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Developmental Biology

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58034
, ,
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery,Houston Methodist Research Institute

Summary

Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Abstract

Uma barreira à nossa compreensão de como vários tipos de células e sinais contribuem para a função sináptica circuito é a falta de modelos relevantes para o estudo do cérebro humano. Uma tecnologia emergente para abordar esta questão é o uso de três dimensões (3D) neural as culturas celulares, denominado ‘organoids’ ou ‘esferoides’, para a preservação de longo prazo das interações intercelulares incluindo moléculas de adesão extracelular. No entanto, estes sistemas de cultura são demoradas e não sistematicamente gerado. Aqui, detalhamos um método rapidamente e consistentemente produzir cocultures 3D dos neurônios e células-tronco astrócitos de pluripotentes humanas. Primeiros, pre-diferenciados astrócitos progenitores neuronais dissociadas e estão contados. Em seguida, as células são combinadas em esfera-formando pratos com um inibidor de Rho-quinase e em proporções específicas para produzir esferas de tamanho reprodutível. Após várias semanas de cultura como esferas flutuantes, cocultures (‘asteroides’) são finalmente seccionados por imunocoloração ou chapeados sobre matrizes multielectrode para medir a força e a densidade sináptica. Em geral, espera-se que este protocolo vai render 3D esferas neurais que exibir os marcadores de célula madura-tipo restringido, formam sinapses funcionais e apresentam atividade de explosão espontânea rede sináptica. Juntos, este sistema permite rastreio de drogas e investigações sobre os mecanismos da doença em um modelo mais adequado, em comparação com as culturas monocamada.

Introduction

Astrócitos são um tipo de célula glial altamente abundante no sistema nervoso central (SNC) com uma variedade de responsabilidades funcionais, além de suporte estrutural. Através da secreção de fatores solúveis synaptogenic e componentes da matriz extracelular (ECM), astrócitos ajudar no estabelecimento e clustering de sinapses maduras durante desenvolvimento1. Eles também desempenham um papel fundamental na manutenção da saúde e da plasticidade de sinapses a extracelular sinalização2,3,4,5e contribuam para a estabilidade a longo prazo de homeostático ambientes regulando o potássio extracelular e glutamato, bem como a secreção de substratos de energia e ATP6,7,8. Finalmente, eles podem contribuir para a neurotransmissão, influenciando as correntes extrasynaptic9e indiretamente podem influenciar a atividade através de outros tipos de células, tais como a promoção de mielinização10. Importante, porque a anomalia ou disfunção de astrócitos pode levar a muitas síndromes de desenvolvimento neurológico e neuropatologia adulta, há uma necessidade óbvia de incluem astrócitos ao lado de neurônios dentro engenharia redes neurais em ordem para uma melhoria modelo do ambiente endógeno do cérebro. Uma característica integral de astrócitos é sua capacidade de interações dinâmicas de forma com sinapses neuronais1,11,12. Na ausência da glia, os neurônios formam um número limitado de sinapses, que em geral também falta maturidade funcional13.

Astrócitos humanos apresentam características morfológicas, transcriptional e funcionais — tais como o aumento do tamanho e complexidade de ramificação, bem como espécie-específicos de genes — que não são recapitulada em roedores12,14, 15. Como resultado, estudos utilizando células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-células neurais derivadas tornam-se amplamente aceito como um meio de examinar doenças relacionadas com a CNS em vitro durante o desenvolvimento de novas terapias, lesão modelos e paradigmas de cultura16 ,17. Além disso, o hPSCs permite o estudo da formação humana sinapse e função sem a necessidade de tecido primário18,19.

Uma barreira à nossa compreensão de como vários tipos de células e sinais contribuem para a função sináptica circuito é a falta de modelos relevantes do cérebro humano. Há uma necessidade de uma plataforma adequada recapitular suas redes sinápticas com alta fidelidade e reprodutibilidade. Recentemente, o interesse surgiu na produção de sistemas de cultura 3D (amplamente conhecido como ‘organoids’, ‘esferoides’, ou ‘mini cérebro’)20 para modelar complexo tridimensional (3D) estruturas a nível celular e macro. Sistemas de cultura 3D retém ECM e célula-célula de interações que são normalmente ausente ou limitado durante coculture 2D típico paradigmas21,22. Uma abundância de técnicas existem para cultivo esferoides neural 3D23,24,25; no entanto, muitos exigem períodos longos de cultura (meses a anos) para o desenvolvimento espontâneo e preservação de camada, com o usuário, exibindo muito pouco controle sobre a saída.

Aqui, podemos ilustrar um método sistemático para rapidamente e consistentemente bioengineer neural interações entre vários tipos de células (neurônios pre-diferenciados e astrócitos) derivado de hPSCs pela montagem de células em cocultures de esfera (asteroides)26 que recapitular humanos específicas complexidades morfológicas em 3D. Este sistema neural de alta densidade gera uniformemente dispersa os subtipos neurais que assumir Propriedades maduras ao longo do tempo e podem ser exibidos ou analisados de uma forma de alta produtividade. Demonstramos pela primeira vez que humano astrócitos induzem atividade de explosão rede sináptica nestas cocultures 3D. Além disso, este protocolo é facilmente adaptável para gerar esferas de tamanhos diferentes, utilizam células especificadas para diferentes identidades regionais do SNC e estudar as interações de vários outros tipos de células, como desejado.

Protocol

1. celular cultura e preparação dos reagentes Nota: Os protocolos nesta seção são escritos na ordem em que aparecem no protocolo de diferenciação (secção 2). Consulte a Tabela de materiais para materiais e números de catálogo. Prepare placas revestidas para cultura de células. Dilua a solução de revestimento de matriz extracelular (ECM) com DMEM/F12 mídia para preparar um 1 mg/mL solução. Alíquota o ECM diluído solução…

Representative Results

Quando executado corretamente, este protocolo irá produzir populações definidas de cocultures funcionais de astrócitos28,33,34 e neurônios35 gerados a partir de hPSCs (figura 1A-1C), como detalhados anteriormente26 e aqui descrito em passos 2.1 – 2.2. Este procedimento passo a passo, com o uso de…

Discussion

Neste protocolo, descrevemos um método sistemático para a produção de esferas 3D de cocultures neurais. As esferas são compostas de astrócitos e neurônios, que são derivados independentemente de hPSCs. Embora não o foco do presente protocolo, a geração das populações puras de astrócitos de hPSCs28 é uma etapa crítica e pode ser tecnicamente desafiador se realizada sem experiência prévia. Este primeiro passo na geração destes microcircuitos sinápticos deve ser realizado com sin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer o contributo intelectual sobre o design desses procedimentos, Dr. Michael Ward (NIH) para aconselhamento técnico na diferenciação de iNeuron e Saba Barlas para análise preliminar de imagens Dr. Erik Uliano (UCSF).

Materials

6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 ml conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 uM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons
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Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).
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