Summary
Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.
Abstract
De zoogdieren neocortex is samengesteld uit vele soorten excitatory en remmende neuronen, elk met specifieke elektrofysiologische en biochemische eigenschappen, synaptic verbindingen, en in vivo functies, maar hun basic functionele en anatomische organisatie van cellulaire netwerk schaal wordt slecht begrepen. Hier beschrijven we een methode voor de driedimensionale beeldvorming van fluorescently-geëtiketteerden neuronen over grote gebieden van de hersenen voor het onderzoek van de corticale cellulaire organisatie. Bepaalde soorten neuronen worden aangeduid door de injectie van fluorescerende retrograde neuronale verklikstoffen of expressie van fluorescente proteïnen in transgene muizen. Blok hersenen monsters, bijvoorbeeld een halfrond, zijn bereid na fixatie, transparant gemaakt met weefsel van het ontruimen van de methoden, en onderworpen aan fluorescerende immunolabeling van de specifieke celtypes. Grote gebieden worden gescand met behulp van de confocal of twee-foton microscopen uitgerust met grote werken afstand doelstellingen en gemotoriseerde stadia. Deze methode kan de periodieke organisatie van de cel type-specifieke microkolom functionele modules in de neocortex muis is opgelost. De procedure kan nuttig zijn voor de studie van drie-dimensionale cellulaire architectuur in de verschillende hersengebieden en andere complexe weefsels.
Introduction
De zoogdieren neocortex is samengesteld uit een groot aantal celtypes, elk met de specifiek gen-expressiepatronen, elektrofysiologische en biochemische eigenschappen, synaptic verbindingen, en functies in vivo 1,2 ,3,4,,5,,6,7. Of deze celtypes herhaalde structuren worden geordend is onduidelijk. Corticale kolommen, met inbegrip van visuele oriëntatie kolommen en somatosensorische vaten, structuren hebben herhaald, maar hun cellulaire organisatie blijft onduidelijk8,9. Deze zijn aanwezig in de specifieke corticale gebieden en niet een hersenen-omspannend rechtssysteem.
In neocortical laag 5, worden de grote meerderheid van de neuronen ingedeeld in vier grote typen. Een belangrijk type van excitatory neuronen, sub cerebrale projectie neuronen, axonen bij subcorticale doelen, met inbegrip van de pons, ruggenmerg en superieure colliculus projecten, en daarom, vertegenwoordigt de grote corticale uitvoer traject10. Projectie van de corticale neuronen, een andere belangrijke soorten excitatory neuronen, innervate de cortex10. Remmende neuronen bevatten ook twee grote klassen: parvalbumin-uitdrukken en het uiten van Somatostatine cellen11.
Recente analyses geven aan dat de vier celtypes herhaalde structuren12,13,14worden geordend. Zowel sub cerebrale projectie neuronen12,13,14 en projectie van de corticale neuronen14 indelen in celtype specifieke microcolumns met een diameter van 1-2 cellen. Parvalbumin-uitdrukken en het uiten van Somatostatine cellen uitlijnen specifiek met microcolumns van sub cerebrale projectie neuronen maar niet met de microcolumns van projectie van de corticale neuronen14 Microcolumns zelf uitlijnen periodiek op vorm een zeshoekige rooster matrix14 en aanwezig zijn in meerdere corticale gebieden met inbegrip van visuele, somatosensorische en motor in12,14 van de hersenen van de muis en in taal gebieden van menselijke hersenen13. Neuronen in de individuele microkolom gesynchroniseerde activiteit vertonen en hebben soortgelijke sensorische reacties14. Deze opmerkingen geven aan dat de laag 5 celtypes organiseren in een microkolom rooster structuur vertegenwoordigen de eerste bekende hersenen bestrijkende organisatie functionele modules te herhalen.
Microcolumns hebben een straal van ongeveer 10 µm en een ruimtelijke frequentie van ongeveer 40 µm. Daarnaast is de richting van microcolumns parallel aan hun apicale dendrites en wijzigingen afhankelijk van hun positie in de cortex-14. De microkolom systeem is daarom moeilijk om te analyseren met behulp van conventionele corticale segmenten met een typische dikte van enkele tientallen micrometers. Bovendien, de analyse van de periodiciteit driedimensionale gegevens uit een groot aantal hersengebieden, en dus de typische opnamegebied van confocale microscopie vereist of in vivo 2-photon imaging is te smal.
Onlangs, technieken zijn ontwikkeld om te wissen van dikke weefsels15,16. Hier beschrijven we de toepassing van deze methoden voor het verkrijgen van grootschalige, drie-dimensionale beelden van de belangrijkste celtypen in muis neocortical laag 5 waaruit de microkolom systeem. Subcerebral projectie neuronen worden aangeduid door de retrograde labelen of door de uitdrukking van de verbeterde groen fluorescent proteïne in Crym-egfp transgene muizen12, en corticale projectie neuronen worden aangeduid door hetzij de retrograde labeling of door de expressie van de tdTomato in Tlx3-cre/Ai9 muizen17. Parvalbumin-uitdrukken en het uiten van Somatostatine cellen worden aangeduid door immunohistochemie. De methode (antilichaam schaal S) AbScale18 wordt gebruikt voor het antilichaam kleuring van experimenten, terwijl de methode (Zie diepe brein) SeeDB19 wordt gebruikt voor andere experimenten. Deze methoden de bovengenoemde moeilijkheden van de conventionele beeldvormende methoden en onthullen de nauwkeurige cellulaire organisatie van laag 514.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de RIKEN Wako dier experimenten Commissie en RIKEN genetische Recombinant Experiment veiligheidscommissie en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de dierlijke faciliteiten van het hersenonderzoek RIKEN van institutionele Instituut.
1. bereiding van Imaging Chambers
-
Imaging kamer19
- Met behulp van silicone rubber sheets, bereiden een kamer met een dikte van ongeveer 5 mm en vloer platen van verschillende diktes. Ook bereiden petrischalen met en zonder een glazen bodem (figuur 1A).
-
Segment spacer
- Bereiden spacers om te houden van de monsters, silicone rubber platen met een dikte van 0.5 mm (Figuur 1 c).
2. tracer injectie
Opmerking: Zorg injecties in de pons (2.1) of superieure colliculus (2.2). Injectie in de pons label Sub cerebrale projectie neuronen in een regio van de grote hersenen met inbegrip van de visuele en motorische gebieden, terwijl injectie in de superieure colliculus etiketten sub cerebrale projectie neuronen in de visuele ruimte. Voor controle experimenten, injecteren zoutoplossing in plaats van fluorescently-geëtiketteerden cholera-toxine subeenheid B. Gebruik voor het handhaven van de steriele toestand gesteriliseerde apparatuur en plastic handschoenen gereinigd met ethanol.
-
Injecties in de pons van volwassen muizen maken
- Tekenen van 1 µL van fluorescently-geëtiketteerden cholera-toxine subunit B (25 µg/µL in PBS) in een 26 G Hamilton spuit.
- Plaats een injector pomp op de spuit.
- Plaats de spuit en de pomp op de houder van het instrument van een manipulator geplaatst op een stereotaxic instrument. Kantel de manipulator 12° posteriorly van de verticale as.
- Anesthetize van een mannelijke of vrouwelijke volwassen muis (C57BL/6J of Tlx3-cre/Ai9) door het injecteren van sodium pentobarbital intraperitoneally (60 mg/kg lichaamsgewicht) of door het toedienen van Isofluraan (2-3%). Wacht totdat de muis geen reactie maakt wanneer haar staart is geknepen met pincet, die aangeeft dat de muis is volledig verdoofd.
- Plaats de muis op de stereotaxic instrument.
- Verwijder voorzichtig haar met behulp van een scheermesje ter voorkoming van infectie en snijd 10 mm van de hoofdhuid zodat de bregma en de lambda zichtbaar zijn. Beheren van 0,1 mL van de 1% lidocaïne met behulp van een precisiepipet. Stel de hoek van het hoofd door de verticale positie van het mondstuk op de stereotaxic instrument aan te passen, zodat de bregma en de lambda hetzelfde z-niveau hebben.
- De positie van de manipulator aanpassen door deze te schuiven op de stereotaxic instrument zodat het uiteinde van de spuit zich dicht bij de bregma en de positie van de manipulator opnemen. De spuit intrekken door de houder van het gereedschap verplaatsen op de manipulator.
- Verplaatsen van de manipulator 5.4 mm posteriorly en 0,4 mm lateraal. Verder de spuit zodat de tip dicht bij het punt van binnenkomst op de schedel is. De spuit intrekken en markeer het ingangspunt.
- Boor een gat met een diameter van ongeveer 1 mm op het duidelijke standpunt.
- Breng de tip van de injectiespuit door het gat, zodat de tip diepte 6,9 mm is meer dan die bij de bregma gemeten.
- Injecteren 1 µL van verklikstoffen gebruiken van de pomp op 0.2 µL/min.
- Verwijder de injectiespuit uit de hersenen.
- Indien nodig, dekken de blootgestelde hersenen met kleine fragmenten van microfibrillar hemostat en instant lijm.
- Spoel de blootgestelde hersenen met zoutoplossing geleverd met een pipet ter voorkoming van infectie en suture van de hoofdhuid.
- Verwijder de muis uit de stereotaxic instrument. Laat de muis om te herstellen van verdoving in een incubator op 30 ˚C, typisch voor 1 h. Laat niet de muis zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Terug de muis naar het gezelschap van andere dieren, nadat het volledig is hersteld.
- De muis gedurende 3-7 dagen.
-
Injecties in de superieure colliculus van volwassen muizen maken
- Een glazen pipet met een diameter van de tip van 30-50 µm voor te bereiden.
- De glazen pipet verbinden met een injectiespuit Hamilton via een plastic buis (figuur 2A).
- Vul de glazen pipet, plastic buis en Hamilton spuit met de vloeibare paraffine.
- Plaats een injector pomp op de spuit.
- Plaats de glazen pipet op de manipulator en kantelen van de manipulator 60° posteriorly van de verticale as (figuur 2B).
- Uitvoeren van 2.1.4–2.1.9. De positie van de manipulator is 1.4 mm posterior, 0.5 mm lateral aan de lambda.
- Plaats een kleine plastic paraffine-film op de schedel en vervolgens ongeveer 1 µL van de tracer-oplossing op te zetten. Snel verder de glazen pipet en vul deze met ten minste 0,5 µL van de tracer-oplossing.
- De glazen pipet invoegen zodat de tip diepte 3.0 mm van het oppervlak van de hersenen is.
- Injecteren van 0,5 µL van verklikstoffen gebruiken van de pomp op 0.2 µL/min.
- De glazen pipet uit de hersenen te verwijderen.
- Uitvoeren van 2.1.13–2.1.16.
3. fixatie en trimmen
- Natrium pentobarbital (60 mg/kg lichaamsgewicht) intraperitoneally injecteren met een muis (C57BL/6J of Tlx3-cre/Ai9, met of zonder de tracer injectie zoals beschreven in stap 2. Wacht totdat de muis geen reactie maakt wanneer haar staart is geknepen met pincet, die aangeeft dat de muis is volledig verdoofd.
- De muis humaan euthanaseren door zoogdierlevercellen de muis transcardially20 met 0,9% zout.
- Oplossen van de muis20 door zoogdierlevercellen 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7.5).
-
Snijd de hoofdhuid met behulp van een paar van schaar om de schedel als beschreven20bloot te stellen.
- De middellijn van de blootgestelde schedel met behulp van een paar van schaar te knippen. Het verwijderen van de schedel met pincet.
- Als de positie van de bregma en de lambda markeren noodzakelijk is, eerst verwijderen een halfrond van de schedel. Steek dunne wolfraam naalden in de hersenen op de posities van de bregma en de lambda op de schedel nog op de hersenen en verwijderen van de resterende schedel.
Opmerking: De hersenen kan worden opgeslagen in PBS op 4 ˚C.
-
Voor het uitvoeren van antilichaam kleuring van remmende neuronen, snijd de hersenen monsters in reepjes.
- Leg het monster van de hersenen op een vibratome.
- Snijd plakjes tot 500 µm dik in PBS bij kamertemperatuur en gaat u verder met stap 5 (de AbScale methode).
- Als antilichaam kleuring overbodig is, trim de hersenen aan het monster wordt geblokkeerd (tot 3 mm dik) met behulp van een scheermesje (Figuur 3) en gaat u verder met stap 4 (de SeeDB-methode).
Opmerking: De hersenen kan worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C na uitsnijden of knippen. De SeeDB-methode verdient de voorkeur wanneer het antilichaam kleuring is niet nodig want het vergt minder tijd dan de AbScale methode.
4. clearing zonder antilichaam kleuring (de SeeDB-methode)
- Overdracht van het monster met behulp van een spatel om een plastic buis van 50 mL met 20 mL 0,5% α-thioglycerol en 20% (m/v) fructose en laat het 4 uur met zacht schudden bij kamertemperatuur inwerken.
- Overdracht van het monster met behulp van een spatel om een plastic buis van 50 mL met 20 mL 0,5% α-thioglycerol en 40% (m/v) fructose en laat het 4 uur met zacht schudden bij kamertemperatuur inwerken.
- Overdracht van het monster met behulp van een spatel om een plastic buis van 50 mL met 20 mL 0,5% α-thioglycerol en 60% (m/v) fructose en laat het 4 uur met zacht schudden bij kamertemperatuur inwerken.
- Overdracht van het monster met behulp van een spatel om een plastic buis van 50 mL met 20 mL 0,5% α-thioglycerol en 80% (m/v) fructose en Incubeer het 12u met zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Overdracht van het monster met behulp van een spatel om een plastic buis van 50 mL met 20 mL 0,5% α-thioglycerol en 100% (m/v) fructose en Incubeer het 12u met zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Overdracht van het monster met behulp van een spatel om een plastic buis van 50 mL met 20 mL 0,5% α-thioglycerol en 80.2% (w/w) fructose en laat het 24 h met zacht schudden bij kamertemperatuur inwerken.
Opmerking: Omgaan met het monster zorgvuldig om vervormingen zo klein mogelijk te houden. Incubeer monsters langer dan aangegeven, niet als monsters kunnen snel ondoorzichtig geworden. - Het monster in een imaging kamer gevuld met de 80.2% fructose-oplossing (figuur 1B) insluiten. Indien nodig, corrigeren het monster door kleine stukjes rubber lijm rond. Als de kamer te diep is, een vloerplaat in de kamer zetten alvorens de monsters te brengen.
- Plaats de petrischaal met een glasdeel op de imaging kamer en zet water in de schotel, en beeld met behulp van microscopie van de confocal of twee-foton met een water-onderdompeling werken lange afstand doelstelling. Excitatie golflengten en emissie filters staan beschreven in tabel 1. Gebruik indien nodig een gemotoriseerde stadium.
5. clearing met antilichaam kleuring (de AbScale methode)
- Bereiden reagentia zoals beschreven in tabel 2.
- Breng de segmenten met behulp van een spatel tot een 5 mL plastic koker met 4 mL Sca/eS0 oplossing en incubeer hen gedurende 12 h met zacht schudden bij 37 ° C (figuur 4B).
- De oplossing verwijderen uit de buis met behulp van een precisiepipet Voeg 4 mL oplossing van Sca/eA2 en incuberen de segmenten voor 36 h met zacht schudden bij 37 ° C.
- De oplossing van de buis met behulp van een precisiepipet verwijderen Voeg 4 mL Sca/eB4 oplossing en Incubeer de plakjes gedurende 24 uur met zacht schudden bij 37 ° C.
- De oplossing verwijderen uit de buis met behulp van een precisiepipet Voeg 4 mL oplossing van Sca/eA2 en incuberen de segmenten voor 12u met zacht schudden bij 37 ° C.
- De oplossing verwijderen uit de buis met behulp van een precisiepipet en voeg 4 mL PBS en de segmenten gedurende 6 uur met zacht schudden bij kamertemperatuur incuberen.
- Verwijder voorzichtig de plakjes op een plastic buis van 2 mL, met behulp van een spatel.
- Incubeer met primaire antilichamen (tabel 3) in 1 mL van AbScale oplossing voor 48-72 uur bij 37 ° C (figuur 4C) met zacht schudden.
- Verwijder voorzichtig de plakjes op een 5 mL plastic buis met behulp van een spatel.
- Incubeer in 4 mL AbScale oplossing voor 2 h 2 keer bij kamertemperatuur met zacht schudden.
- Verwijder voorzichtig de plakjes op een plastic buis van 2 mL, met behulp van een spatel.
- Incubeer met fluorescently-geëtiketteerden secundaire antilichamen (Tabel van materialen, 1:100) in 1 mL van AbScale oplossing gedurende 48 uur bij 37 ° C met zacht schudden.
- Verwijder de segmenten met behulp van een spatel tot een 5 mL plastic koker met 4 mL van de oplossing van AbScale voorzichtig en de segmenten gedurende 6 uur met zacht schudden bij kamertemperatuur incuberen.
- De oplossing uit de buis met behulp van een precisiepipet verwijderen en toevoegen van 4 mL van de oplossing van AbScale en de segmenten voor 2 h 2 keer met zacht schudden bij kamertemperatuur incuberen.
- Verwijder de oplossing uit de buis met behulp van een precisiepipet en voeg 4 mL 4% PFA en de segmenten voor 1 h met zacht schudden bij kamertemperatuur incuberen.
- Verwijder de oplossing uit de buis met behulp van een precisiepipet en voeg 4 mL PBS en de segmenten voor 1 h met zacht schudden bij kamertemperatuur incuberen.
- De oplossing van de buis met behulp van een precisiepipet verwijderen Voeg 4 mL van de oplossing van de Sca/eS4 en Incubeer de segmenten voor 12u met zacht schudden bij 37 ° C.
- Plaatst het tussenstuk op een glasplaatje en plaats van de segmenten in de spacer en dompel de plakjes met Sca/eS4 oplossing. Het zegel van de spacer met een glazen cover (Figuur 1 d).
- Zet water op de cover glas en beeld met behulp van microscopie van de confocal of twee-foton met een water-onderdompeling werken lange afstand doelstelling. Gebruik indien nodig een gemotoriseerde stadium.
Opmerking: Controleer of de diepe delen van het monster op dezelfde manier worden aangeduid op de oppervlakkige delen om te bevestigen het ontbreken van een significante labeling bias.
Opmerking: De penetratie van de geteste antilichamen wordt beschreven in tabel 3.
6. cel positie bepaling
- Voor elke positie in de gescande afbeeldingen, correlatie waarden met behulp van een drie-dimensionaal beeld filter14 (figuur 5A-5D) te berekenen.
- Het bepalen van de standpunten van de toppen van de waarde van correlatie (figuur 5D).
- Onderzoeken-afbeeldingen rond de toppen om cellen (figuur 5E) te zoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We label projectie van de corticale neuronen door expressie van tdTomato in Tlx3-cre/Ai9 transgene muizen en sub cerebrale projectie neuronen gevisualiseerd door het injecteren van de retrograde tracer CTB488 in de pons. De linker hemisfeer van de hersenen werd blootgesteld aan de SeeDB-methode en gescand met behulp van een twee-foton microscoop voorzien van een water-onderdompeling lange afstand doelstelling werken (25 X, N.A. 1.1, afstand 2 mm) en een gemotoriseerde podium. Een stapel van 401 beelden (512 x 512 pixels; pixelgrootte = 0.99 µm) bij z-stap = 2.8 µm op elk van de 30 scannen posities is verkregen. Over een brede waaier van hersengebieden (Figuur 6) en optische secties toonde periodieke microcolumns (figuur 7A) waren de berichtgedeelten van de cel van de twee celtypes zichtbaar. Bovendien, werden de hersenen van muizen van de Crym-egfp (behouden als heterozygoten met een achtergrond van C57BL/6J) goedgekeurd door de SeeDB-methode en beeld zoals hierboven. De cel organen en apicaal dendrites van EGFP-uiten sub cerebrale projectie neuronen waren zichtbaar in optische secties (figuur 7B).
Wij ook uitgevoerd retrograde labeling van sub cerebrale projectie neuronen in C57BL/6J muizen met behulp van CTB488. De vaste hersenen was coronale plakjes gesneden met een dikte van ongeveer 500 µm en onderworpen aan de methode AbScale naar label uiting van parvalbumin cellen (Anti-parvalbumin, 1:1000; Anti-muis IgG-fluorescently aangeduid,). Afbeeldingen stapelen (512 x 512 beeldpunten, pixelgrootte = 1.24 µm; z-stap = 2,17 µm, 268 afbeeldingen/stack) werden verkregen met behulp van de confocal microscopie met een water-onderdompeling werken lange afstand doelstelling (20 X, N.A. 1.0, afstand 2 mm). Sub cerebrale projectie neuronen en parvalbumin-uiten cellen waren beide zichtbaar in de segmenten (Figuur 7 c).
Figuur 1: Imaging chambers en afstandhouders. (A) boven: handgemaakte glazen bodem petrischaal (rechts) en een petrischaal zonder een glazen bodem (links). Bodem: Een kamer (rechts) en de vloer platen (links) gemaakt van siliconen platen. (B) een muis halfrond onderworpen aan de SeeDB-methode na injectie van CTB555 in de superieure colliculus in de kamer ligt. Het monster wordt vastgesteld met een stuk van herbruikbare lijm. (C) A glasplaatje (boven) en een spacer gemaakt van een silicone-blad met een dikte van 0.5 mm (onder). (D) twee coronale segmenten van de muis hersenen werden ingesteld in de spacer en bedekt met een glazen cover. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Tracer injectie. (A) A glazen pipet op een Hamilton spuit via een plastic buis aangesloten. (B) een muis is geplaatst op een stereotaxic instrument. De glazen pipet wordt gekanteld ongeveer 60° posteriorly van de verticale as voor injectie in de superieure colliculus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: trimmen van hersenen monsters. (A) Whole brain monster na injectie van CTB555 in de superieure colliculus en fixatie. De bregma en de lambda werden gemerkt met wolfraam naalden (pijlpunten). (B) hetzelfde monster bijgesneden tot het verkrijgen van een halfrond. Opmerking dat de naalden van wolfraam (pijlpunten) blijven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Onderdompeling van hersenen monsters in oplossingen voor de SeeDB en AbScale methoden. (A) A halfrond monster ondergedompeld in α-thioglycerol van 0,5% en 20% (m/v) fructose voor de SeeDB-methode. (B) coronale segmenten ondergedompeld in Sca/eA2 oplossing voor de AbScale methode. (C) coronale segmenten ondergedompeld in de AbScale oplossing met antilichamen voor de AbScale methode. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: bepaling van de standpunten van de cel. Sub cerebrale projectie neuronen waren gelabeld door het injecteren van de retrograde tracer CTB488 in de pons op 5 weken oud. De linker hemisfeer was onderworpen aan de SeeDB-methode en gescand met twee-foton microscopie (512 x 512 beeldpunten, pixelgrootte = 0.99 µm; z-stap = 2.8 µm, 601 beelden/stack). (A) A één afbeelding. (B) vijf beelden uit een stapel van één afbeelding. (C) het beeld filter gebruikt voor het opsporen van CTB-label Sub cerebrale projectie neuronen. (D) correlatie waarden berekend voor de vijf beelden in (B) met behulp van het filter in (C). (E) voorbeelden van gedetecteerde sub cerebrale projectie neuronen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: representatieve resultaten voor grootschalige imaging. Projectie van de corticale neuronen (groen) waren gelabeld door tdTomato-expressie in Tlx3-cre/Ai9 transgene muizen, en sub cerebrale projectie neuronen (magenta) waren gevisualiseerd door het injecteren van de retrograde tracer CTB488 in de pons op 7 weken leeftijd. De linker hemisfeer werd blootgesteld aan de methode SeeDB en het gebied 1.250 µm tot 2,690 µm laterale en-3,400 µm tot 1.230 µm anterior to van het bregma is gescand met behulp van twee-foton microscopie. (A) bovenaanzicht. Geschatte posities van corticale gebieden werden getoond. (B-D) Schuine weergave van CTB 488 fluorescentie tonen van de sub cerebrale projectie neuronen (B), tdTomato fluorescentie met corticale projectie neuronen (C) en de samengevoegde afbeelding (D). A: Anterior; P: posterior; M: mediaal; D: dorsale. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: hoge vergroting foto's van representatieve resultaten. (A) een optische sectie van de afbeelding in figuur 6D. Afbeelding van dikte = 20 µm. (B) EGFP-label Sub cerebrale projectie neuronen in een heterozygote Crym-egfp muis op 6 weken leeftijd. Afbeelding van dikte = 30 µm. (C) Subcerebral projectie neuronen (magenta) waren gelabeld door het injecteren van CTB488 in de pons C57BL/6J muizen op postnatale dag 49, en het parvalbumin-uiten van cellen (groen) werden door de AbScale methode gevisualiseerd. Afbeelding van dikte = 55 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Fluorophore | Ex. (nm) | Filter (nm) |
| EGFP | 910 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| tdTomato | 1.000 | 578-633 (D605 / 55m, Chroma) |
| Alexa Fluor 488 | 750 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 555 | 750 | 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56, Semrock) |
| DAPI | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock) |
Tabel 1: Excitatie golflengten en filters voor twee-foton microscopie.
Tabel 2: reagentia voor de AbScale methode. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Antigeen | Geïmmuniseerde dieren | Product-ID | Concentratie | 3 mm blok | 500 μm segment |
| NeuN | Muis | MAB377 | 1:500 | ND | + |
| NeuN | Konijn | ABN78 | 1:500 | ND | + |
| CTIP2 | Rat | ab18465 | 1:100 | L1-L6 | + |
| Statb2 | Muis | ab51502 | 1:100 | - | - |
| GAD67 | Muis | MAB5406 | 1:200 | ND | + |
| GABA | Konijn | A2052 | 1:100 | - | - |
| Parvalbumin | Muis | 235 | 1:1000 | ND | + |
| Parvalbumin | Geit | PV-Go-Af460 | 1:100 | L1-L2/3 | + |
| Parvalbumin | Muis | P3088 | 1:1000 | ND | + |
| Parvalbumin | Konijn | ab11427 | 1:500 | ND | - |
| Somatostatine | Konijn | T-4103 | 1:1000 | L1-L2/3 | + |
| c-Fos | Konijn | PC38 | 1:1000 | ND | + |
Tabel 3: penetratie van de geteste antilichamen. Resultaten voor 3 mm dik blokken wordt weergegeven als volgt; L1-L6: penetratie in de hele corticale dikte; L1-L2/3: penetratie tot layer 2/3; -: geen etikettering; ND: niet bepaald. Resultaten voor 500 µm-dikke segmenten wordt weergegeven als volgt; +: uniforme etikettering; -: geen of beperkte labeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben de procedures voor het verkrijgen van grootschalige driedimensionale beelden van de cel type-specifieke organisatie van de grote celtypes in muis neocortical laag 5 ingediend. Vergeleken met de conventionele segment kleuring, is de methode meer nuttig bij het bepalen van de driedimensionale organisatie van de neocortex. De methode kunt image aquisition van de bredere en de diepere hersengebieden in vergelijking met de typische in vivo 2-foton microscopie of conventionele confocale microscopie en, dus, kunnen de uitgebreide analyse van de neocortical cellulaire organisatie.
Een kritieke stap, de methode is de antilichaam-penetratie. Een subset van antistoffen toont slechte penetratie in dikke specimens (tabel 3), en kan daarom niet worden gebruikt voor de AbScale methode. Voor het verkrijgen van uniforme etikettering met de antilichamen die gebruikt in deze studie, bleek het noodzakelijk om de hersenen in 500 µm plakjes snijden. Het gebruik van kleinere fragmenten van antilichaam, bijvoorbeeld Fab of F(ab') 2 fragmenten en/of andere methoden21,22,23,24,25,26, wissen 27,28 kan de resultaten verbeteren.
Antigeen-bindende antilichamenspecificiteit wordt meestal gekenmerkt in plakjes dun weefsel maar kan verschillende in dikke weefsels verwerking voor de clearing. Om te controleren voor antilichamenspecificiteit, wij samen met het label weefsels met tracer injectie en marker genexpressie in transgene dieren en ook uitgevoerd blokkerende experimenten met behulp van de eiwitten en peptiden antigeen14. Deze procedures en control-experimenten met behulp van mutant dieren ontbreekt de doel-antigenen moet zinvol zijn voor het bevestigen van de specificiteit van antilichamen.
Een beperking van de methode is dat sommige vervorming van het model als gevolg van de behandeling van zachte laboratoriummonsters onvermijdelijk. Het verkrijgen van in vivo beelden voorafgaand aan de fixatie en het gebruik van deze beelden, zoals verwijzingen bijdragen zal tot het corrigeren van dergelijke vervormingen.
De huidige procedures werden voor de analyse van neocortical laag 5 ontworpen. Recente analyses hebben gewezen op vele moleculaire merkers die label neuronale celtypes in andere lagen4,5,6,7, en de toepassing van deze makers op de huidige methode kunnen identificatie van belangrijke cellulaire organisatie in andere lagen. Bovendien moet het mogelijk zijn soortgelijke analyses uitvoeren in hersengebieden dan de neocortex en organen dan de hersenen, om te onderzoeken of een precieze cellulaire organisatie vergelijkbaar met microcolumns aanwezig is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Atsushi Miyawaki en Hiroshi Hama voor hun advies over de AbScale experimenten, Charles Yokoyama voor het bewerken van het manuscript, Eriko Ohshima en Miyuki Kishino voor hun technische bijstand. Dit werk werd gesteund door onderzoeksgelden van RIKEN T.H. en Grants-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) van Japan naar T.H. (innovatieve gebieden "Mesoscopische Neurocircuitry"; 22115004) en ZB (25890023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
