Summary
Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.
Abstract
Säugetier-Neocortex besteht aus vielen Arten von erregenden und hemmenden Neuronen, mit jeweils spezifischen elektrophysiologische und biochemischen Eigenschaften, synaptischen Verbindungen und in Vivo Funktionen, aber ihre grundlegende funktionelle und anatomische Organisation von zellulären Netzwerk maßstabsgetreu ist wenig bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode für die dreidimensionale Bildgebung von eindringmittel beschriftet Neuronen über große Bereiche des Gehirns für die Untersuchung der kortikalen zelluläre Organisation. Bestimmte Arten von Neuronen sind durch die Injektion von fluoreszierenden retrograde neuronaler Tracer oder Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen bei transgenen Mäusen beschriftet. Block Gehirn Proben, z. B. eine Halbkugel, zubereitet nach der Fixierung mit Gewebe clearing Methoden transparent gemacht und fluoreszierende Immunolabeling der spezifischen Zelltypen unterzogen. Große Flächen werden gescannt, konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit großen Arbeiten Abstand Ziele und motorisierte Stufen ausgestattet. Die regelmäßige Organisation der Zelle typspezifischen Microcolumn Funktionsmodule in der Maus Neocortex kann mit dieser Methode beheben. Das Verfahren kann für das Studium der dreidimensionalen zellulären Architektur in den verschiedenen Hirnarealen und anderen komplexen Geweben nützlich sein.
Introduction
Der Säugetier-Neocortex besteht aus eine Vielzahl von Zelltypen, die jeweils mit spezifischen gen Expressionsmuster, elektrophysiologische und biochemischen Eigenschaften, synaptischen Verbindungen und Funktionen in Vivo 1,2 ,3,4,5,6,7. Ob dieser Zelltypen in wiederholten Strukturen organisiert sind war ungeklärt. Kortikale Säulen, einschließlich visuelle Orientierung Spalten und somatosensorischen Fässer haben Strukturen wiederholt, aber ihre zelluläre Organisation bleibt unklar8,9. Diese sind in der kortikalen Bereiche und sind kein Gehirn-System.
In neokortikalen Schicht 5 sind die große Mehrheit der Neuronen in vier Haupttypen eingeteilt. Eine wichtige Art von exzitatorischen Neuronen, Sub-zerebrale Projektion Neuronen Axone, subkortikale Ziele einschließlich der Pons, Rückenmark und Colliculus superior-Projekte und stellt daher, die größeren kortikalen Ausgang Weg10. Kortikalen Projektion Neuronen, eine weitere wichtige Art von exzitatorischen Neuronen innervieren den Kortex-10. Hemmende Neuronen enthalten auch zwei Hauptgruppen: Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen11.
Jüngste Analysen deuten darauf hin, dass die vier Zelltypen in wiederholten Strukturen12,13,14organisiert sind. Sub-zerebrale Projektion Neuronen12,13,14 und kortikalen Projektion Neuronen14 organisieren in Zelltyp spezifische Microcolumns mit einem Durchmesser von 1 – 2 Zellen. Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen richten Sie speziell mit Microcolumns von Sub-zerebrale Projektion Neuronen, aber nicht mit Microcolumns von kortikalen Projektion Neuronen14. Microcolumns selbst ausrichten in regelmäßigen Abständen in Form eines sechseckigen Gitter Array14 und sind in mehrere kortikalen Bereiche einschließlich visuelle, somatosensorische und motorische Bereichen Maus Gehirn12,14 und in Sprache Bereiche des menschlichen Gehirns13. Neuronen in den einzelnen Microcolumn synchronisierte Aktivität aufweisen und haben ähnliche sensorischen Antworten14. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Schicht 5 Zelltypen in einer Microcolumn Gitterstruktur repräsentieren die erste bekannte Gehirn-weiten Organisation wiederholen Funktionsmodule zu organisieren.
Microcolumns haben einen Radius von ca. 10 µm und eine räumliche Periodizität von etwa 40 µm. Darüber hinaus ist die Ausrichtung des Microcolumns parallel zu ihrer apikalen Dendriten und ändert sich je nach ihrer Position in der Kortex-14. Das Microcolumn System ist daher schwer zu analysieren, mit herkömmlichen kortikalen Scheiben mit einer typischen Dicke von ein paar Dutzend Mikrometer. Darüber hinaus die Analyse der Periodizität erfordert dreidimensionale Daten aus einer Vielzahl von Hirnareale und daher die typische imaging-Bereich der konfokalen Mikroskopie oder in Vivo 2-Photonen-Bildgebung ist zu schmal.
Vor kurzem haben Techniken entwickelt worden, um Dicke Gewebe15,16zu löschen. Hier beschreiben wir die Anwendung dieser Methoden auf groß angelegte, dreidimensionale Bilder der wichtigsten Zelltypen in Maus neokortikalen Schicht 5 erhalten, aus die das Microcolumn-System besteht. Subcerebral Projektion Neuronen sind gekennzeichnet durch die retrograde Beschriftung oder den Ausdruck das erhöhte grün fluoreszierende Protein in Crym-Egfp Transgene Mäuse12und kortikalen Projektion Neuronen durch entweder die retrograde beschriftet sind Kennzeichnung oder durch den TdTomato Ausdruck im Tlx3-Cre/Ai9 Mäuse17. Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen sind von Immunohistochemistry bezeichnet. (Antikörper Skala S) AbScale Methode18 dient für den Antikörper Experimente, Färbung, während die SeeDB (siehe Deep Brain) Methode19 für andere Experimente verwendet wird. Diese Methoden der konventionellen bildgebenden Verfahren die oben genannten Schwierigkeiten überwinden und zeigen die genaue zelluläre Organisation der Schicht 514.
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Protocol
Alle experimentelle Verfahren wurde vom RIKEN Wako Animal Experimente Committee und RIKEN genetische rekombinante Experiment Safety Committee genehmigt und durchgeführt nach den institutionellen Richtlinien der Tierhaltung des RIKEN Brain Science Institut.
1. Vorbereitung von Imaging-Kammern
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Imaging-Kammer19
- Mit Silikon-Beläge, bereiten Sie eine Kammer mit einer Dicke von ca. 5 mm und Boden Platten in verschiedenen stärken. Darüber hinaus bereiten Sie Petrischalen mit und ohne einem Glasboden (Abbildung 1A).
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Slice-Abstandhalter
- Bereiten Sie Abstandhalter für Samples, mit Silikon-Beläge mit einer Dicke von 0,5 mm (Abbildung 1).
(2) Tracer Injektion
Hinweis: Stellen Sie Injektionen in der Pons (2.1) oder superior Colliculus (2.2). Injektion in den Pons Label Sub zerebralen Projektion Neuronen in einem breiten Hirnregion einschließlich der visuellen und motorischen Bereiche während der Injektion in die superior Colliculus Labels Sub zerebralen Projektion Neuronen im visuellen Bereich. Injizieren Sie für Experimente Kochsalzlösung statt eindringmittel beschriftet Cholera Toxin Untereinheit B. Verwenden Sie für die Wartung von sterilem Zustand sterilisierte Geräte und Plastikhandschuhe mit Ethanol gereinigt.
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Machen Sie Injektionen in der Pons Erwachsener Mäuse.
- 1 µL eindringmittel beschriftet Cholera Toxin Untereinheit B zu zeichnen (25 µg/µL mit PBS-Puffer) in eine 26 G Hamilton-Spritze.
- Legen Sie eine Einspritzpumpe auf die Spritze.
- Legen Sie die Spritze und Pumpe auf dem Werkzeugträger eines Manipulator, platziert auf einem stereotaktischen Instrument. Kippen Sie den Manipulator 12° nach hinten aus der vertikalen Achse.
- Betäuben Sie eine männliche oder weibliche Erwachsene Maus (C57BL/6J oder Tlx3-Cre/Ai9) durch die intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht) oder durch die Gabe von Isofluran (2 – 3 %). Warten Sie, bis die Maus macht keine Antwort, wenn seine Rute eingeklemmt ist, mit der Pinzette, darauf hinweist, dass die Maus vollständig betäubt ist.
- Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem stereotaktischen Instrument.
- Entfernen Sie vorsichtig die Haare mit einer Rasierklinge um Infektionen zu verhindern und 10 mm von der Kopfhaut zu schneiden, so dass die Bregma und Lambda sichtbar sind. Verabreichen Sie 0,1 mL von 1 % Lidocain mit einer Pipette. Legen Sie den Winkel des Kopfes, die vertikale Position des Mundstücks auf dem stereotaktischen Instrument so angepasst, dass die Bregma und Lambda die gleichen Z-Ebene haben.
- Passen Sie die Position des Manipulators am stereotaktischen Gerät schieben, so dass die Spitze der Spritze in der Nähe der Bregma und zeichnen Sie die Position des Manipulators. Ziehen Sie die Spritze durch Verschieben der Werkzeughalter auf dem Manipulator.
- Verschieben den Manipulator 5,4 mm nach hinten und 0,4 mm seitlich. Voraus die Spritze, so dass die Spitze in der Nähe der Einstiegspunkt auf dem Schädel ist. Ziehen Sie die Spritze und markieren Sie den Eintrittspunkt.
- Bohren Sie an der markierten Stelle ein Loch mit einem Durchmesser von ca. 1 mm.
- Legen Sie die Spitze der Spritze durch das Loch, so dass die Spitze Tiefe 6,9 mm ist mehr als, dass bei der Bregma gemessen.
- 1 µL Tracer mit der Pumpe bei 0,2 µL/min zu injizieren.
- Ziehen Sie die Spritze aus dem Gehirn.
- Bei Bedarf decken Sie die exponierten Gehirn mit kleine Fragmente von mikrofibrillären Gefäßklemme und Sekundenkleber.
- Spülen Sie die exponierten Gehirn mit Kochsalzlösung mit einer Pipette geliefert um Infektionen zu verhindern und die Kopfhaut Naht.
- Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Gerät. Lassen Sie die Maus wieder aus der Narkose in einem Inkubator bei 30 ° c, in der Regel für 1 h. Nicht unbeaufsichtigt lassen die Maus bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Zurückzugeben Sie die Maus an die Gesellschaft anderer Tiere, nachdem es vollständig erholt hat.
- Halten Sie die Maus für 3 – 7 Tage.
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Machen Sie Injektionen in den superior Colliculus Erwachsener Mäuse.
- Bereiten Sie eine Glaspipette mit einem Durchmesser von 30 – 50 µm.
- Verbinden Sie die Glaspipette mit einer Hamilton-Spritze durch ein Kunststoffrohr (Abbildung 2A).
- Füllen Sie die Glaspipette, Kunststoffrohr und Hamilton Spritze mit Paraffin Flüssigkeit.
- Legen Sie eine Einspritzpumpe auf die Spritze.
- Der Manipulator der Glaspipette aufsetzen und Kippen des Manipulators 60° nach hinten aus der vertikalen Achse (Abb. 2 b).
- Führen Sie 2.1.4–2.1.9. Die Position des Manipulators ist 1,4 mm posterior, 0,5 mm seitlich an den Lambda-Ausdruck.
- Legen Sie einen kleine Kunststoff-Paraffin-Film auf den Schädel, dann setzen Sie ca. 1 µL Tracer Lösung auf. Schnell die Glaspipette voraus und füllen Sie ihn mit mindestens 0,5 µL Tracer-Lösung.
- Fügen Sie die Glaspipette, sodass die Spitze Tiefe 3,0 mm von der Oberfläche des Gehirns ist.
- 0,5 µL Tracer mit der Pumpe bei 0,2 µL/min zu injizieren.
- Die Glaspipette aus dem Gehirn zu entfernen.
- Führen Sie 2.1.13–2.1.16.
(3) Fixierung und trimmen
- Verleihen Sie Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal eine Maus (C57BL/6J oder Tlx3-Cre/Ai9, mit oder ohne die Tracer-Injektion wie in Schritt 2 beschrieben. Warten Sie, bis die Maus macht keine Antwort, wenn seine Rute eingeklemmt ist, mit der Pinzette, darauf hinweist, dass die Maus vollständig betäubt ist.
- Einschläfern der Maus menschlich von Vorrichtung die Maus Transcardially20 mit 0,9 % Kochsalzlösung.
- Fix die Maus20 durch Vorrichtung 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5).
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Schneiden Sie die Kopfhaut mit einer Schere, um den Schädel wie beschrieben20verfügbar zu machen.
- Schneiden Sie die Mittellinie des freigelegten Schädel mit einer Schere. Entfernen Sie den Schädel mit Pinzette.
- Wenn markiert die Position des Bregma und Lambda notwendig ist, entfernen Sie zunächst eine Hemisphäre des Schädels. Legen Sie dünne Wolfram Nadeln in das Gehirn an den Stellen der Bregma und Lambda auf dem Schädel noch auf das Gehirn, dann entfernen Sie die restlichen Schädel.
Hinweis: Das Gehirn kann mit PBS-Puffer bei 4 ° c gespeichert werden.
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Um durchzuführen Antikörper Färbung der hemmenden Neuronen, schneiden Sie die Gehirn-Muster in Scheiben.
- Legen Sie die Gehirn-Probe auf einem Vibratome.
- Scheiben Sie bis zu 500 µm Dicke mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur und fahren Sie mit Schritt 5 (AbScale-Methode).
- Wenn Antikörper Färbung nicht erforderlich ist, trim zu Probe Gehirn blockiert (bis zu 3 mm dick) mit einer Rasierklinge (Abbildung 3) und fahren Sie mit Schritt 4 (SeeDB-Methode).
Hinweis: Das Gehirn kann mit PBS-Puffer bei 4 ° C nach dem Schneiden oder Trimmen gespeichert werden. Die SeeDB-Methode ist vorzuziehen, wenn Antikörper Färbung nicht notwendig ist, denn es weniger Zeit als die AbSca-l-e-Methode erfordert.
4. löschen ohne Antikörper Färbung (SeeDB Methode)
- Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 20 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 40 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 60 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 80 % (w/V) Fruktose enthält und 12 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 100 % (w/V) Fruktose enthält und 12 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 80,2 % (w/w) Fruktose enthält und 24 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Behandeln Sie die Probe sorgfältig, um Verformungen so gering wie möglich zu halten. Inkubieren Sie Proben länger als angegeben, nicht als Proben schnell undurchsichtig werden können. - Betten Sie die Probe in einer bildgebenden Kammer gefüllt mit 80,2 % Fructose-Lösung (Abbildung 1 b). Gegebenenfalls zu beheben die Probe indem man kleine Stücke von Kautschukkleber um. Wenn die Kammer zu tief ist, legen Sie eine Bodenplatte in der Kammer vor den Proben.
- Die Petrischale mit einer Glasabdeckung auf der bildgebenden Kammer legen Sie und Wasser in die Schüssel und Bild eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit. Erregung Wellenlängen und Emission Filter sind in Tabelle 1beschrieben. Verwenden Sie ggf. eine motorisierte Bühne.
(5) Clearing mit Antikörper Färbung (AbScale-Methode)
- Bereiten Sie Reagenzien, wie in Tabelle 2beschrieben.
- Übertragen Sie die Scheiben mit einem Spatel zu einer 5 mL-Kunststoff-Rohr mit 4 mL des Sca/eS0 Lösung und inkubieren sie 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° C (Abbildung 4 b).
- Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL Sca/eA2 Lösung hinzugeben und die Scheiben für 36 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren
- Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL Sca/eB4-Lösung und inkubieren die Scheiben für 24 h mit sanft schütteln bei 37 ° c
- Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL Sca/eA2 Lösung hinzugeben und die Scheiben für 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren
- Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL PBS hinzu und inkubieren Sie die Scheiben für 6 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 2 mL-kunststofftube mit einem Spatel.
- Brüten Sie mit Primärantikörpern (Tabelle 3) in 1 mL AbScale Lösung für 48-72 h bei 37 ° C (Abbildung 4) mit sanft schütteln.
- Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 5 mL-kunststofftube mit einem Spatel.
- Brüten Sie in 4 mL AbScale Lösung für 2 h 2 Mal bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.
- Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 2 mL-kunststofftube mit einem Spatel.
- Inkubieren Sie mit fluoreszent-markierten Sekundärantikörper (Table of Materials, 1: 100) in 1 mL AbScale Lösung für 48 h bei 37 ° C mit sanft schütteln.
- Vorsichtig die Scheiben mit einem Spatel zu einer 5 mL-Kunststoff-Rohr mit 4 mL der AbScale Lösung zu entfernen und die Scheiben für 6 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL AbScale Lösung hinzugeben und die Scheiben für 2 h 2 Mal mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL 4 % PFA und die Scheiben für 1 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL PBS hinzu und inkubieren Sie die Scheiben für 1 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL der Sca/eS4 Lösung hinzufügen und die Scheiben für 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren
- Legen Sie das Distanzstück auf einen Glasobjektträger und legen Sie die Scheiben in der Abstandhalter und Tauchen Sie die Scheiben mit Sca/eS4 Lösung ein. Versiegeln Sie das Distanzstück mit einem Deckglas (Abbildung 1).
- Das Deckglas und Bild eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit setzen Sie Wasser auf. Verwenden Sie ggf. eine motorisierte Bühne.
Hinweis: Überprüfen Sie, ob die tiefen Teile der Probe zu den oberflächlichen teilen, ohne eine deutliche Kennzeichnung Voreingenommenheit bestätigen ähnlich beschriftet werden.
Hinweis: Die Durchdringung der getesteten Antikörper ist in Tabelle 3beschrieben.
6. Zelle Positionsbestimmung
- Berechnen Sie für jede Position in den gescannten Bildern Korrelationswerte mithilfe ein dreidimensionales Bild Filter14 (Abb. 5A-5D).
- Bestimmen der Gipfel der Korrelationswert (Abbildung 5).
- Untersuchen Sie Bilder rund um die Gipfel, Zellen (Abb. 5E) zu finden.
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Representative Results
Wir beschriftet kortikalen Projektion Neuronen durch Expression von TdTomato in Tlx3-Cre/Ai9 Transgene Mäuse und Sub-zerebrale Projektion Neuronen durch die Injektion der retrograden Tracers CTB488 in der Pons visualisiert. Die linke Hemisphäre des Gehirns wurde an die SeeDB-Methode unterzogen und mit einem zwei-Photonen-Mikroskop verfügt über eine lange Distanz Ziel arbeiten Wasserlagerung gescannt (25 X, N.A. 1.1, Arbeitsabstand 2 mm) und einem motorisierten Stadium. Ein Stapel von 401 Bilder (512 x 512 Pixel, Pixel-Größe = 0,99 µm) bei Z-Step = 2,8 µm bei jedem der 30 Positionen Scannen wurde erhalten. Die Zellkörper der zwei Zelltypen waren über einen weiten Bereich der Hirnareale (Abbildung 6) und optischen Abschnitte zeigten periodischen Microcolumns (Abb. 7A) sichtbar. Darüber hinaus wurden die Gehirne von Crym-Egfp -Mäusen (gepflegt als heterozygoten mit C57BL/6J Hintergrund) durch die SeeDB-Methode und wie oben abgebildet. Die Zellkörper und apikalen Dendriten EGFP exprimierenden Sub zerebralen Projektion Neuronen waren in optischen Abschnitte (Abb. 7 b) sichtbar.
Wir führten auch retrograde Kennzeichnung von Sub-zerebrale Projektion Neuronen in C57BL/6J Mäuse mit CTB488. Das feste Gehirn war mit einer Dicke von ca. 500 µm in koronalen Scheiben schneiden und unterzogen die AbScale Methode beschriften Parvalbumin exprimierenden Zellen (Anti-Parvalbumin, 1: 1000; Anti-Maus IgG eindringmittel beschriftet). Bilder zu Stapeln (512 x 512 Pixel, Pixel-Größe = 1,24 µm; Z-Schritt = 2,17 µm, 268 Bilder/Stack) erhielten eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokalen Mikroskopie mit (20 X, N.A. 1.0, Arbeitsabstand 2 mm). Sub-zerebrale Projektion Neuronen und Parvalbumin exprimierenden Zellen waren beide sichtbar in Scheiben (Abbildung 7).
Abbildung 1: Imaging-Kammern und Distanzstücke. (A) oben: handgemachte Glasboden-Petrischale (rechts) und einer Petrischale ohne einen Glasboden (links). Unten: Eine Kammer (rechts) und Bodenplatten (links), hergestellt aus Silikon Blätter. (B) ein Maus-Hemisphäre unterzogen, die SeeDB-Methode nach Injektion von CTB555 in den Colliculus superior in die Kammer festgelegt ist. Die Probe wird mit einem Stück wiederverwendbare Kleber fixiert. (C) A Objektträger (oben) und ein Abstandhalter aus einem Silikon-Blatt mit einer Dicke von 0,5 mm (unten) gemacht. (D) zwei koronale Scheiben des Mäusegehirns waren die Abstandshalter eingelassen und mit einem Deckglas abgedeckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Tracer Injektion. (A) A Glaspipette mit einer Hamilton-Spritze durch ein Kunststoffrohr verbunden. (B) ein Maus befindet sich auf einer stereotaktischen Instrument. Die Glaspipette gekippt ca. 60° nach hinten aus der vertikalen Achse für die Injektion in den Colliculus superior. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Zuschneiden von Gehirn Proben. (A) ganze Gehirn Probe nach Injektion von CTB555 in der superior Colliculus und Fixierung. Die Bregma und Lambda wurden mit Wolfram Nadeln (Pfeilspitzen) markiert. (B) die gleiche Probe getrimmt, um eine Halbkugel zu erhalten. Beachten Sie, dass die Wolfram-Nadeln (Pfeilspitzen) bleiben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Eintauchen des Gehirns Proben in Lösungen für die SeeDB und AbScal-e-Methoden. (A) A Hemisphäre Probe eingetaucht in 0,5 % α-Thioglycerol und 20 % (w/V) Fruktose für die SeeDB-Methode. (B) koronalen Scheiben inmitten der Sca/eA2 Lösung für die AbSca-l-e-Methode. (C) koronalen Scheiben eingebettet in AbScale Lösung, Antikörper für die AbSca-l-e-Methode enthält. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Bestimmung der Zelle stellen. Sub-zerebrale Projektion Neuronen wurden beschriftet, durch die Injektion der retrograden Tracers CTB488 in der Pons bei 5 Wochen alt. Die linke Hemisphäre wurde die SeeDB-Methode unterzogen und überprüft mit zwei-Photonen-Mikroskopie (512 x 512 Pixel, Pixel-Größe = 0,99 µm; Z-Schritt = 2,8 µm, 601 Bilder/Stack). (A) A Einzelbild. (B) fünf Bilder aus einem Einzelbild-Stapel. (C) das Bild Filter verwendet, um CTB-Label Sub zerebralen Projektion Neuronen zu erkennen. (D) Korrelationswerte für fünf Bilder in (B) mit Hilfe des Filters (c) berechnet. (E) Beispiele von erkannten Sub zerebralen Projektion Neuronen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse der groß angelegten Bildgebung. Kortikalen Projektion Neuronen (grün) wurden durch TdTomato-Ausdruck in Tlx3-Cre/Ai9 Transgene Mäuse, beschriftet und Sub-zerebrale Projektion Neuronen (Magenta) wurden durch die Injektion der retrograden Tracers CTB488 in der Pons bei 7 Wochen visualisiert Alter. Die linke Hemisphäre die SeeDB-Methode unterzogen wurde und der Bereich 1.250 µm bis 2.690 µm Lateral und-3,400 µm bis 1.230 µm anterior der Bregma wurde gescannt, mit zwei-Photonen-Mikroskopie. (A) Draufsicht. Ungefähre Positionen der kortikalen Bereiche wurden gezeigt. (B–D) Schrägansicht des CTB 488 Fluoreszenz zeigt Sub zerebralen Projektion Neuronen (B), TdTomato Fluoreszenz zeigt kortikalen Projektion Neuronen (C) und das zusammengefügte Bild (D). A: vordere; P: Posterior; M: Medial; D: Dorsal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: hoher Vergrößerung Fotos von repräsentative Ergebnisse. (A) eine optische Abschnitt des Bildes in Abbildung 6. Bild Dicke = 20 µm. (B) EGFP-Label Sub zerebralen Projektion Neuronen in einer heterozygoten Crym-Egfp -Maus im Alter von 6 Wochen. Bild Dicke = 30 µm. (C) Subcerebral Projektion Neuronen (Magenta) waren gekennzeichnet durch Injektion von CTB488 in der Pons von Mäusen C57BL/6J an postnatalen Tag 49 und Parvalbumin exprimierenden Zellen (grün) wurden durch die AbScale Methode visualisiert. Bild Dicke = 55 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Fluorophor | Ex (nm). | Filter (nm) |
| EGFP | 910 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| tdTomato | 1.000 | 578-633 (D605 / 55m, Chroma) |
| Alexa Fluor 488 | 750 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 555 | 750 | 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56, Semrock) |
| DAPI | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock) |
Tabelle 1: Erregung Wellenlängen und Filter für die zwei-Photonen-Mikroskopie.
Tabelle 2: Reagenzien für die AbScale Methode. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
| Antigen | Immunisierten Tieres | Produkt-ID | Konzentration | 3 mm block | 500 μm slice |
| NeuN | Maus | MAB377 | 1: 500 | ND | + |
| NeuN | Kaninchen | ABN78 | 1: 500 | ND | + |
| CTIP2 | Ratte | ab18465 | 1: 100 | L1-L6 | + |
| Statb2 | Maus | ab51502 | 1: 100 | - | - |
| GAD67 | Maus | MAB5406 | 1: 200 | ND | + |
| GABA | Kaninchen | A2052 | 1: 100 | - | - |
| Parvalbumin | Maus | 235 | 1: 1000 | ND | + |
| Parvalbumin | Ziege | PV-Go-Af460 | 1: 100 | L1-L2/3 | + |
| Parvalbumin | Maus | P3088 | 1: 1000 | ND | + |
| Parvalbumin | Kaninchen | ab11427 | 1: 500 | ND | - |
| Somatostatin | Kaninchen | T-4103 | 1: 1000 | L1-L2/3 | + |
| c-Fos | Kaninchen | PC38 | 1: 1000 | ND | + |
Tabelle 3: Eindringen der getesteten Antikörper. Ergebnisse für 3 mm Dicke Blöcke wie folgt dargestellt ist; L1-L6: Eindringen in die gesamte kortikale Dicke; L1-L2/3: Durchgriff auf Layer 2/3; -: keine Kennzeichnung; ND: nicht ermittelt. Ergebnisse für 500 µm dicken Scheiben wie folgt dargestellt ist; +: einheitliche Kennzeichnung; -: keine oder eingeschränkte Kennzeichnung.
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Discussion
Wir stellten Verfahren um großformatige dreidimensionale Bilder der Zelle Typ-spezifische Organisation der wichtigsten Zelltypen in Maus neokortikalen Schicht 5 zu erhalten. Im Vergleich zu herkömmlichen Slice Färbung, eignet sich die Methode bei der Bestimmung der dreidimensionalen Organisation des Neocortex. Die Methode ermöglicht die Bildaufnahme aus der breiteren und tieferen Hirnregionen im Vergleich zu den typischen in Vivo 2-Photonen-Mikroskopie oder konventionelle konfokale Mikroskopie und somit können die umfassende Analyse der neokortikalen Mobilfunk Organisation.
Ein wichtiger Schritt der Methode ist die Antikörper-Penetration. Eine Teilmenge von Antikörpern zeigt schlechte Penetration in dicken Proben (Tabelle 3) und daher nicht für die AbSca-l-e-Methode verwendet werden. Um einheitliche Kennzeichnung mit den in dieser Studie verwendeten Antikörper zu erhalten, war es notwendig, das Gehirn in 500 µm Scheiben schneiden. Die Verwendung von kleineren Antikörperfragmente, z. B. Fab oder F(ab') 2 Fragmente und/oder andere clearing Methoden21,22,23,24,25,26 27,28 kann zur Verbesserung der Ergebnisse.
Antikörper-Antigen-bindenen Besonderheit zeichnet sich in der Regel in dünne Gewebe Scheiben aber möglicherweise unterschiedlich Dicke Gewebe verarbeitet werden für das Clearing. Um Antikörperbesonderheit zu kontrollieren, wir gemeinsam mit der Bezeichnung Gewebe mit Tracer Injektion und Marker-gen-Expression bei transgenen Tieren und auch blockierende Experimente mit Antigen Proteine und Peptide14durchgeführt. Diese Verfahren und Experimente mit mutierten Tieren fehlt die Ziel-Antigene sollte für die Bestätigung der Spezifität von Antikörpern nützlich sein.
Eine Einschränkung der Methode ist, dass einige Verformung der Probe durch die Handhabung der weichen Mischproben unvermeidlich ist. In Vivo Bilder vor der Fixierung zu erhalten und diese Bilder zu verwenden, da Verweise hilft, um solche Verformungen zu korrigieren.
Die derzeitigen Verfahren wurden für die Analyse der neokortikalen Schicht 5 entwickelt. Aktuelle Analysen haben viele molekulare Marker identifiziert das Label neuronalen Zelltypen in anderen Schichten4,5,6,7, und die Anwendung dieser Hersteller auf das vorliegende Verfahren ermöglichen Kennung der wichtige zelluläre Organisation in anderen Schichten. Darüber hinaus sollte es möglich sein, ähnliche Analysen in den Gehirnregionen außer den Neocortex und in den Organen als das Gehirn zu untersuchen, ob eine präzise zelluläre Organisation ähnlich wie Microcolumns vorhanden ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken für ihre Beratung auf die AbScale Experimente, Charles Yokoyama zur Bearbeitung des Manuskripts, Atsushi Miyawaki und Hiroshi Hama Eriko Ohshima und Miyuki Kishino für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von Forschungsgeldern aus RIKEN, t.h. und Grants-in-Aid für die wissenschaftliche Forschung vom Bundesministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) von Japan, t.h. unterstützt (Innovative Bereiche "Mesoskopischen Neurocircuitry"; 22115004) und S.S. (25890023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
References
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