Summary
Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.
Abstract
Memeli yeni korteksimiz eksitatör ve inhibitör nöronlar, her biri belirli elektrofizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, sinaptik bağlantıları, birçok türde oluşmaktadır ve in vivo fonksiyonları, onların temel fonksiyonel ve anatomik Organizasyon hücresel ağ ölçek kötü anlaşılmaktadır. Burada beyin kortikal hücresel organizasyon incelenmesi için geniş alanlar arasında fluorescently etiketli nöronlar üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanmaktadır. Nöronlar belirli türleri floresan retrograd nöronal izleyiciler enjeksiyon veya transgenik farelerde floresan proteinlerin ifade tarafından etiketlenir. Blok beyin örnekler, Örneğin, bir yarımküre fiksasyon sonra hazırlanan, yöntemleri takas doku ile şeffaf yapılmış ve belirli hücre tiplerinin floresan immunolabeling tabi. Geniş alanlarda büyük çalışma mesafe hedefler ve motorlu aşamaları ile donatılmış confocal veya iki fotonlu mikroskoplar kullanılarak taranır. Bu yöntem hücre türüne özgü microcolumn fonksiyonel modüller içinde fare yeni korteksimiz periyodik organizasyonu çözebilirsiniz. Yordamı üç boyutlu hücresel mimarisi farklı beyin bölgeleri ve diğer karmaşık doku çalışma için yararlı olabilir.
Introduction
Memeli yeni korteksimiz çok sayıda hücre tipleri, her biri belirli bir gen ifade desenleri, elektrofizyolojik ve biyokimyasal özellikleri, sinaptik bağlantıları, oluşur ve in vivo 1,2 işlevleri ,3,4,5,6,7. Bu hücre türleri tekrarlanan yapılarına olup olmadığını düzenlenir belirsiz oldu. Görsel yönü sütun ve somatosensor varil, birlikte, kortikal sütunlarını yapıları tekrarladık, ancak belirsiz8,9hücresel kuruluşlarındaki kalır. Bunlar belirli kortikal alanlarda mevcut ve beyin çapında bir sistem değildir.
Neocortical katmanında 5, nöronlar büyük çoğunluğu dört önemli türe sınıflandırılmaktadır. Eksitatör nöronlar, alt beyin projeksiyon nöronlar, büyük bir tür aksonlar subcortical hedeflerine pons, spinal kord ve üstün olacaklar gibi projeler ve bu nedenle, büyük kortikal çıkış yolu10temsil eder. Kortikal projeksiyon nöronlar, eksitatör nöronlar, başka bir ana türü korteks10innervate. İnhibitör nöronlar da iki büyük sınıflar içerir: parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri11.
Son analizler dört hücre tipleri tekrarlanan yapıları12,13,14düzenlenir gösterir. Alt beyin projeksiyon nöronlar12,13,14 ve kortikal projeksiyon nöronlar14 hücre tipi belirli microcolumns 1-2 hücreleri çapında organize etmek. Parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri özellikle alt beyin projeksiyon nöronların microcolumns ancak değil microcolumns kortikal projeksiyon nöronlar14hizalayın. Microcolumns kendilerini düzenli olarak altıgen bir dizi14 örgü ve fare beyin12,14 ve dilinde görsel, somatosensor ve motor alanları da dahil olmak üzere birden çok kortikal alanlarda mevcut formuna hizalayın. insan beyni13alanları. Bireysel microcolumn nöronlarda eşitlenmiş aktivite sergilemek ve benzer duyusal tepkiler var.14. Bu gözlemler katmanı 5 hücre tipleri fonksiyonel modüller yinelenen ilk bilinen beyin çapında organizasyonu temsil eden bir microcolumn kafes yapısına düzenlemek gösterir.
Microcolumns yaklaşık 10 µm bir yarıçap ve yaklaşık 40 µm kayma bir periodicity var. Buna ek olarak, microcolumns yönünü paralel onların apikal dendrites ve korteks14konumlarına bağlı olarak değişir. Bu nedenle, microcolumn sistem birkaç mikrometre onlarca tipik bir kalınlık ile geleneksel kortikal dilimleri kullanarak analiz etmek zordur. Ayrıca, bir çeşitli beyin bölgeleri ve bu nedenle, confocal mikroskobu tipik görüntüleme alanını üç boyutlu verileri periodicity analiz gerektirir veya vivo içinde 2-foton görüntüleme çok dardır.
Son zamanlarda, teknikleri kalın doku15,16temizlemek için geliştirilmiştir. Burada fare neocortical katmanı 5 büyük hücre tiplerinde microcolumn sistemi oluşturan büyük ölçekli, üç boyutlu görüntüleri elde etmek için bu yöntemlerin uygulanması açıklanmaktadır. Subcerebral projeksiyon nöronlar retrograd etiketleme veya Crym-egfp transgenik fareler12ve kortikal projeksiyon nöronların her iki tarafından retrograd etiketlenir gelişmiş yeşil flüoresan protein ifade etiketlenir etiketleme veya Tlx3-cre/Ai9 fareler17tdTomato ifadede. Parvalbumin ifade etmek ve somatostatin ifade hücreleri immünhistokimya tarafından etiketlenir. (Antikor ölçek S) AbScale yöntemi18 antikor (bkz: derin beyin) SeeDB yöntemi19 diğer deneyler için kullanıldığı gibi deneyler, boyama için kullanılır. Bu yöntemler konvansiyonel görüntüleme yöntemleri yukarıda belirtilen zorlukları aşmak ve katmanı 514doğru hücresel organizasyonu ortaya koyuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel yordamlar RIKEN Wako hayvan deneyleri Komitesi ve RIKEN genetik rekombinant deneyi Güvenliği Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan imkanları RIKEN beyin bilim kurumsal kurallarına göre gerçekleştirilen Enstitüsü.
1. hazırlık Chambers'ı görüntüleme
-
Odası19 görüntüleme
- Silikon kauçuk sayfalarını kullanarak, bir oda çeşitli kalınlıklarda yaklaşık 5 mm ve zemin plakaları kalınlığı ile hazırlayın. Ayrıca, Petri yemekler ve cam alt (Şekil 1A) olmadan hazırlayın.
-
Dilim rondela
- Silikon kauçuk yaprak kalınlığı 0,5 mm (Şekil 1 c) kullanarak örnekleri, tutmak için boşluk ekleyiciler hazırlayın.
2. izleme enjeksiyon
Not: enjeksiyonları pons (2.1) veya üstün olacaklar (2.2) içine alın. Görsel bölgede üstün olacaklar etiketleri alt beyin projeksiyon sinirlerde içine enjeksiyon sırasında görsel ve motor alanlar da dahil olmak üzere geniş beyin bölgesi pons etiket alt beyin projeksiyon nöronlarda içine enjeksiyon. Kontrol deneyleri için fluorescently etiketli Kolera toksini alt birim B. yerine serum enjekte Steril koşul bakım için steril ekipmanları ve etanol ile temizlenmiş plastik eldiven kullanın.
-
Yetişkin fareler pons içine enjeksiyonu yapmak.
- Bir fluorescently etiketli Kolera toksini alt birimi B 1 µL çizmek (25 µg/µL PBS içinde) 26 G Hamilton şırınga içine.
- Bir enjektör pompası şırıngayı yerleştirin.
- Şırınga ve pompa stereotaksik araç üzerinde yerleştirilen bir manipülatör araç sahibinin yerleştirin. Manipülatör 12 ° dikey eksenden özafagusu eğ.
- İntraperitoneally sodyum Fentobarbital enjekte edilerek bir erkek veya kadın yetişkin (C57BL/6J veya fare Tlx3-cre/Ai9) anestezi (60 mg/kg vücut ağırlığı) veya isoflurane (2-%3) yönetmek. Kuyruğunu fare tam anestezi gösteren forseps ile boğumlu zaman fare yanıt yapar kadar bekleyin.
- Stereotaksik araç üzerinde fareyi getirin.
- Enfeksiyonu önlemek ve kafa derisi, 10 mm bregma ve lambda görünecek şekilde kesilmiş bir jilet kullanarak saç dikkatli bir şekilde çıkarın. Bir pipet kullanarak %1 lidokain 0.1 mL yönetmek. Böylece bregma ve lambda aynı z düzeyde sahip stereotaksik cihazda ağızlık dikey konumunu ayarlayarak baş açısını ayarlamak.
- Manipülatör konumunu kaydetmek ve şırınga ucu bregma yakın olması stereotaksik araç üzerinde kaydırarak manipülatör konumunu ayarlayın. Şırınga manipülatör üzerinde araç tutucu taşıyarak geri çek.
- Manipülatör hareket 5.4 mm özafagusu ve 0.4 mm yanal. Böylece kafatası üzerinde giriş noktası ucu yakındır şırınga ilerlemek. Şırıngayı geri çekmek ve giriş noktası işareti.
- İşaretli konumda yaklaşık 1 mm çapında bir delik.
- Bu bregma ölçülen daha fazla ipucu derinlik 6.9 mm böylece şırınga ucu delikten yerleştirin.
- 0.2 µL/dak, pompa kullanarak izleyicileri 1 µL enjekte.
- Şırınga beyinden kaldırın.
- Gerekirse, maruz kalan beyin microfibrillar hemostat ve anlık yapışkan küçük parçaları ile kapak.
- Bir pipet ile teslim salin enfeksiyonu önlemek ve kafa derisi dikiş kullanarak maruz beyin durulayın.
- Fare stereotaksik araç kaldırın. Fareyi anestezi genellikle için 1 h 30 ˚C adlı bir kuluçka kurtarmak izin verir. Sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar fareyi sahipsiz bırakmayın. Tam olarak kurtarıldı sonra fare diğer hayvanlar şirkete geri dönün.
- Fare 3-7 gün boyunca korumak.
-
Yetişkin fareler üstün olacaklar içine enjeksiyonu yapmak.
- Cam Pipet ucu çapı 30 – 50 µm ile hazırlayın.
- Cam Pipet Hamilton şırınga plastik tüp (Şekil 2A) aracılığıyla bağlayın.
- Cam Pipet, plastik tüp ve Hamilton şırınga parafin sıvı ile doldurun.
- Bir enjektör pompası şırıngayı yerleştirin.
- Cam Pipet manipülatör yerleştirin ve manipülatör özafagusu dikey eksen (Şekil 2B) üzerinden 60 ° tilt.
- 2.1.4–2.1.9 gerçekleştirin. Manipülatör 1.4 mm arka, 0,5 mm lateral lambda için konumdur.
- Kafatasında bir küçük plastik parafin film yeri, sonra yaklaşık 1 µL izleyici çözüm üzerine koydum. Hızlı bir şekilde Cam Pipet ilerlemek ve izleyici çözüm en az 0,5 µL ile doldurun.
- İpucu derinliğidir beyin yüzeyinden 3.0 mm Cam Pipet ekleyin.
- 0.2 µL/dak, pompa kullanarak izleyicileri 0.5 µL enjekte.
- Cam Pipet beyinden kaldırın.
- 2.1.13–2.1.16 gerçekleştirin.
3. fiksasyon ve düzeltme
- Sodyum Fentobarbital (60 mg/kg vücut ağırlığı) intraperitoneally (C57BL/6J veya Tlx3-cre/Ai9, ya da 2. adımda açıklandığı şekilde tracer enjeksiyon olmasın. bir fare içine enjekte. Kuyruğunu fare tam anestezi gösteren forseps ile boğumlu zaman fare yanıt yapar kadar bekleyin.
- Fare fare transcardially%20 0,9 serum fizyolojik ile ventriküler tarafından insanca ötenazi.
- Ventriküler tarafından20 fare saptamak 0.1 M fosfat tampon (pH 7.5) % 4 paraformaldehyde (PFA).
-
Kafatası açıklanan20olarak ortaya çıkarmak için makas kullanarak kafa derisi kesilmiş.
- Makas kullanarak maruz kafatasının orta hat kesilmiş. Forseps kullanarak kafatasını.
- Bregma ve lambda konumunu işaretleme gerekli ise, önce bir yarımküre kafatası kaldırın. Beyin bregma ve beyin üzerinde kalan kafatasındaki lambda pozisyonlarda ince tungsten iğne takın, sonra kalan kafatası kaldırın.
Not: Beyin 4 ˚C PBS içinde depolanabilir.
-
İnhibitör nöronlar antikor boyama gerçekleştirmek için beyin örnekleri dilimler halinde kesin.
- Beyin örnek bir vibratome yerleştirin.
- En fazla 500 µm oda sıcaklığında PBS içinde kalın dilimler kesin ve adım 5 (AbScale yöntemi)'e devam edin.
- Antikor boyama gereksizdir, trim beyin örnek (ilâ 3 mm kalınlığında) engeller bir tıraş bıçağı (Şekil 3) kullanarak ve adım 4 (SeeDB yöntemi)'e devam edin.
Not: Beyin PBS içinde 4 ° C'de kesme veya düzeltme sonra saklanır. AbScale yöntemi daha az zaman gerektirir çünkü antikor boyama gerekmediğinde SeeDB yöntemi tercih edilir.
4. takas antikor boyama (SeeDB yöntemi)
- Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %20 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.
- Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve % 40 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.
- Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %60 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.
- Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %80 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.
- Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %100 (w/v) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.
- Bir spatula 20 mL % 0.5 α-thioglycerol ve %80.2 (w/w) fruktoz içeren bir 50 mL plastik tüp kullanarak örnek aktarmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 24 h için kuluçkaya.
Not: örnek dikkatle deformasyonlar olabildiğince küçük tutmak için baş. Örnekleri hızla opak olabilirsiniz gibi örnekleri belirtilenden daha uzun kuluçkaya değil. - Örnek %80.2 fruktoz çözüm (Şekil 1B) ile dolu bir görüntüleme odası katıştırın. Gerekirse, örnek kauçuk yapıştırıcı küçük parçalar koyarak düzeltmek. Odası örnekleri yerleştirmeden önce odasında bir yere plaka koymak çok derin değilse.
- Görüntüleme odası cam kapaklı Petri kabına yerleştirin ve çanak ve görüntü confocal veya iki fotonlu mikroskobu uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile kullanarak su koyun. Uyarma dalga boylarında ve emisyon filtreler Tablo 1' de açıklanmıştır. Gerekirse, bir motorlu sahne kullanın.
5. (AbScale yöntemi) boyama antikor ile takas
- Reaktifler Tablo 2' de açıklandığı şekilde hazırlayın.
- Bir spatula 4 mL ani kalp durması/eS0 çözeltisi içeren 5 mL plastik tüp kullanarak dilimleri aktarın ve onlara nazik 37 ° C'de (Şekil 4B) sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.
- Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eA2 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 36 h için dilimleri kuluçkaya
- Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eB4 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 24 h için dilimleri kuluçkaya
- Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eA2 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 12 h için dilimleri kuluçkaya
- Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve PBS 4 mL ekleyin ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 6 h için dilimleri kuluçkaya.
- Bir spatula kullanarak 2 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.
- 1 ml AbScale çözüm 48-72 h 37 ° C'de nazik sallayarak ile (Şekil 4 c) için birincil antikorlar (Tablo 3) ile kuluçkaya.
- Bir spatula kullanarak bir 5 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.
- AbScale çözüm için 2 h 2 kez oda sıcaklığında hafif sallayarak ile 4 ml kuluçkaya.
- Bir spatula kullanarak 2 mL plastik tüp dilimlere dikkatli bir şekilde çıkarın.
- Fluorescently etiketli ikincil antikorlar (Tablo malzemeler, 1: 100) AbScale çözüm 37 ° C'de nazik sallayarak ile 48 saat için 1 ml ile kuluçkaya.
- Dikkatli bir spatula 4 mL AbScale çözeltisi içeren 5 mL plastik tüp kullanarak dilimleri kaldırmak ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 6 h için dilimleri kuluçkaya.
- Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve 4 mL AbScale çözeltisi ekleyin ve 2 kez nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 2 h için dilimleri kuluçkaya.
- Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırın ve 4 mL % 4'lük ekleyin PFA ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 1 h için dilimleri kuluçkaya.
- Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve PBS 4 mL ekleyin ve nazik oda sıcaklığında sallayarak ile 1 h için dilimleri kuluçkaya.
- Çözüm bir pipet kullanarak tüm tüpünden kaldırmak ve ani kalp durması/eS4 çözüm 4 mL ekleyin ve nazik 37 ° C'de sallayarak ile 12 h için dilimleri kuluçkaya
- Bir cam slayt üzerinde spacer yer ve dilimleri içinde spacer yer ve ani kalp durması/eS4 çözüm dilimlerle batırmayın. Rondela (Şekil 1 d) bir cam ile kapatın.
- Su cam ve uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile confocal veya iki fotonlu mikroskobu kullanarak resim koymak. Gerekirse, bir motorlu sahne kullanın.
Not: örnek derin bölgelerinde önemli bir etiketleme önyargı yokluğu onaylamak için yüzeysel bölümlerine benzer şekilde etiketli olup olmadığını kontrol edin.
Not: Penetrasyon test antikorların Tablo 3' te tanımlanmıştır.
6. hücre konumu belirleme
- Taranan görüntülerde her bir pozisyon için bir üç boyutlu görüntü filtresi14 (Şekil 5A-5D) kullanarak korelasyon değerleri hesaplar.
- Correlation değeri (Şekil 5 d) doruklarına konumları belirler.
- Görüntüleri hücreleri (Şekil 5E) bulmak için zirveleri etrafına araştırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kortikal projeksiyon nöronlar tdTomato Tlx3-creiçinde ifade tarafından /Ai9 transgenik fareler etiketli ve retrograd izleyici CTB488 pons enjekte edilerek alt beyin projeksiyon nöronlar görüntülenir. Beynin sol hemisfer SeeDB yöntemine maruz bırakıldı ve uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile donatılmış iki fotonlu mikroskop kullanarak inceden inceye gözden geçirmek (25 X, N.A. 1.1, çalışma mesafesi 2 mm) ve motorlu bir sahne. 401 görüntü yığınını (512 x 512 piksel; piksel boyut 0,99 µm =) = z-adım 2.8 µm her pozisyonlar tarama 30 elde. Hücre cesetleri iki hücre tiplerinin çok çeşitli beyin bölgeleri (Şekil 6) ve optik bölümleri periyodik microcolumns (Şekil 7A) gösterdi üzerinde görünür. Buna ek olarak, (heterozygotes C57BL/6J arka planlı olarak tutulan) Crym-egfp farelerin beyinlerinin SeeDB yöntemi tarafından temizlenir ve yukarıdaki gibi görüntüsü. Hücre organları ve EGFP ifade alt beyin projeksiyon nöronların apikal dendrites görme duyusuyla ilgili bölümlerde (Şekil 7B) görünür.
Biz de alt beyin projeksiyon nöronlar CTB488 kullanarak C57BL/6J farelerde retrograd etiketlerine göre yapılır. Sabit beyin yaklaşık 500 µm kalınlığında ile koronal dilimler halinde kesin ve parvalbumin ifade hücreleri (Anti-parvalbumin, 1: 1000; etiketlemek için AbScale yöntemine tabi IgG fluorescently etiketli Anti-fare,). Yığın görüntüleri (512 x 512 piksel, piksel boyutu 1.24 µm; = z-adım = 2.17 µm, 268 görüntüleri/stack) uzun mesafe amacı çalışma bir su-daldırma ile confocal mikroskobu kullanılarak elde (20 X, N.A. 1.0, çalışma mesafesi 2 mm). Alt beyin projeksiyon nöronlar ve parvalbumin ifade hücreleri dilimleri (Şekil 7C) görünür her ikisi de vardı.
Şekil 1: odalar ve çubukları Imaging. (A)Top: el yapımı cam popolu Petri kabına (sağda) ve Petri kabına (sol) bir cam alt olmadan. Alt: Silikon yaprak bir odası (sağda) ve zemin plakaları (solda) yaptı. (B) A fare Yarımküre CTB555 enjeksiyon üstün olacaklar içine odasına ayarlandıktan sonra SeeDB yöntemine tabi. Örnek yeniden kullanılabilir yapışkan bir parça ile sabittir. (C) A cam slayt (üst) ve ayırıcı bir silikon levha kalınlığı 0,5 mm (alt) ile yaptı. Fare beyin (D) iki koronal dilim spacer ayarlama ve bir cam ile kaplı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Tracer enjeksiyon. (A) A Cam Pipet Hamilton şırınga bir plastik tüp yoluyla bağlı. (B) A fare stereotaksik araç üzerinde yer alıyor. Cam Pipet hareket ettirildiğinde yaklaşık 60° üstün olacaklar içine enjeksiyon için dikey eksenden özafagusu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: beyin örnekleri kırparak. (A)tüm beyin örnek CTB555 enjeksiyon üstün olacaklar ve fiksasyon içine sonra. Bregma ve lambda tungsten iğneler (ok uçları) ile işaretlenmiştir. (B) aynı örnek bir yarımküre elde kesilmiş. Tungsten iğneler (ok uçları) kalacağını unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Daldırma beyin örnekleri SeeDB ve AbScale yöntemleri çözümleri. (A)A Yarımküre örnek % 0.5 α-thioglycerol ve %20 (w/v) fruktoz SeeDB yöntemi için dalmış. (B) Koronal dilimleri ani kalp durması/eA2 çözüm AbScale yöntemi için dalmış. (C) Koronal dilimler AbScale yöntemi için antikor içeren AbScale çözüm dalmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: hücre pozisyonların belirlenmesi. Alt beyin projeksiyon nöronlar retrograd izleyici CTB488 pons 5 haftalıkken enjekte edilerek etiketli. Sol hemisfer SeeDB yöntemine tabi ve iki fotonlu mikroskobu ile inceden inceye gözden geçirmek (512 x 512 piksel, piksel boyut 0,99 µm; = z-adım = 2,8 µm, 601 görüntüleri/yığın). (A) A tek resim. (B) beş görüntülerden bir tek görüntü yığını. (C) görüntü filtresi alt beyin projeksiyon CTB etiketli nöronlar algılamak için kullanılan. (D) (B) (C) filtre kullanarak beş görüntüleri için hesaplanan korelasyon değerleri. Tespit edilen alt beyin projeksiyon nöronların (E) örnekler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: temsilcisi büyük ölçekli görüntüleme sonuçlarını. Kortikal projeksiyon nöronlar (yeşil) tarafından tdTomato- Tlx3-cre/Ai9 transgenik fareler, ifadesinde etiketli ve alt beyin projeksiyon nöronlar (macenta) retrograd izleyici CTB488 pons 7 haftalıkken enjekte edilerek görüntülenir yaş. Sol hemisfer SeeDB yöntemine maruz bırakıldı ve alan 1,250 µm 2,690 µm lateral ve anterior bregma 1,230 µm için-3,400 µm iki fotonlu mikroskobu kullanılarak taranmıştır. (A)üstten görünüm. Kortikal alanlarda yaklaşık konumları gösterilmiştir. (B-D) Alt beyin projeksiyon nöronlar (B), gösterilen CTB 488 floresan tdTomato floresan kortikal projeksiyon nöronlar (C) ve (D) birleştirilen görüntüyü gösteren eğik görünümünü. A: ön; P: arka; M: medial; D: Dorsal. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: temsilcisi sonuçları yüksek büyütme fotoğraflarını. (A) Şekil 6Dresimde optik bir bölümünü. Görüntü kalınlığı 20 µm. (B) = 6 hafta-in yaş, heterozigoz Crym-egfp fare nöronlarda alt beyin projeksiyon EGFP etiketli. Görüntü kalınlığı nöronlar (macenta) etiketli Doğum sonrası gün 49 ve parvalbumin şeklinde ifade hücreleri (yeşil) AbScale yöntemi tarafından görüntülenmiştir CTB488 C57BL/6J fareler pons enjekte edilerek 30 µm. (C) Subcerebral projeksiyon =. Görüntü kalınlığı 55 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Fluorophore | Ex. (nm) | Filtre (nm) |
| EGFP | 910 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| tdTomato | 1000 | 578-633 (D605 / 55m, Chroma) |
| Alexa Fluor 488 | 750 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 555 | 750 | 563-588 (FF03 / 575/25 / 25, Semrock) |
| Alexa Fluor 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56, Semrock) |
| DAPI | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock) |
Tablo 1: Uyarma dalga boylarında ve iki fotonlu Mikroskopi için filtreler.
Tablo 2: AbScale yöntemi kimyasalları. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
| Antijen | Aşılı hayvan | Ürün kimliği | Konsantrasyon | 3 mm blok | 500 mikron dilim |
| NeuN | Fare | MAB377 | 1:500 | ND | + |
| NeuN | Tavşan | ABN78 | 1:500 | ND | + |
| CTIP2 | Fare | ab18465 | 1: 100 | L1-L6 | + |
| Statb2 | Fare | ab51502 | 1: 100 | - | - |
| GAD67 | Fare | MAB5406 | 1: 200 | ND | + |
| GAMMA AMİNOBÜTİRİK ASİT | Tavşan | A2052 | 1: 100 | - | - |
| Parvalbumin | Fare | 235 | 1: 1000 | ND | + |
| Parvalbumin | Keçi | PV-Go-Af460 | 1: 100 | L1-L2/3 | + |
| Parvalbumin | Fare | P3088 | 1: 1000 | ND | + |
| Parvalbumin | Tavşan | ab11427 | 1:500 | ND | - |
| Somatostatin | Tavşan | T-4103 | 1: 1000 | L1-L2/3 | + |
| c-Fos | Tavşan | PC38 | 1: 1000 | ND | + |
Tablo 3: penetrasyon test antikorların. 3 mm kalınlığında blok için sonuçları aşağıdaki gibi gösterilir; L1-L6: penetrasyon içine bütün kortikal kalınlığı; L1-L2/3: penetrasyon katmanına 2/3; -: etiketleme yok; ND: tespit değil. 500 µm kalınlığında dilimler için sonuçları aşağıdaki gibi gösterilir; +: Tekdüzen etiketleme; -: yok veya etiketleme sınırlı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz büyük hücre tiplerinin fare neocortical tabakasında 5 hücre türüne özgü organizasyonun büyük ölçekli üç boyutlu görüntü elde etmek yordamlar sundu. Geleneksel dilim boyama için karşılaştırıldığında, yöntem yeni korteksimiz üç boyutlu organizasyonu belirlemede daha yararlı olur. Yöntem resim alma üzerinden daha geniş ve daha derin beyin bölgeleri tipik vivo içinde 2-foton mikroskopi veya geleneksel confocal mikroskobu ile karşılaştırıldığında ve böylece, neocortical cep kapsamlı analiz izin verebilirsiniz organizasyon.
Kritik bir yöntem antikor penetrasyon adımdır. Antikorlar kümesini zavallı penetrasyon içine kalın örnekler (Tablo 3) gösterir ve bu nedenle, AbScale yöntemi için kullanılamaz. Bu çalışmada kullanılan antikorlar ile Tekdüzen etiketleme elde etmek için beyin 500 µm dilimler halinde kesip gerekliydi. Daha küçük antikor parçaları, Örneğin, Fab veya F(ab') 2 parçaları, ve/veya diğer yöntemleri21,22,23,24,25,26takas kullanımı, 27,28 sonuçları geliştirmek.
Antikor antijen bağlayıcı özgüllük genellikle ince bir doku dilimler halinde karakterize ama kalın dokularda farklı takas için işlenmiş. Antikor özgüllük için denetlemek için izleyici enjeksiyon ve marker gen ekspresyonu transjenik hayvanlar içinde kurcalayarak Co etiketli ve de antijen peptidler, proteinler14kullanarak engelleme deneyleri yapılır. Bu yordamları ve denetim hedef antijenleri eksik mutant hayvanlar kullanarak deneyler antikorlar özgüllük teyit için yararlı olmalıdır.
Bir yöntem örnek bazı deformasyon yumuşak toplu örnekleri işlenmesi nedeniyle kaçınılmaz olduğunu kısıtlamasıdır. Vivo görüntüleri önce fiksasyon ve başvuruları gibi deformasyonlar düzeltmek için yardımcı olacaktır bu görüntüleri kullanarak alma.
Mevcut yordamlar neocortical katmanı 5 analiz için dizayn edilmiştir. Son analizleri birçok moleküler işaretleyiciler bu etiket nöronal hücre türleri diğer katmanları4,5,6,7kimliklerini teşhis ettik ve mevcut yöntemini bu üreticileri uygulamaya izin verebilir diğer katmanlar halinde önemli hücresel organizasyon kimliği. Buna ek olarak, beyin bölgeleri dışında yeni korteksimiz ve organları dışında kesin hücresel organizasyon için microcolumns benzer bulunup bulunmadığını araştırmak için beyin, benzer çözümlemesi yapma mümkün olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Atsushi Miyawaki ve Hiroshi Hama AbScale deneyler, Charles Yokoyama yazması, düzenleme için onların tavsiye için Eriko Ohshima ve Miyuki Kishino onların teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT) Japonya'nın bilimsel araştırma için T.H. RIKEN araştırma fonlarından T.H. ve Grants-in-Aid tarafından desteklenmiştir (yenilikçi alanları "Mezoskopik Neurocircuitry"; 22115004) ve S.S. (25890023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
