21,,2223,24,25,26, очистка 27,28 может улучшить результаты.
Антиген связывая специфичность антитела обычно характеризуется в тонких тканей срезы, но может в толстых тканей обработан для очистки. Для управления специфичность антитела, мы совместно с надписью тканей с трассирующими инъекций и маркер экспрессии генов в трансгенных животных и также исполнил блокировки эксперименты с использованием антигена белки и пептиды14. Эти процедуры и управления экспериментов с использованием мутанта животных, не хватает целевого антигены должно быть полезным для подтверждения Специфичность антител.
Ограничения метода является неизбежным из-за обработки мягких массовых проб некоторые деформации образца. Получение изображения в естественных условиях до фиксации и используя эти образы, как ссылки поможет исправить такие деформации.
Нынешние процедуры были разработаны для анализа кортикальное слоя 5. Недавние анализы выявили многие молекулярные маркеры, label типы нейрональных клеток в другие слои4,5,6,7, и применение этих органов в настоящее время метод может позволить Определение важных клеточных Организации в других слоях. Кроме того можно выполнять подобные анализы в регионах мозга помимо коры головного мозга и других органов помимо мозга, расследовать, присутствует ли точный клеточной организации, аналогичной microcolumns.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Atsushi Miyawaki и Хироси Хама за их советы по AbScale эксперименты, Чарльз Yokoyama для редактирования рукописи, Эрико Ohshima и Миюки Кишино для их технической помощи. Эта работа была поддержана исследовательских фондов от RIKEN т.г. и дотаций для научных исследований от министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ) Японии т.г. (инновационных областей «Мезоскопических Neurocircuitry»; 22115004) и С.С. (25890023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
