Summary
Här beskriver vi ett förfarande för vävnad clearing, fluorescerande märkning och storskaliga avbildning av mus hjärnvävnad som därmed möjliggör visualisering av tredimensionella organisationen av celltyper i hjärnbarken.
Abstract
Däggdjur hjärnbarken består av många typer av retande och hämmande nervceller, alla med specifika elektrofysiologiska och biokemiska egenskaper, synapsförbindelser, och i vivo fungerar, men deras grundläggande funktionell och anatomisk organisation från cellulära nätverk skala är dåligt känd. Här beskriver vi en metod för den tredimensionell avbildning av fluorescently-märkta nervceller över stora områden av hjärnan för utredning av kortikala cellulära organisationen. Vissa typer av nervceller är märkta av injektion av fluorescerande retrograd neuronala spårämnen eller uttryck av fluorescerande proteiner i transgena möss. Blockera hjärnan prover, t.ex. ett halvklot, är berett efter fixering, gjorts genomskinligt med vävnad clearing metoder och utsätts för fluorescerande immunolabeling de specifika celltyper. Stora områden är genomsökt med confocal eller två-foton Mikroskop utrustade med stora arbeta avstånd mål och motoriserade stadier. Denna metod kan lösa den periodiska organisationen av cell typspecifika microcolumn funktionella moduler i mus neocortex. Förfarandet kan vara användbar för studien av tredimensionella cellulära arkitekturen i de olika hjärnområden och andra komplexa vävnader.
Introduction
Däggdjur hjärnbarken består av ett stort antal celltyper, alla med en specifik gen uttrycksmönster, elektrofysiologiska och biokemiska egenskaper, synapsförbindelser, och i vivo fungerar1,2 ,3,4,5,6,7. Huruvida dessa celltyper är organiserade i upprepade strukturer har varit oklart. Kortikala kolumner, inklusive visuell orientering kolumner och somatosensoriska fat, har upprepat strukturer, men deras cellulära organisation förblir oklart8,9. Dessa finns i de specifika kortikala områdena och är inte en hjärna-omfattande system.
I hjärnbarkens lager 5 indelas den stora majoriteten av nervceller i fyra huvudtyper. En viktig typ av excitatoriska nervceller, sub cerebral projektion nervceller, projekt axoner subkortikala mål inklusive pons, ryggmärgen och superior colliculus, och därför representerar de största kortikala utgång väg10. Kortikala projektion nervceller, en annan huvudtyp av excitatoriska nervceller, innerverar de cortex10. Hämmande nervceller innehåller också två stora klasser: parvalbumin-uttryckande och somatostatin-uttryckande celler11.
Senaste analyser visar att de fyra celltyper är organiserade i upprepade strukturer12,13,14. Både sub cerebral projektion nervceller12,13,14 och kortikala projektion nervceller14 organisera celltyp specifika microcolumns med en diameter på 1 – 2 celler. Parvalbumin-uttryckande och somatostatin-uttryckande celler justera specifikt med microcolumns av sub cerebral projektion nervceller men inte med microcolumns av kortikala projektion nervceller14. Microcolumns själva anpassa regelbundet till form en sexkantig galler array14 och finns i flera kortikala områden inklusive visuell, somatosensoriska och motoriska områden mus hjärnan12,14 och språk områden av den mänskliga hjärnan13. Nervceller i de enskilda microcolumn uppvisar synkroniserade aktivitet och har liknande sensoriska Svaren14. Dessa observationer tyder på att lager 5 celltyper organisera en microcolumn gitterstrukturen som representerar den första kända hjärna-wide organisationen av upprepande funktionella moduler.
Microcolumns har en radie på ca 10 µm och en rumslig periodicitet av ungefärligt 40 µm. Orientering på microcolumns är dessutom parallellt med sin apikala dendriter och förändringar beroende på deras position i cortex14. Det microcolumn systemet är därför svåra att analysera med hjälp av konventionella kortikala skivor med en typisk tjocklek av några tiotals mikrometrar. Dessutom analysen av periodicitet kräver tredimensionella data från en lång rad områden i hjärnan, och, därför, konfokalmikroskopi typiska imaging området eller i vivo 2-photon imaging är för smal.
Nyligen har det utvecklats metoder för att rensa tjocka vävnader15,16. Här beskriver vi tillämpningen av dessa metoder att få storskaliga, tredimensionella bilder av de stora celltyper i mus hjärnbarkens lager 5 som utgör det microcolumn systemet. Subcerebral projektion nervceller är märkta av den bakåtsträvande märkning eller uttryck för förbättrad grönt fluorescerande protein i Crym-andra transgena möss12- och kortikal projektion nervceller är märkta av antingen den retrograd märkning eller i tdTomato uttrycket i Tlx3-cre/Ai9 möss17. Parvalbumin-uttryckande och somatostatin-uttryckande celler är märkta av immunohistokemi. (Antikropp skala S) AbScale metod18 används för antikroppen färgning experiment, medan (se Deep Brain) SeeDB metod19 används för andra experiment. Dessa metoder ovan nämnda svårigheterna av de konventionella avbildningsmetoder och avslöja den korrekta cellulära organisationen lager 514.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella rutiner godkändes av de RIKEN Wako djur experiment och RIKEN genetiska rekombinant Experiment säkerhet kommittén och utförs enligt anvisningar av animaliskt faciliteter av RIKEN hjärnan vetenskap Institutet.
1. beredning av Imaging Chambers
-
Imaging kammare19
- Använda silikon gummi ark, förbereda en kammare med en tjocklek på ca 5 mm och golv plattor av olika tjocklekar. Också, förbereda petriskålar med och utan ett glas botten (figur 1A).
-
Slice spacer
- Förbereda distanser att hålla prover, med silikon gummi blad med en tjocklek av 0,5 mm (figur 1 c).
2. tracer injektion
MÄRKA Göra injektioner i pons (2,1) eller superior colliculus (2,2). Injektion i pons etiketten sub cerebral projektion nervceller i ett brett hjärnregionen inklusive de visuella och motoriska områdena, medan injektion i superior colliculus etiketter sub cerebral projektion nervceller i det visuella området. För kontroll experiment, injicera saltlösning istället för fluorescently-märkt kolera toxin subenhet B. För underhåll av sterilt skick Använd steriliserad utrustning och plasthandskar rengöras med etanol.
-
Gör injektioner i pons av vuxna möss.
- Rita 1 µL fluorescently-märkt kolera toxin subenhet B (25 µg/µL i PBS) i en 26 G Hamilton-spruta.
- Placera en insprutare pump på sprutan.
- Placera sprutan och pump på verktygshållaren av en manipulator placeras på ett stereotaxic instrument. Tilt manipulatorn 12° posteriort från den vertikala axeln.
- Söva en manlig eller kvinnlig vuxen mus (C57BL/6J eller Tlx3-cre/Ai9) genom att injicera natrium pentobarbital intraperitonealt (60 mg/kg kroppsvikt) eller genom att administrera isofluran (2 – 3%). Vänta tills musen gör inget svar när stjärten är i kläm med pincett, som anger att musen är helt sövd.
- Placera musen på det stereotaxic instrumentet.
- Ta försiktigt bort hår med ett rakblad för att förhindra infektion och skär 10 mm i hårbotten så att de bregma och lambda är synliga. Administrera 0,1 mL 1% lidokain med pipett. Ställa in vinkeln på huvudet genom att justera den vertikala positionen av munstycket på stereotaxic instrumentet så att de bregma och lambda har samma z-nivå.
- Justera positionen för manipulatorn genom att skjuta på stereotaxic instrumentet så att spetsen på sprutan är nära bregma och spela in positionen för manipulatorn. Dra tillbaka sprutan genom att flytta verktygshållaren på manipulatorn.
- Flytta manipulatorn 5.4 mm posteriort och 0,4 mm sidled. Förväg sprutan så att spetsen ligger nära startpunkten på skallen. Dra tillbaka sprutan och markera startpunkten.
- Vid den markerade punkten, borra ett hål med en diameter på ca 1 mm.
- Sätt in sprutspetsen genom hålet så att spetsen djupet är 6.9 mm mer än som mätte på bregma.
- Injicera 1 µL av spårämnen med hjälp av pumpen vid 0.2 µL/min.
- Ta bort sprutan från hjärnan.
- Vid behov täcka exponerade hjärnan med små fragment av microfibrillar hemostat och omedelbar självhäftande.
- Skölj exponerade hjärnan med koksaltlösning levereras med en pipett att förhindra infektion och sutur hårbotten.
- Ta bort musen från det stereotaxic instrumentet. Låt musen för att återhämta sig från anestesi i en inkubator vid 30 ˚C, typiskt för 1 h. Lämna inte musen utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning. Återgå musen till företaget av andra djur efter det har återhämtat sig helt.
- Hålla musen i 3 – 7 dagar.
-
Gör injektioner i den superior colliculus av vuxna möss.
- Förbereda en glas pipett med en spets diameter av 30 – 50 µm.
- Anslut glas pipetten till en Hamilton spruta genom ett plaströr (figur 2A).
- Fyll den glas pipett, plaströr och Hamilton spruta med paraffin vätskan.
- Placera en insprutare pump på sprutan.
- Placera glas pipetten på manipulatorn och luta manipulatorn 60° posteriort från den vertikala axeln (figur 2B).
- Utföra 2.1.4–2.1.9. Manipulatorn ståndpunkt är 1,4 mm posteriort, 0,5 mm i sidled till lambda.
- Placera en liten plast paraffin film på skallen, sedan lägga ca 1 µL av tracer lösningen på den. Snabbt avancera glas pipetten och fyll den med minst 0,5 µL av tracer lösningen.
- Sätt glas pipetten så att spetsen djupet är 3,0 mm från hjärnans yta.
- Injicera 0,5 µL av spårämnen med hjälp av pumpen vid 0.2 µL/min.
- Ta bort glas pipetten från hjärnan.
- Utföra 2.1.13–2.1.16.
3. fixering och trimning
- Injicera natrium pentobarbital (60 mg/kg kroppsvikt) intraperitonealt i en mus (C57BL/6J eller Tlx3-cre/Ai9, med eller utan tracer injektionen som beskrivs i steg 2. Vänta tills musen gör inget svar när stjärten är i kläm med pincett, som anger att musen är helt sövd.
- Avliva musen humant av startas mus transcardially20 med 0,9% koksaltlösning.
- Fixa mus20 av startas 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,5).
-
Skär hårbotten med hjälp av ett par sax för att exponera skallen som beskrivs20.
- Skär mittlinjen av exponerade skallen med hjälp av ett par saxar. Ta bort skallen med pincett.
- Om märkning i bregma och lambda ställning är nödvändigt, ska du först ta bort ena hjärnhalvan av skallen. Sätt tunn volfram nålar i hjärnan på positionerna för de bregma och lambda på skallen kvar på hjärnan och ta sedan bort återstående skallen.
Obs: Hjärnan kan lagras i PBS vid 4 ˚C.
-
För att utföra antikropp färgning av hämmande nervceller, skär hjärnan proverna i skivor.
- Placera hjärnan provet på en vibratome.
- Skär skivor upp till 500 µm tjock i PBS vid rumstemperatur och fortsätt till steg 5 (AbScale-metoden).
- Om antikroppar färgning är onödiga, trimma hjärnan provet blockerar (upp till 3 mm tjock) med ett rakblad (figur 3) och fortsätt till steg 4 (metoden SeeDB).
Obs: Hjärnan kan lagras i PBS vid 4 ° C efter styckning eller putsning. Den SeeDB metoden är att föredra när antikropp färgning inte är nödvändigt eftersom det kräver mindre tid än metoden AbScale.
4. Rensa utan antikropp färgning (metoden SeeDB)
- Överför provet med hjälp av en spatel till en 50 mL plaströr som innehåller 20 mL 0,5% α-thioglycerol och 20% (w/v) fruktos och inkubera det 4 h med milda skakningar vid rumstemperatur.
- Överför provet med hjälp av en spatel till en 50 mL plaströr som innehåller 20 mL 0,5% α-thioglycerol och 40% (w/v) fruktos och inkubera det 4 h med milda skakningar vid rumstemperatur.
- Överför provet med hjälp av en spatel till en 50 mL plaströr som innehåller 20 mL 0,5% α-thioglycerol och 60% (w/v) fruktos och inkubera det 4 h med milda skakningar vid rumstemperatur.
- Överför provet med hjälp av en spatel till en 50 mL plaströr som innehåller 20 mL 0,5% α-thioglycerol och 80% (w/v) fruktos och inkubera det i 12 h med milda skakningar vid rumstemperatur.
- Överför provet med hjälp av en spatel till en 50 mL plaströr som innehåller 20 mL 0,5% α-thioglycerol och 100% (w/v) fruktos och inkubera det i 12 h med milda skakningar vid rumstemperatur.
- Överför provet med hjälp av en spatel till en 50 mL plaströr som innehåller 20 mL 0,5% α-thioglycerol och 80,2% (w/w) fruktos och inkubera det 24 h med milda skakningar vid rumstemperatur.
Obs: Hantera provet noggrant för att hålla deformationer så liten som möjligt. Inkubera inte prover längre än angivet, som prover kan snabbt bli ogenomskinlig. - Bädda in provet i en tänkbar kammare fylld med 80,2% fruktos lösningen (figur 1B). Om nödvändigt, fastställa provet genom att sätta små bitar av gummi tejp runt. Om kammaren är för djupt, Lägg en golvplatta i kammaren innan du placerar proverna.
- Placera petriskål med en glaskupa på imaging kammaren och sätta vatten i skålen och bilden med confocal eller två-foton mikroskopi med en-nedsänkning i vatten länge arbetar avstånd mål. Magnetiseringen våglängder och utsläpp filter beskrivs i tabell 1. Om det behövs, Använd en motoriserad scenen.
5. clearing med antikropp färgning (AbScale-metoden)
- Förbereda reagenser som beskrivs i tabell 2.
- Överföra skivor med hjälp av en spatel till ett 5 mL plaströr som innehåller 4 mL Sca/eS0 lösning och inkubera dem i 12 h med milda skakningar vid 37 ° C (figur 4B).
- Ta bort lösningen från röret med pipett och tillsätt 4 mL Sca/eA2 och inkubera skivor för 36 h med milda skakningar vid 37 ° C.
- Ta bort lösningen från röret med pipett och tillsätt 4 mL Sca/eB4 lösning och inkubera skivor för 24 h med milda skakningar vid 37 ° C.
- Ta bort lösningen från röret med pipett och tillsätt 4 mL Sca/eA2 och inkubera skivor för 12 h med milda skakningar vid 37 ° C.
- Ta bort lösningen från röret med pipett och tillsätt 4 mL PBS och inkubera skivor för 6 h med milda skakningar vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort skivor till en 2 mL plaströr med hjälp av en spatel.
- Inkubera med primära antikroppar (tabell 3) i 1 mL AbScale-lösning för 48-72 timmar vid 37 ° C (figur 4 c) med milda skakningar.
- Ta försiktigt bort skivor till ett 5 mL plaströr med hjälp av en spatel.
- Inkubera i 4 mL AbScale-lösning för 2 h 2 gånger vid rumstemperatur med milda skakningar.
- Ta försiktigt bort skivor till en 2 mL plaströr med hjälp av en spatel.
- Inkubera med fluorescently-märkt sekundära antikroppar (Tabell för material, 1: 100) i 1 mL AbScale-lösning för 48 h vid 37 ° C under varsam skakning.
- Försiktigt bort skivor med hjälp av en spatel till ett 5 mL plaströr som innehåller 4 mL AbScale lösningen och inkubera skivor för 6 h med milda skakningar vid rumstemperatur.
- Ta bort lösningen från röret med pipett och tillsätt 4 mL AbScale lösningen och inkubera skivor för 2 h 2 gånger med milda skakningar vid rumstemperatur.
- Ta bort lösningen från röret med pipett och tillsätt 4 mL 4% PFA och inkubera skivor för 1 h med milda skakningar vid rumstemperatur.
- Ta bort lösningen från röret med pipett och tillsätt 4 mL PBS och inkubera skivor för 1 h med milda skakningar vid rumstemperatur.
- Ta bort lösningen från röret med pipett och tillsätt 4 mL av Sca/eS4 lösningen och inkubera skivor för 12 h med milda skakningar vid 37 ° C.
- Placera distansen på en glasskiva och placera skivor i mellanlägget och Doppa brödskivorna med Sca/eS4 lösning. Försegla distansen med en skyddsglaset (figur 1 d).
- Sätta vatten på täckglaset och bilden med confocal eller två-foton mikroskopi med en-nedsänkning i vatten länge arbetar avstånd mål. Om det behövs, Använd en motoriserad scenen.
Obs: Kontrollera huruvida de djupa delarna av provet är märkta på samma sätt till de ytliga delarna att bekräfta avsaknaden av en betydande märkning bias.
Obs: Penetration av testade antikroppar beskrivs i tabell 3.
6. cell placerabeslutsamheten
- För varje position i de skannade bilderna, beräkna korrelation värden med hjälp av en tredimensionell bild filter14 (figur 5A-5D).
- Bestäm placeringen av topparna av de correlation-värdet (figur 5 d).
- Undersöka bilder runt topparna att hitta celler (figur 5E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi märkt kortikala projektion nervceller av uttryck av tdTomato i Tlx3-cre/Ai9 transgena möss och visualiseras sub cerebral projektion nervceller genom att injicera det bakåtsträvande tracer CTB488 i pons. Den vänstra hjärnhalvan av hjärnan utsattes för metoden SeeDB och skannas med två-foton Mikroskop utrustat med en-nedsänkning i vatten länge arbetar avstånd mål (25 X, N.A. 1.1, arbetsavstånd 2 mm) och en motoriserad scenen. En stack av 401 bilder (512 x 512 pixlar; pixelstorlek = 0,99 µm) vid z-steg = 2,8 µm vid varje 30 skanning positioner erhölls. För de två celltyper cell organ var synliga över ett brett spektrum av områden i hjärnan (figur 6) och optiska avsnitt visade periodiska microcolumns (figur 7A). Dessutom var hjärnan hos Crym-andra möss (underhålls som heterozygoter med C57BL/6J bakgrund) rensas av metoden SeeDB och avbildas som ovan. Den cellen organ och apikala dendriter av andra-uttryckande sub cerebral projektion nervceller var synliga i optiska delar (figur 7B).
Vi har även genomfört retrograd märkning av sub cerebral projektion nervceller i C57BL/6J möss med CTB488. Fast hjärnan var skuren i koronalt skivor med en tjocklek av cirka 500 µm och utsätts för metoden AbScale att märka parvalbumin-uttryckande celler (Anti-parvalbumin, 1: 1000; Antimus IgG-fluorescently märkt,). Stapla bilder (512 x 512 pixlar, pixelstorlek = 1.24 µm; z-steg = 2,17 µm, 268 bilder/stack) erhölls med konfokalmikroskopi med en-nedsänkning i vatten länge arbetar avstånd mål (20 X, N.A. 1.0, arbetsavstånd 2 mm). Sub cerebral projektion nervceller och parvalbumin-uttryckande celler var båda synliga i skivor (figur 7 c).
Figur 1: Imaging chambers och distanser. (A) topp: handgjorda glasbotten petriskål (höger) och en petriskål utan en glas-botten (vänster). Botten: En kammare (höger) och golv plattor (vänster) gjord av silikon ark. (B) en mus halvklotet utsätts för metoden SeeDB efter injektion av CTB555 i den superior colliculus ställs in i kammaren. Provet är fast med en bit av återanvändbara självhäftande. (C), en glasskiva (överst) och en spacer gjord av en silikon blad med en tjocklek av 0,5 mm (botten). (D) två koronalt skivor mus hjärnan fastställdes till mellanlägget och täckt med ett lock glas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tracer injektion. (A) A glas pipett ansluten till en Hamilton spruta genom ett plaströr. (B) en mus placeras på ett stereotaxic instrument. Glas pipetten lutas cirka 60° posteriort från den vertikala axeln för injektion i den superior colliculus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: putsning av hjärnan prover. (A) hela hjärnan prov efter injektion av CTB555 in i superior colliculus och fixering. Den bregma och lambda markerades med volfram nålar (pilspetsar). (B) samma prov trimmas för att erhålla ett halvklot. Observera att volfram nålar förblir (pilspetsar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Nedsänkning av hjärnan prover i lösningar för metoderna SeeDB och AbScale. (A) A halvklotet provet nedsänkt i 0,5% α-thioglycerol och 20% (w/v) fruktos för metoden SeeDB. (B) koronalt skivor nedsänkt i Sca/eA2 lösning för metoden AbScale. (C) koronalt skivor nedsänkt AbScale lösning innehållande antikroppar för metoden AbScale. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: bestämning av cell positioner. Sub cerebral projektion nervceller var märkt genom att injicera det bakåtsträvande tracer CTB488 i pons vid 5 veckors ålder. Vänster hjärnhalva var utsatt till metoden SeeDB och skannas med två-foton mikroskopi (512 x 512 pixlar, pixelstorlek = 0,99 µm; z-steg = 2,8 µm, 601 bilder/stack). (A) A enda bild. (B) fem bilder från ett enda bildstapel. (C), bilden filter används för att upptäcka CTB-märkt sub cerebral projektion nervceller. (D) korrelation värden beräknas för fem bilder i (B) med hjälp av filter i (C). (E) exempel på identifierade sub cerebral projektion nervceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representativa resultat för storskaliga imaging. Kortikala projektion nervceller (grön) var märkt av tdTomato-uttryck i Tlx3-cre/Ai9 transgena möss, och sub cerebral projektion nervceller (magenta) var visualiserat genom att injicera det bakåtsträvande tracer CTB488 i pons på 7 veckors ålder. Vänster hjärnhalva utsattes för metoden SeeDB och det område 1 250 µm till 2 690 µm laterala och-3,400 µm till 1 230 µm anterior bregma skannades med hjälp av 2-foton mikroskopi. (A) ovanifrån. Ungefärliga positioner av kortikala områden visades. (B–D) Sned syn på CTB 488 fluorescens visar sub cerebral projektion nervceller (B), tdTomato fluorescens visar kortikala projektion nervceller (C), och den sammanlagda bilden (D). A: främre; P: bakre; M: mediala; D: dorsala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: hög förstoring fotografier av representativa resultat. (A) en optisk del av bilden i figur 6 d. Bild tjocklek = 20 µm. (B) andra-märkt sub cerebral projektion nervceller i en heterozygot Crym-andra mus vid 6 veckors ålder. Bild tjocklek = 30 µm. (C) Subcerebral projektion nervceller (magenta) var märkt genom att injicera CTB488 i pons C57BL/6J möss vid postnatal dag 49 och parvalbumin-uttryckande celler (grön) var visualiserat av metoden AbScale. Bild tjocklek = 55 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Fluorophore | Ex. (nm) | Filtrera (nm) |
| ANDRA | 910 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| tdTomato | 1 000 | 578-633 (D605 / 55m, Chroma) |
| Alexa Fluor 488 | 750 | 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 555 | 750 | 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock) |
| Alexa Fluor 594 | 750 | 601-657 (FF01-629/56, Semrock) |
| DAPI | 700 | 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock) |
Tabell 1: Excitation våglängder och filter för två-foton mikroskopi.
Tabell 2: reagenser för metoden AbScale. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
| Antigen | Immuniserade djur | Produkt-ID | Koncentration | 3 mm block | 500 μm slice |
| NeuN | Mus | MAB377 | 1: 500 | ND | + |
| NeuN | Kanin | ABN78 | 1: 500 | ND | + |
| CTIP2 | Rat | ab18465 | 1: 100 | L1-L6 | + |
| Statb2 | Mus | ab51502 | 1: 100 | - | - |
| GAD67 | Mus | MAB5406 | 1: 200 | ND | + |
| GABA | Kanin | A2052 | 1: 100 | - | - |
| Parvalbumin | Mus | 235 | 1: 1000 | ND | + |
| Parvalbumin | Goat | PV-Go-Af460 | 1: 100 | L1-L2/3 | + |
| Parvalbumin | Mus | P3088 | 1: 1000 | ND | + |
| Parvalbumin | Kanin | ab11427 | 1: 500 | ND | - |
| Somatostatin | Kanin | T-4103 | 1: 1000 | L1-L2/3 | + |
| c-Fos | Kanin | PC38 | 1: 1000 | ND | + |
Tabell 3: Penetration av testade antikroppar. Resultat för 3 mm tjock kvarter är följande; L1-L6: genomträngningen in hela kortikal tjocklek; L1-L2/3: penetration ner till layer 2/3; -: ingen märkning; ND: ej fastställt. Resultat för 500 µm tjocka skivor är följande; +: enhetlig märkning; -: ingen eller begränsad märkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har lagt fram förfaranden för att erhålla storskaliga tredimensionella bilder av cell typspecifika organisationen av de stora celltyper i mus hjärnbarkens lager 5. Jämfört med konventionella slice färgningen, är metoden mer användbar för att fastställa den tredimensionella organisationen av hjärnbarken. Metoden möjliggör bild förvärv från den bredare och djupare hjärnan regionerna jämfört med typiska i vivo 2-foton mikroskopi eller konventionella konfokalmikroskopi och, därmed, kan tillåta den omfattande analysen av hjärnbarkens cellulära organisation.
Ett avgörande steg i metoden är antikropp penetration. En delmängd av antikroppar visar dålig penetration in i tjocka exemplar (tabell 3), och därför inte kan användas för metoden AbScale. För att få enhetlig märkning med de antikroppar som används i denna studie, var det nödvändigt att skära hjärnan i 500 µm skivor. Användning av mindre antikroppsfragment, t.ex., Fab eller F(ab') 2 fragment eller andra clearing metoder21,22,23,24,25,26, 27,28 kan förbättra resultaten.
Antikropp-antigen-bindande specificitet karakteriseras brukar i tunn vävnad skivor men kan vara olika i tjocka vävnader bearbetas för röjning. För att styra för antikropp specificitet, vi tillsammans märkt vävnader med tracer injektion och markör genuttryck i transgena djur och också utförde blockerande experiment med antigen proteiner och peptider14. Dessa förfaranden och kontroll experiment med muterade djur saknar mål antigenerna bör vara användbart för att bekräfta specificiteten av antikroppar.
En begränsning i metoden är att vissa deformation av preparatet är oundvikligt på grund av hanteringen av mjuk bulk prover. Att få in-vivo -avbildningar före fixering och använda dessa bilder som referenser kommer att hjälpa till att korrigera sådana deformationer.
De nuvarande förfarandena utformades för analys av hjärnbarkens lager 5. Senaste analyser har identifierat många molekylära markörer som etikett neuronala celltyper i andra lager4,5,6,7, och tillämpningen av dessa beslutsfattare på denna metod kan aktivera identifiering av viktiga cellulära organisation i andra lager. Dessutom bör det vara möjligt att utföra liknande analyser i hjärnan än neocortex och i organ än hjärnan, att undersöka om det finns en exakt cellulära organisation liknar microcolumns.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Atsushi Miyawaki och Hiroshi Hama för deras råd om AbScale experimenten, Charles Yokoyama för redigering av manuskriptet, Eriko Ohshima och Miyuki Kishino för deras tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av forskningsmedel från RIKEN att T.H. och Grants-in-Aid för vetenskaplig forskning från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT) av Japan att T.H. (innovativa områden ”Mesoskopisk Neurocircuitry”; 22115004) och S.S. (25890023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
