Summary
Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.
Abstract
La neocorteccia dei mammiferi è composta di molti tipi di neuroni eccitatori ed inibitori, ognuno con specifiche proprietà elettrofisiologiche e biochimiche, connessioni sinaptiche, e in vivo funzioni, ma loro basic funzionale e anatomica organizzazione dal cellulare alla scala di rete è capita male. Qui descriviamo un metodo per l'imaging tridimensionale dei neuroni fluorescente etichettati attraverso grandi aree del cervello per l'indagine l'organizzazione corticale. Specifici tipi di neuroni sono contrassegnati tramite l'iniezione di traccianti fluorescenti di un neurone retrogradi o l'espressione di proteine fluorescenti in topi transgenici. Campioni di blocco del cervello, per esempio, un emisfero, sono preparati dopo la fissazione, reso trasparenti con tessuto metodi di compensazione e sottoposti a immunolabeling fluorescente dei tipi cellulari specifici. Grandi aree vengono scansionati usando microscopi confocale o due-fotone dotati di grande lavoro distanza obiettivi e fasi motore. Questo metodo può risolvere l'organizzazione periodica dei moduli funzionali di tipo-specific microcolonna di cella nella neocorteccia del mouse. La procedura può essere utile per lo studio di architettura cellulare tridimensionale in aree cerebrali diverse e altri tessuti complessi.
Introduction
La neocorteccia dei mammiferi è composta da un gran numero di tipi di cellule, ognuna con il pattern di espressione genica specifici, proprietà elettrofisiologiche e biochimiche, connessioni sinaptiche, e in vivo funzioni1,2 ,3,4,5,6,7. Se questi tipi di cellule sono organizzati in strutture ripetute è stato poco chiaro. Colonne corticali, comprese le colonne di orientamento visivo e somatosensoriali botti, hanno ripetuto le strutture, ma la loro organizzazione cellulare rimane poco chiaro8,9. Questi sono presenti nelle specifiche aree corticali e non sono un sistema di tutto il cervello.
Nello strato neocortical 5, la grande maggioranza dei neuroni è classificata in quattro tipi principali. Un tipo principale di neuroni eccitatori, neuroni di proiezione Sub-cerebrale, proietta assoni subcortical obiettivi inclusi pons, midollo spinale e il collicolo superiore e, pertanto, rappresenta i principali output corticale via10. Neuroni di proiezione corticale, un altro tipo di neuroni eccitatori, innervano la corteccia10. Neuroni inibitori contengono anche due grandi classi: le cellule che esprimono parvalbumina ed esprimendo la somatostatina11.
Recenti analisi indicano che i tipi di quattro cellule sono organizzati in strutture ripetute12,13,14. Sia sub-cerebrale proiezione neuroni12,13,14 e proiezione corticale neuroni14 organizzare in cellula-tipo microcolonne specifico con un diametro di 1 – 2 celle. Le cellule che esprimono parvalbumina e somatostatina-esprimendo allineare specificamente con microcolonne dei neuroni di proiezione Sub-cerebrale ma non con microcolonne di proiezione corticale neuroni14. Microcolonne stessi allineare periodicamente a forma esagonale della grata di matrice14 e sono presenti in più aree corticali, comprese le zone visivi, somatosensoriali e motori nel cervello del mouse12,14 e in lingua aree del cervello umano13. Neuroni nella microcolonna singolo esibiscono l'attività sincronizzata e avere risposte sensoriali simili14. Queste osservazioni indicano che tipi di cellule strato 5 organizzano in una struttura di reticolo microcolonna che rappresenta l'organizzazione di tutto il cervello nota prima di ripetere moduli funzionali.
Microcolonne hanno un raggio di circa 10 µm e hanno una periodicità spaziale di circa 40 µm. Inoltre, l'orientamento delle microcolonne è parallelo alla loro dendriti apicali e cambia a seconda della loro posizione nella corteccia14. Pertanto, il sistema microcolonna è difficile da analizzare utilizzando fette corticali convenzionale con uno spessore tipico di poche decine di micrometri. Inoltre, l'analisi della periodicità richiede dati tridimensionali da una vasta gamma di aree cerebrali e, pertanto, l'area di imaging tipico di microscopia confocale o in vivo imaging 2-fotone è troppo stretta.
Recentemente, le tecniche sono state sviluppate per deselezionare tessuti spessi15,16. Qui descriviamo l'applicazione di questi metodi per ottenere immagini tridimensionali, su larga scala dei tipi principali delle cellule nello strato neocortical mouse 5 che compongono il sistema microcolonna. Neuroni di proiezione subcerebral sono etichettati dall'etichettatura retrograda o dall'espressione della proteina fluorescente verde avanzata in Crym-egfp topi transgenici12e proiezione corticale neuroni sono etichettati da entrambi il retrogrado etichettatura o dall'espressione del tdTomato Tlx3-cre/Ai9 topi17. Le cellule che esprimono parvalbumina e che esprimono somatostatina sono etichettate da immunohistochemistry. Il metodo (anticorpo scala S) AbScale18 viene utilizzato per l'anticorpo che macchia esperimenti, mentre il metodo SeeDB (vedere cerebrale profonda)19 viene utilizzato per altri esperimenti. Questi metodi superare le suddette difficoltà dei metodi convenzionali di formazione immagine e rivelano l'organizzazione accurata di strato 514.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di esperimenti di RIKEN Wako animale e RIKEN genetico ricombinante esperimento Safety Committee ed eseguite secondo le linee guida istituzionali dell'animale il RIKEN Brain Science: Servizi Istituto.
1. preparazione di Imaging Chambers
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Imaging camera19
- Utilizzando lastre di gomma siliconica, preparare una camera con uno spessore di circa 5 mm e piano lamiere di vari spessori. Inoltre, preparare piatti Petri con e senza un fondo di vetro (Figura 1A).
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Distanziale di fetta
- Preparare i distanziali per contenere campioni, utilizzando lastre di gomma siliconica con uno spessore di 0,5 mm (Figura 1).
2. tracer iniezione
Nota: Fare iniezioni nel collicolo superiore (2.2) o pons (2.1). Iniezione nei neuroni di proiezione Sub-cerebrale di etichetta pons in una regione vasta cervello, comprese le aree visive e motorie, mentre l'iniezione nel collicolo superiore etichette neuroni di proiezione Sub-cerebrale nel campo visivo. Per gli esperimenti di controllo, iniettare soluzione fisiologica invece di subunità di fluorescente etichettati colera tossina B. Per il mantenimento dello stato sterile utilizzare attrezzature sterilizzate e guanti di plastica puliti con etanolo.
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Fare le iniezioni nel ponte di topi adulti.
- Disegnare 1 µ l di subunità di fluorescente etichettati colera tossina B (25 µ g / µ l di PBS) in una siringa Hamilton G 26.
- Posto un iniettore pompa della siringa.
- Posizionare la siringa e la pompa al supporto utensile di un manipolatore posizionato su uno strumento stereotassica. Inclinare il manipolatore 12° posteriormente rispetto all'asse verticale.
- Anestetizzare un topo adulto maschio o femmina (C57BL/6J o Tlx3-cre/Ai9) iniettando sodio pentobarbital intraperitonealmente (60 mg/kg di peso corporeo) o con la somministrazione di isoflurano (2 – 3%). Attendere fino a quando il mouse non fa nessuna risposta quando la coda viene pizzicata con il forcipe, che indica che il mouse è completamente anestetizzato.
- Posizionare il mouse sullo strumento stereotassica.
- Rimuovere accuratamente i capelli con una lama di rasoio per prevenire l'infezione e tagliare 10 mm del cuoio capelluto in modo che il bregma e lambda sono visibili. Somministrare 0,1 mL di lidocaina 1% utilizzando una pipetta. Regolando la posizione verticale del boccaglio sullo strumento stereotassica affinché il bregma e lambda hanno lo stesso livello di z, impostare l'angolo della testa.
- Regolare la posizione del manipolatore facendolo sullo strumento stereotassica in modo che la punta della siringa è vicino il bregma e registrare la posizione del manipolatore. Ritrarre la siringa spostando il portautensile sul manipolatore.
- Spostare il manipolatore 5,4 mm posteriormente e 0,4 mm lateralmente. Avanzare la siringa in modo che la punta si trova vicino al punto di entrata sul cranio. Ritrarre la siringa e segnare il punto di ingresso.
- La posizione contrassegnata, praticare un foro con un diametro di circa 1 mm.
- Inserire la punta della siringa nel foro in modo che la profondità della punta è 6,9 mm più di quella misurata presso il bregma.
- Iniettare 1 µ l di traccianti utilizzando la pompa a 0,2 µ l/min.
- Rimuovere la siringa dal cervello.
- Se necessario, coprire il cervello esposto con piccoli frammenti di microfibrillare emostato e adesivo istantaneo.
- Sciacquare il cervello esposto utilizzando soluzione fisiologica consegnato con una pipetta per prevenire l'infezione e suturare il cuoio capelluto.
- Rimuovere il mouse dallo strumento stereotassica. Consentire il mouse per recuperare dall'anestesia in un incubatore a 30 ˚ c, in genere per 1 h. Non lasciare incustodito il mouse fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Restituire il mouse per la compagnia di altri animali dopo che completamente ha recuperato.
- Mantenere il mouse per 3 – 7 giorni.
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Fare le iniezioni nel collicolo superiore di topi adulti.
- Preparare una pipetta di vetro con un diametro di punta di 30 – 50 µm.
- Connettere la pipetta di vetro una siringa Hamilton attraverso un tubo di plastica (Figura 2A).
- Riempire la pipetta di vetro, tubo di plastica e siringa Hamilton con il liquido paraffina.
- Posto un iniettore pompa della siringa.
- Inserire la pipetta di vetro sul manipolatore e inclinare il manipolatore 60° posteriormente rispetto all'asse verticale (Figura 2B).
- Eseguire 2.1.4–2.1.9. La posizione del manipolatore è 1,4 mm posteriore, laterale di 0,5 mm per l'espressione lambda.
- Posizionare una pellicola di plastica piccolo paraffina sul cranio, quindi mettere circa 1 µ l della soluzione tracciante su di esso. Avanzare la pipetta di vetro e riempirlo con almeno 0,5 µ l della soluzione tracciante rapidamente.
- Inserire la pipetta di vetro in modo che la profondità di punta è di 3,0 mm dalla superficie del cervello.
- Iniettare 0,5 µ l di traccianti utilizzando la pompa a 0,2 µ l/min.
- Rimuovere la pipetta di vetro dal cervello.
- Eseguire 2.1.13–2.1.16.
3. fissazione e rifilatura
- Iniettare per via intraperitoneale sodio pentobarbital (60 mg/kg di peso corporeo) in un mouse (C57BL/6J o Tlx3-cre/Ai9, con o senza l'iniezione tracciante come descritto nel passaggio 2. Attendere fino a quando il mouse non fa nessuna risposta quando la coda viene pizzicata con il forcipe, che indica che il mouse è completamente anestetizzato.
- Eutanasia il mouse umanamente irrorando il mouse via20 con soluzione fisiologica allo 0,9%.
- Difficoltà il mouse20 irrorando paraformaldeide al 4% (PFA) in 0.1 M tampone fosfato (pH 7.5).
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Tagliare il cuoio capelluto utilizzando un paio di forbici per esporre il cranio come descritto20.
- Tagliare la linea mediana del cranio esposto utilizzando un paio di forbici. Rimuovere il cranio usando il forcipe.
- Se contrassegnare la posizione del bregma e lambda è necessario, prima di rimuovere un emisfero del cranio. Inserire gli aghi sottili di tungsteno nel cervello alle posizioni del bregma e lambda sul cranio restanti sul cervello, quindi rimuovere il cranio rimanente.
Nota: Il cervello possa essere memorizzato in PBS a 4 ˚ c.
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Per eseguire la macchiatura dell'anticorpo dei neuroni inibitori, tagliare a fette i campioni di cervello.
- Posizionare il campione di cervello su un vibratomo.
- Tagliate le fette fino a 500 µm di spessore in PBS a temperatura ambiente e procedere al passaggio 5 (il AbScale metodo).
- Se la macchiatura dell'anticorpo è necessaria, trim il campione di cervello a blocchi (fino a 3 mm di spessore) con una lama di rasoio (Figura 3) e procedere al passaggio 4 (metodo SeeDB).
Nota: Il cervello possa essere memorizzato in PBS a 4 ° C dopo il taglio o rifilatura. Il metodo di SeeDB è preferibile quando la macchiatura dell'anticorpo non è necessaria perché richiede meno tempo rispetto al metodo dil. e AbSca.
4. compensazione senza anticorpi (metodo SeeDB)
- Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 20% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 40% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 60% (p/v) di fruttosio e incubare per 4 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 80% (w/v) di fruttosio e incubare per 12 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica da 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 100% (p/v) di fruttosio e incubare per 12 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Trasferire il campione con una spatola per un tubo di plastica di 50 mL contenente 20 mL di 0.5% α-thioglycerol e 80,2% di fruttosio (w/w) e incubare per 24 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
Nota: Maneggiare il campione accuratamente per evitare deformazioni più piccolo possibile. Non Incubare i campioni più lunghi rispetto a quanto indicato, come campioni possono rapidamente diventare opachi. - Incorporare il campione in una camera di imaging riempita con la soluzione di fruttosio 80,2% (Figura 1B). Se necessario, correggere l'esempio mettendo piccoli pezzi di adesivo di gomma intorno. Se la camera è troppo profonda, mettere un piatto piano in Aula prima di mettere i campioni.
- Mettere la capsula di Petri con un coperchio di vetro sulla camera imaging e mettere l'acqua nel piatto e immagine mediante microscopia confocale o due fotoni con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga. Lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione filtri sono descritti nella tabella 1. Se necessario, utilizzare un tavolino motorizzato.
5. schiarimento con anticorpo che macchia (il AbScale metodo)
- Preparare i reagenti come descritto in tabella 2.
- Trasferire le fette con una spatola per un tubo di plastica da 5 mL contenente 4 mL di soluzione di Sca/eS0 e li Incubare per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C (Figura 4B).
- Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eA2 e incubare le fette per 36 h con agitazione delicata a 37 ° C.
- Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eB4 e incubare le fette per 24 h con agitazione delicata a 37 ° C.
- Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca/eA2 e incubare le fette per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C.
- Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di PBS e incubare le fette per 6 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 2 mL con una spatola.
- Incubare con gli anticorpi primari (tabella 3) in 1 mL di soluzione di AbScale per 48-72 h a 37 ° C (Figura 4) con agitazione delicata.
- Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 5 mL con una spatola.
- Incubare in 4 mL di soluzione di AbScale per 2 h 2 volte a temperatura ambiente con agitazione delicata.
- Rimuovere con cautela le fette di un tubo di plastica da 2 mL con una spatola.
- Incubare con anticorpi secondari con etichetta fluorescente (Tabella materiali, 1: 100) in 1 mL di soluzione di AbScale per 48 h a 37 ° C con agitazione delicata.
- Rimuovere le fette con una spatola per un tubo di plastica da 5 mL contenente 4 mL della soluzione elAbSca con cautela e incubare le fette per 6 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL della soluzione elAbSca e incubare le fette per 2 h 2 volte con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di 4% PFA e incubare le fette per 1 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta e aggiungere 4 mL di PBS e incubare le fette per 1 h con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione dal tubo usando una pipetta, aggiungere 4 mL di soluzione di Sca-eS4 e incubare le fette per 12 h con agitazione delicata a 37 ° C.
- Posizionare il distanziale su un vetrino e mettere le fette nel distanziale e immergere le fette con Sca-eS4 soluzione. Sigillare il distanziatore con un vetro di copertura (Figura 1).
- Mettere l'acqua sul vetro di copertura e immagine mediante microscopia confocale o due fotoni con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga. Se necessario, utilizzare un tavolino motorizzato.
Nota: Controllare se le parti profonde del campione sono etichettate allo stesso modo per le parti superficiali per confermare l'assenza di una significativa distorsione d'etichettatura.
Nota: La penetrazione degli anticorpi testati è descritto nella tabella 3.
6. determinazione della posizione di cella
- Per ciascuna posizione in immagini digitalizzate, calcolare i valori di correlazione utilizzando un'immagine tridimensionale filtro14 (Figura 5A-5D).
- Determinare le posizioni dei picchi del valore di correlazione (Figura 5).
- Indagare le immagini intorno alle cime per individuare le celle (Figura 5E).
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Representative Results
Abbiamo etichettato neuroni di proiezione corticale di espressione di tdTomato in Tlx3-cretopi transgenici /Ai9 e visualizzati i neuroni di proiezione Sub-cerebrale iniettando il tracciante retrogrado CTB488 nel ponte. L'emisfero sinistro del cervello è stato sottoposto al metodo SeeDB e scansionati usando un microscopio a due fotoni dotato di un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga (25 X, N.A. 1.1, distanza di lavoro 2 mm) e un tavolino motorizzato. Una pila di 401 immagini (512 x 512 pixel; pixel size = 0.99 µm) z-Step = 2.8 µm a ciascuno dei 30 posizioni di scansione è stato ottenuto. I corpi cellulari dei due tipi cellulari erano visibili sopra una vasta gamma di aree cerebrali (Figura 6) e le sezioni ottiche ha mostrate microcolonne periodico (figura 7A). Inoltre, i cervelli dei topi Crym-egfp (mantenuti come eterozigoti con uno sfondo di C57BL/6J) sono stati liquidati con il metodo SeeDB ed imaged come sopra. I corpi cellulari e apicale dendriti dei neuroni di proiezione Sub-cerebrale che esprimono EGFP erano visibili nelle sezioni ottiche (figura 7B).
Abbiamo anche effettuato etichettatura retrograda dei neuroni di proiezione Sub-cerebrale in topi C57BL/6J utilizzando CTB488. Il cervello fisso è stato tagliato a fette coronali con uno spessore di circa 500 µm e sottoposte al metodo dell'AbScale, per marcare le cellule che esprimono parvalbumina (Anti-parvalbumina, 1: 1000; Anti-mouse IgG-fluorescente etichettato,). Stack di immagini (512 x 512 pixel, dimensione del pixel = 1,24 µm; z-passo = 2.17 µm, 268 immagini/stack) sono stati ottenuti usando la microscopia confocal con un'immersione in acqua-obiettivo di distanza di funzionamento lunga (20 X, 1.0 N.A., distanza di lavoro 2 mm). Neuroni di proiezione Sub-cerebrale e cellule che esprimono parvalbumina erano entrambi visibili nelle fette (Figura 7).
Figura 1: Imaging chambers e distanziali. Parte superiore (A): fatto a mano con fondo di vetro della piastra di Petri (a destra) e una capsula di Petri senza un fondo di vetro (a sinistra). Fondo: Una camera (a destra) e le piastre del pavimento (a sinistra) in strati di silicone. (B) un emisfero del mouse sottoposta al metodo del SeeDB dopo iniezione di CTB555 nel collicolo superiore è impostato nella camera. Il campione è stato risolto con un pezzo di adesivo riutilizzabile. Vetrino (C), A (in alto) e un distanziatore in un foglio di silicone con uno spessore di 0,5 mm (in basso). (D) due fette della corona del cervello del mouse sono stati impostati nel distanziatore e coperto con un vetro di copertura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: iniezione dell'elemento tracciante. (A) A pipetta di vetro collegato ad una siringa Hamilton attraverso un tubo di plastica. (B), un mouse è posizionato su uno strumento stereotassica. La pipetta di vetro viene inclinata a 60° circa posteriormente rispetto all'asse verticale per iniezione nel collicolo superiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: taglio di campioni del cervello. (A) campione intero cervello dopo l'iniezione di CTB555 nel collicolo superiore e fissazione. Il bregma e lambda sono stati contrassegnati con aghi di tungsteno (frecce). (B), lo stesso campione tagliato per ottenere un emisfero. Si noti che gli aghi di tungsteno rimangono (frecce). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immersione di campioni di cervello in soluzioni per i metodi di elSeeDB e AbSca. (A) un campione di emisfero immerso in 0,5% α-thioglycerol e fruttosio 20% (p/v) per il metodo di SeeDB. (B) fette coronali immerse nella soluzione di Sca/eA2 per il metodo dil. e AbSca. (C) fette coronali immerse nella AbScale soluzione contenente anticorpi per il metodo dil. e AbSca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: determinazione delle posizioni cell. Neuroni di proiezione Sub-cerebrale sono stati etichettati, iniettando il tracciante retrogrado CTB488 in ponte a 5 settimane dell'età. L'emisfero sinistro è stato sottoposto al metodo SeeDB e scansionato con microscopia del due-fotone (512 x 512 pixel, dimensione del pixel = 0.99 µm; z-passo = 2,8 µm, 601 immagini/stack). (A), A immagine singola. (B) cinque immagini da una pila di singola immagine. (C) l'immagine filtro utilizzato per rilevare i neuroni di proiezione Sub-cerebrale con etichetta CTB. (D) i valori di correlazione calcolata per le cinque immagini in (B) utilizzando il filtro in (C). (E) esempi di neuroni di proiezione Sub-cerebrale rilevato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: risultati rappresentativi dell'imaging su larga scala. Neuroni di proiezione corticale (verdi) sono stati etichettati da tdTomato-espressione di Tlx3-cre/Ai9 topi transgenici, e neuroni di proiezione Sub-cerebrale (magenta) sono stati visualizzati iniettando il tracciante retrogrado CTB488 ponte a 7 settimane di età. L'emisfero sinistro è stato sottoposto al metodo SeeDB e la zona 1.250 µm a 2.690 µm laterale e-3,400 µm a 1.230 µm anteriormente il bregma è stati digitalizzati usando microscopia del due-fotone. Vista superiore (A). Posizione approssimative delle zone corticali sono stati indicati. (B–D) Vista obliqua della fluorescenza CTB 488 risultati neuroni di proiezione Sub-cerebrale (B), tdTomato fluorescenza mostrando neuroni di proiezione corticale (C) e l'immagine unita (D). R: anteriore; P: posteriore; M: mediale; D: dorsale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: fotografie ad alto ingrandimento di risultati rappresentativi. (A) una sezione ottica dell'immagine nella Figura 6. Immagine di spessore = 20 µm. (B) neuroni di proiezione Sub-cerebrale EGFP-identificato in un topo eterozigote Crym-egfp a 6 settimane dell'età. Spessore di immagine = 30 µm. (C) proiezione Subcerebral neuroni (magenta) sono stati etichettati iniettando CTB488 nel ponte dei topi C57BL/6J al giorno postnatale 49 e che esprimono parvalbumina cellule (verde) sono state visualizzate dal metodo elAbSca. Spessore di immagine = 55 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Fluoroforo | Es (nm) | Filtro (nm) |
| EGFP | 910 | 500-550 (FF03-525-25/50, Semrock) |
| tdTomato | 1.000 | 578-633 (D605 / 55m, Chroma) |
| Alexa Fluor 488 | 750 | 500-550 (FF03-525-25/50, Semrock) |
| Alexa Fluor 555 | 750 | 563-588 (FF03-575-25/25, Semrock) |
| Alexa Fluor 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56, Semrock) |
| DAPI | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock) |
Tabella 1: Lunghezze d'onda di eccitazione e filtri per microscopia del due-fotone.
Tabella 2: reagenti per il metodo di e AbScal. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
| Antigene | Animali immunizzati | ID prodotto | Concentrazione | blocco di 3 mm | Fetta di 500 μm |
| NeuN | Mouse | MAB377 | 1: 500 | ND | + |
| NeuN | Coniglio | ABN78 | 1: 500 | ND | + |
| CTIP2 | Ratto | ab18465 | 1: 100 | L1-L6 | + |
| Statb2 | Mouse | ab51502 | 1: 100 | - | - |
| GAD67 | Mouse | MAB5406 | 1: 200 | ND | + |
| GABA | Coniglio | A2052 | 1: 100 | - | - |
| Parvalbumina | Mouse | 235 | 1: 1000 | ND | + |
| Parvalbumina | Capra | PV-Go-Af460 | 1: 100 | L1-L2/3 | + |
| Parvalbumina | Mouse | P3088 | 1: 1000 | ND | + |
| Parvalbumina | Coniglio | ab11427 | 1: 500 | ND | - |
| Somatostatina | Coniglio | T-4103 | 1: 1000 | L1-L2/3 | + |
| c-Fos | Coniglio | PC38 | 1: 1000 | ND | + |
Tabella 3: penetrazione degli anticorpi testati. Risultati per blocchi di spessore mm 3 viene visualizzato come segue; L1-L6: penetrazione nello spessore dell'intero corticale; L1-L2/3: penetrazione fino a layer 2/3; -: nessuna etichettatura; ND: non determinato. Risultati per 500 µm di spessore fette viene visualizzato come segue; +: etichettatura uniforme; -: nessuna o limitata etichettatura.
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Discussion
Abbiamo presentato le procedure per ottenere immagini tridimensionali su larga scala dell'organizzazione cellulare specifico del tipo dei tipi principali delle cellule nello strato neocortical mouse 5. Rispetto alla fetta convenzionale macchiatura, il metodo è più utile nel determinare l'organizzazione tridimensionale della neocorteccia. Il metodo consente acquisizione immagini dalla più ampia e le regioni del cervello più profonde rispetto al tipico in vivo microscopia 2-fotone o microscopia confocale convenzionale e, quindi, possono permettere l'analisi completa del cellulare neocortical organizzazione.
Un passaggio fondamentale del metodo è la penetrazione dell'anticorpo. Un sottoinsieme degli anticorpi Mostra scarsa penetrazione nella spessi esemplari (tabella 3) e, pertanto, non può essere utilizzato per il metodo dil. e AbSca. Per ottenere l'etichettatura uniforme con gli anticorpi utilizzati in questo studio, è stato necessario tagliare il cervello a 500 µm fette. L'uso di più piccoli frammenti di anticorpo, per esempio, Fab F(ab') 2 frammenti e/o altri metodi21,22,23,24,25,26, di compensazione 27,28 può migliorare i risultati.
Specificità dell'anticorpo antigene-legante è caratterizzato solitamente in fettine di tessuto sottile ma potrebbero essere diversi in tessuti spessi elaborati per schiarimento. Per controllare la specificità dell'anticorpo, abbiamo co-etichettato tessuti con tracciante iniezione e indicatore di espressione genica in animali transgenici e anche eseguiti esperimenti di blocchi utilizzando antigene proteine e peptidi14. Tali procedure e gli esperimenti di controllo utilizzando animali mutanti carenti gli antigeni bersaglio dovrebbe essere utili per confermare la specificità degli anticorpi.
Una limitazione del metodo è che qualche deformazione del provino è inevitabile dovuto la manipolazione dei campioni di massa morbida. Come ottenere immagini in vivo prima della fissazione e utilizzare queste immagini come riferimenti aiuterà a correggere tali deformazioni.
Le procedure presenti sono state progettate per l'analisi dello strato neocortical 5. Recenti analisi hanno identificato molti marcatori molecolari che tipi di un neurone delle cellule di etichetta in altri strati4,5,6,7, e l'applicazione di questi creatori per il presente metodo può consentire identificazione di importante organizzazione cellulare negli altri strati. Inoltre, dovrebbe essere possibile eseguire analisi simili nelle regioni del cervello diverso da neocorteccia e in altri organi rispetto al cervello, di indagare se una precisa organizzazione cellulare simile a microcolonne è presente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Atsushi Miyawaki e Hiroshi Hama per i loro consigli sugli esperimenti elAbSca, Charles Yokoyama per l'editing del manoscritto, Eriko Ohshima e Miyuki Kishino per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di ricerca da RIKEN T.H. e localizzativi per ricerca scientifica dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT) del Giappone di T.H. (aree Innovative "Mesoscopiche neurocircuiti"; 22115004) e S.S. (25890023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
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