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Neuroscience

Aplicações de bloco do gânglio simpático Cervical induzida pelo etanol para promover a regeneração do nervo Alveolar Inferior canino usando um nervo Artificial

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58039
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3
1Department of Dental Anesthesia, Nippon Dental University Hospital at Tokyo, 2Department of Dental Anesthesiology, Nippon Dental University School of Life Dentistry at Tokyo, 3Department of Bioartificial Organs, Institute for Frontier Medical Science, Kyoto University

Summary

Avaliamos o efeito do bloqueio do gânglio simpático cervical na reparação do nervo usando conduítes de nervo artificial. Cães beagle macho cada implantaram um nervo artificial através de uma abertura de 10 mm no nervo alveolar inferior esquerdo; gânglio simpático cervical esquerdo foi bloqueado pela injeção de etanol 99,5% através de toracotomia lateral.

Abstract

Poliglicólico tubos de colágeno ácido (PGA-C) são tubos de bio-absorvíveis nervo repleto de colágeno de estrutura multi-câmara, que consistem de películas finas de colágeno. Foram alcançados resultados clínicos favoráveis ao usar estes tubos para o tratamento do nervo alveolar inferior danificado (IAN). Um fator crítico para a regeneração do nervo sucesso utilizando tubos de PGA-C é o fornecimento de sangue para o tecido circundante. Bloqueio do gânglio simpático cervical (CSGB) cria um bloqueio simpático na região da cabeça e pescoço, aumentando assim o fluxo sanguíneo na área. Para garantir um efeito adequado, o bloqueio deve ser administrado com anestésicos locais uma a duas vezes por dia durante várias semanas consecutivas; Isso coloca um desafio ao criar modelos animais para investigar esta técnica. Para resolver essa limitação, desenvolvemos um CSGB induzida por etanol em um modelo canino de longo prazo aumento do fluxo sanguíneo na região orofacial. Nós examinamos se regeneração IAN através de implantação de tubo de PGA-C pode ser reforçada por este modelo. Catorze Beagles cada um foram implantados com um tubo de PGA-C através de uma abertura de 10 mm em IAN a esquerda. O IAN está localizado dentro do canal mandibular, cercado por osso, portanto optamos por cirurgia piezoeléctrica, consistindo de ondas ultra-sônicas, para processamento de osso, a fim de minimizar o risco de lesão do nervo e dos vasos. Com esta abordagem, obteve-se um bom resultado cirúrgico. Uma semana após a cirurgia, sete destes cães foram submetidas à esquerda CSGB por injeção de etanol. Induzida por etanol CSGB resultou na regeneração nervosa melhorada, sugerindo que o aumento do fluxo sanguíneo efetivamente promove a regeneração do nervo em defeitos do IAN. Este modelo canino pode contribuir para futuras pesquisas sobre os efeitos a longo prazo da CSGB.

Introduction

Em muitos casos, lesão traumática do nervo alveolar inferior (IAN) é iatrogênica, sendo frequentemente causada pela extração do terceiro molar ou a colocação de implantes dentários1,2,3. Lesão de IAN pode levar a déficits em térmica e toque sensações bem como parestesia, disestesia, hipoestesia e alodinia. Lesão do nervo é tratada não só pela terapia conservadora, mas também por outros métodos, incluindo a sutura e colocação de auto-enxerto. No entanto, esses métodos têm desvantagens, que muitas vezes incluem a falta de melhoria do sintoma e defeitos neurológicos no doador local4,5,6.

O nervo artificial — polyglycolic tubo de ácido-colágeno (PGA-C) foi originalmente desenvolvido no Japão. É um tubo bio-absorvíveis com seu lúmen interno preenchido com um espongiforme colágeno7. Em experimentos com animais, este tubo foi usado para melhorar a regeneração nervosa em cães beagle com defeito do nervo fibular e foi mostrado para promover maior nível de recuperação que o transplante de nervo autólogo8. A aplicação clínica do PGA-C tubo começou em 2002, em pacientes com lesões de nervo periférico. Além disso, os resultados clínicos favoráveis foram obtidos no tratamento da neuropatia trigeminal (IAN e nervo lingual)9,10,11. Um fator crítico para a regeneração do nervo bem sucedida utilizando tubos de PGA-C é o fornecimento de sangue para o tecido circundante8. Bloqueio do gânglio simpático cervical (CSGB) cria um bloqueio simpático na região da cabeça e pescoço e aumenta o fluxo de sangue para a respectiva área inervado12; assim, ela tem sido usada no tratamento da síndrome da dor regional complexa e insuficiência circulatória13,14,15. No entanto, houve apenas algumas investigações experimentais sobre a eficácia de CSGB no sangue crescente fluxo de16,17. Para assegurar a adequada eficiência CSGB, o bloqueio deve ser aplicado em conjunto com anestésicos locais, uma vez ou duas vezes diariamente por várias semanas, posando, portanto, um desafio ao gerar modelos animais para investigar esta técnica. Para resolver essa limitação, em um estudo anterior, desenvolvemos um modelo canino de longo prazo aumento do fluxo sanguíneo na região orofacial18. O modelo foi gerado através da realização de um CSGB pela injeção de etanol 99,5%. Avaliamos o fluxo sanguíneo da mucosa oral e a temperatura da pele nasal pelo laser Doppler flowmetry e termografia infravermelha uma vez por semana durante 12 semanas. Nós achamos que o fluxo de sangue da região orofacial foi aumentado para 7-10 semanas neste modelo.

No presente estudo, foram avaliados os efeitos da CSGB induzida pelo etanol na regeneração do nervo.
O tubo de PGA-C foi implantado em cães beagle através de uma abertura de 10 mm em IAN a esquerda. Uma semana depois, CSGB foi realizada através da injeção de etanol. Três meses após a cirurgia, realizamos uma variedade de Estudos eletrofisiológicos, histológicas e morfológicas para avaliar os efeitos da CSGB na regeneração do nervo. Nós fornecemos um protocolo detalhado para reconstrução de IAN usando um tubo de PGA-C e CSGB induzida pelo etanol.

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Protocol

Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios orientadores para o cuidado e o uso de animais e aprovado pelo Comitê de pesquisa Animal da Universidade de Kyoto (Kyoto, Japão: número de autorização: R-16-16). Foram envidados todos os esforços para minimizar o sofrimento dos animais, e todas as seções deste relatório aderirem ao chegarem (pesquisa Animal: relato de experimentos in Vivo ) orientações.

1. a fabricação do tubo PGA-C

  1. Para fabricar o conduíte de nervo artificial por meio de um tubo de (PGA) ácido poliglicólico absorvível, use uma máquina de trança tubular equipada com 48 fusos e cinco fibras de PGA, compostas por feixes de 26 filamentos (Figura 1)18.
  2. Para renderizar a superfície do tubo de PGA hidrofílico, expô-lo a uma descarga de plasma.
  3. Use 1% v/w clareando em cloridrato solução7.
    Nota: Clareando é extraído da pele de suínos através do tratamento de enzima e submetido a uma verificação de vírus. Ele principalmente consiste de tipo I (70 a 80%) e tipo colágeno III, a relação do que é descrita em detalhes em outro lugar7. Preparar a solução de colágeno, dissolvendo o colágeno 1 g em 100 mL de solução de cloridrato (pH = 3,0). Desde que a densidade da solução de cloridrato é aproximadamente 1.0, a concentração de colágeno w/w é quase 1%.
  4. Revestir o tubo com as camadas de colágeno pelo repetidamente, mergulhando-o na solução de cloridrato de colágeno de 1% para 5 s de cada vez.
    1. Após a imersão, seque o tubo sobre uma bancada limpa, à temperatura ambiente. Execute mergulhando próximo depois de se assegurar que o tubo está completamente seco (cerca de 6 h para secagem ao ar).
    2. Repita o processo de revestimento de 10 vezes.
  5. Submeta o tubo PGA-C a 140 ° C por 24 h sob vácuo (tratamento dehydrothermal), a fim de controlar a bio-absorção e reticulação das moléculas de colágeno. Execute todo o processo sob condições assépticas.
    Nota: Este procedimento gera um tubo de comprimento final 14-mm, 3 mm diâmetro interno e 50 μm espessura de parede.

2. ato cirúrgico set-up

  1. Uso adultos masculinos beagles pesando 9.0 para 13,0 kg.
    1. Animais de casa em gaiolas separadas, sob condições controladas de canil (ciclo de 12 h claro e escuro).
    2. Fornecer alimento sólido e água ad libitum.
  2. Pese os beagles.
  3. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos.
  4. Use luvas esterilizadas e desinfetar todas as superfícies do cenário operacional com uma solução de etanol 80%. Descarte as luvas usadas.
  5. Realize a lavagem das mãos cirúrgica.
  6. Põe uma máscara fresca, vestido e luvas estéreis.

3. anestesia e preparação da pele

  1. Anestesia o cão com uma mistura de cloridrato de cetamina 5 mg/kg e 1 mg/kg de xilazina por uma injeção intramuscular.
  2. Entubá-la por um tubo endotraqueal de 7,5 mm de diâmetro e 25 cm de comprimento.
  3. Coloque o cão na posição de lateral direito. Manter a anestesia geral com sevoflurano 3,2% com oxigênio (1,0 L/min).
  4. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo em 37 ° C.
  5. Aplique um gel oftálmico sobre a superfície anterior dos olhos para evitar abrasão corneal.
  6. Cuidadosamente raspe o campo cirúrgico (área do peito do lado esquerdo), usando a tesoura cirúrgica. Pulverize uma quantidade substancial de solução alcoólica sobre local da operação. Espere pelo menos 15 SEC. Repita a aplicação 3 vezes.
  7. Registre a frequência cardíaca e saturação de oxigênio durante a cirurgia.

4. inferior Alveolar nervo reconstrução usando PGA-C tubo: desenvolvimento do modelo somente reconstrução

  1. Injete 3 mL de lidocaína a 1% usando uma agulha 27G para a gengiva mandibular esquerda como um anestésico local e analgésico.
  2. Realize uma incisão transversal de 5cm com uma lâmina de bisturi número 15 na gengiva mandibular esquerda, para expor as mandíbulas do animal.
  3. Use piezoelétricas vibrações ultra-sônicas para moer o aspecto proximal da mandíbula em um retângulo de 8 mm × 3cm através do forame mental posterior.
    Nota: A frequência de vibração foi 28 \u2012 32 kHz.
  4. Remova a parte frontal da placa óssea mandibular (dimensões, 3 cm × 8 mm) para expor o esquerdo de IAN (Figura 2A)18.
    Nota: O site de reconstrução corresponde ao ápice radicular do primeiro molar
  5. Transecto o IAN com um bisturi para remover um segmento de 10 mm.
  6. Insira os cotos proximais e distais do nervo cortado o nervo a uma profundidade de 2 mm.
  7. Usar suturas de nylon de 8-0 e termina de um microscópio cirúrgico na ampliação de X 8 para suturar o tubo ao nervo proximal e distal (Figura 2B)18.
  8. Retorne a placa óssea para seu local original, na mandíbula.
  9. Feche a ferida com pontos de nylon 4-0.
  10. Um dia após a cirurgia, confirme se a placa óssea mandibular está na posição adequada.
    1. 4.10.1 Execute imagem computadorizada (TC) do osso facial sob anestesia. Definir parâmetros de CT da seguinte forma: 120 kVp, 200 mAs, 0.5 mm/s, fatia de 0,5 mm de espessura.
      1. Administre anestesia usando uma mistura de 5 mg/kg quetamina cloridrato e 1 mg/kg xilazina (Figura 3).
  11. Administre ampicilina (100 mg/dia) como um antibiótico e paracetamol (100 mg/dia) como um analgésico durante uma semana após a cirurgia.

5. induzida pelo etanol CSGB: desenvolvimento da reconstrução + modelo CSGB

  1. Realizar a reconstrução de IAN, conforme descrito na seção 4 e permitir que uma semana para recuperação.
  2. Anestesia o animal com 1,5% de sevoflurano em oxigênio (4 L/min) e ar (6 L/min). Raspar e limpar o campo cirúrgico pretendido, conforme descrito na seção 3.
  3. Marcar a linha de incisão com um marcador de pele cirúrgico desenhando uma linha na área do peito do lado esquerdo (Figura 4, a incisão é de 20 cm de comprimento).
  4. Injete 5 mL de lidocaína a 1% usando uma agulha 21G à área lado esquerdo do peito como um anestésico local e analgésico.
  5. Faça uma incisão na pele do peito lado esquerdo com uma lâmina de bisturi n º 10.
  6. Incise a camada de gordura com um bisturi elétrico para expor a fáscia muscular.
  7. Expor o serratus ventralis muscular e músculo escaleno.
  8. Levante o serratus ventralis muscular e músculo escaleno de ventral para dorsal para expor as segunda e terceiros costelas (Figura 5).
  9. Realize uma toracotomia lateral esquerda no segundo e terceiro espaço intercostal para expor o gânglio simpático cervical esquerdo (Figura 6).
  10. 0,2 mL de etanol 99,5% injete o gânglio simpático cervical, usando uma agulha 30G sob visualização directa (Figura 7).
  11. Feche o espaço intercostal com pontos absorvíveis interrompido 1-0.
  12. Feche a pele com pontos de nylon 3-0 interrompido.
  13. Administre ampicilina (100 mg/dia) como um antibiótico e paracetamol (100 mg/dia) como um analgésico durante uma semana após a cirurgia.
  14. Em 1 semana após CSGB, medir a temperatura de pele facial com termografia infravermelha para confirmar o CSGB.

6. eletrofisiológicas gravações

  1. Para medir o potencial de ação do nervo sensorial (SNAP) e velocidade de condução do nervo sensorial (SCV) do IAN três meses após a reconstrução, anestesia animais conforme descrito na seção 3.
    Nota: O SNAP e SCV devem ser medida em ambos os lados do controle experimental e normal para cada cão em ambos os grupos de tratamento.
  2. Fazer uma incisão na gengiva mandibular esquerda com uma lâmina de bisturi n º 10.
  3. Remova cuidadosamente a placa óssea mandibular para evitar danificar fisicamente o nervo regenerado.
  4. Estimule o IAN usando um par de eletrodos de agulha, para registrar o SNAP e SCV.
    1. Inserir os eletrodos proximalmente para a canalização de nervo.
    2. Aplica o estímulo eléctrico de 10-kHz 20 vezes.
  5. Analise os resultados.
    1. Determine o SNAP calculando a amplitude média de resposta à estimulação elétrica.
    2. Medir a latência de pico e a amplitude de pico das gravações gráfico.
    3. Calcular o índice de recuperação com a seguinte equação: amplitude de pico de IAN esquerdo da reconstrução somente ou reconstrução + CSGB group / pico de amplitude do controle normal (segmento central de certo IAN no grupo somente reconstrução)19 ,20.

7. histológica análise

  1. Seção de preparação
    1. Três meses após a reconstrução, colha o IAN esquerdo, incluindo a 1 cm do nervo em ambos os lados do site reconstruído.
    2. O IAN certo no nível correspondente ao site colheita no lado esquerdo da colheita.
    3. Prefixar os nervos colhidos por imersão em glutaraldeído 2,5% em uma solução 0,1 M de tampão cacodylate (pH 7,4, 48 ° C, 24h).
    4. O postfix com 2% de solução de tetróxido de ósmio (48 ° C, 4 h) e ferrocianeto de potássio em solução de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4, h 2).
    5. Desidrate os nervos com uma série de soluções de etanol classificados.
    6. Incorpore em resina epóxi (parafina).
    7. Seção dos espécimes em uma espessura de 0.5 \u2012 1,0 μm.
  2. Azul de toluidina análise morfológica e coloração
    1. Mancha de seções com solução de azul de toluidina.
    2. Obter imagens de microscopia, usando um microscópio óptico, ampliação de 400 X nas seguintes regiões ao longo das amostras: deixou o IAN, o centro do segmento regenerado e 2mm distalmente ao tronco; Certo, IAN, o centro do segmento de IAN correspondente para o local de colheita no lado esquerdo.
    3. Selecione imagens de todas as regiões com regenerada fibras nervosas.
      1. Selecionar aleatoriamente 8 \u2012 10 áreas de 100 μm × 100 μm contendo regenerado fibras nervosas.
      2. Executar análise morfológica, usando um software apropriado para medir os seguintes parâmetros: diâmetro fibras mielinizadas do nervo (μm) e densidade (contagem/área), nervo porcentagem de tecido e G-ratio (dendritos axônio mielinizadas/diâmetro da fibra do nervo diâmetro ).
  3. Immunostaining
    1. Segui protocolos padrão para coloração de seção de parafina.
    2. Incube com anticorpos primários por 30 min a 25 ° C.
    3. Lavar com tampão fosfato salino 3 vezes a 25 ° C.
    4. Incube com anticorpos secundários marcados com peroxidase de rábano por 30 min a 25 ° C.
    5. Obter imagens usando um microscópio de luz.
  4. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
    1. Prepare os nervos, conforme descrito no passo 7.1.
    2. Nervos de seção em uma espessura de 70 μm 90 \u2012 usando um ultramicrotome.
    3. Mancha de seções com citrato de chumbo de Reynold e uranilo.
    4. Examinar e imagem por microscopia eletrônica de transmissão.

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Representative Results

Observamos um aumento da temperatura da pele facial do lado bloqueado 1 semana após o CSGB esquerdo (Figura 8).

Na pós-reconstrução 3 meses, foi absorvido no tubo de PGA-C na área de reconstrução e regeneração do nervo alveolar inferior foi observada na reconstrução somente e reconstrução + CSGB grupos (Figura 9A, B)18.

SNAP foi mensurável em ambos os lados de reconstrução dos grupos somente reconstrução + CSGB e reconstrução. Os resultados da avaliação eletrofisiológica estão resumidos na tabela 118. O índice de recuperação e SCV foram significativamente maiores no reconstrução + CSGB do que no grupo somente para reconstrução.

Observamos mielinizadas fibras nervosas no segmentos de central e distais de IAN regenerado na reconstrução somente e reconstrução + CSGB grupos (Figura 10A, B)18. A reconstrução somente e reconstrução + grupos CSGB mostrou menores regenerado diâmetros nervosas mielinizadas em relação ao grupo controle normal (segmento central do IAN direito no grupo de reconstrução, Figura 10). As imaturas fibras nervosas mielinizadas também foram observadas.

Exame a reconstrução somente, reconstrução + grupos CSGB usando TEM mostraram as regenerada fibras nervosas mielinizadas e Schwann células (Figura 10, E). Figura 10F mostra esses resultados de TEM para o grupo controle normal (segmento central do IAN direito no grupo de reconstrução).

Foi confirmada a existência de axônios regenerados e células de Schwann em segmentos distais e centrais da reconstrução somente e reconstrução + CSGB grupos, pela coloração com anti-Neurofilamento (NF) e anticorpos anti-S100, respectivamente (Figura 11 )18.

Os resultados da avaliação morfológica estão sumarizados na tabela 2,18. O diâmetro de fibras mielinizadas de nervo no centro do segmento esquerdo regenerado de IAN era 4,27 ± 1,5 µm, no grupo de reconstrução e 5.11 ± 1,98 µm no grupo CSGB, enquanto no segmento distal do regenerada IAN esquerdo o diâmetro era 3.47 ± 1,21 µm no Seguin grupo de ção e 4.53 ± 1,36 µm, no grupo CSGB. Em ambos os casos, o diâmetro foi significativamente maior no grupo CSGB, que também demonstrou um significativamente maior mielinizadas fibras nervosas densidade e nervo tecido porcentagem em ambos o centro e o segmento distal do IAN esquerdo regenerado. O G-ratio no centro do IAN regenerado esquerdo foi 0,75 ± 0,04 no grupo de reconstrução e 0,68 ± 0,05 no grupo CSGB, enquanto na parte distal foi 0,74 ± 0,04 no grupo de reconstrução e 0,69 ± 0,04 no grupo CSGB. Assim, em ambos os casos, a G-proporção foi significativamente menor no grupo CSGB.

Tamanhos de amostra para a reconstrução-only e reconstrução + grupos CSGB foram n = 7. As análises estatísticas para o diâmetro da fibra de nervosas mielinizadas e densidade, G-relação e SCV foram realizadas usando o teste de Dunnett. Análise do índice de recuperação foi realizada usando um Student não pareado t-teste. O nível de significância estatística foi fixado em 5% (p < 0,05).

Figure 1
Figura 1: tubo de ácido poliglicólico preenchido com esponja de colagénio. A) imagem bruta do tubo. As dimensões finais da canalização de nervo eram 14 mm de comprimento, diâmetro interno de 3 mm e espessura de parede 50 µm. B) micrografia eletrônica do tubo de digitalização. Esta figura foi previamente publicada por Shionoya et al 18 e é reproduzido com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: deixou o nervo alveolar inferior (IAN) pré e pós-reconstrução. Imagem de pre-reconstrução A) de IAN esquerdo após serem expostos pela remoção do osso. Imagem de pós-reconstrução B) do IAN esquerdo reconstruída usando um tubo de colágeno-ácido poliglicólico. Esta figura foi previamente publicada por Shionoya et al 18 e é reproduzido com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: calculado de imagem de tomografia computadorizada do osso facial depois que deixou a reconstrução do nervo alveolar inferior. A imagem mostra que a placa de osso mandibular esteja na posição correta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: marcações de pele pré-operatória na área do peito do lado esquerdo antes da cirurgia. Fotografia mostrando as marcas da pele antes de realizar o bloqueio do gânglio simpático cervical. A linha de incisão é de 20 cm de comprimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: vista do bloco gânglio simpático cervical de funcionamento: pré-toracotomia. Imagem mostra as segunda e terceiros costelas depois de criar músculos serratus ventralis e escaleno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: vista do bloco gânglio simpático cervical de funcionamento: pós-toracotomia. Imagem mostra o gânglio simpático cervical esquerdo após toracotomia lateral no segundo e terceiro espaço intercostal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: injeção de pré e pós-etanol de gânglio simpático Cervical usando uma agulha 30 G. ) Imagem de pre-etanol injeção do gânglio simpático cervical à esquerda. B) imagem de pós-etanol injeção do gânglio simpático cervical à esquerda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: termograma após bloqueio do gânglio simpático cervical esquerdo (CSGB). A termograma foi adquirida uma semana depois CSGB pela injeção de etanol. Note-se que a temperatura da pele facial do lado esquerdo é maior que no lado contralateral. A barra de cores indica a temperatura em ° C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: regenerado o nervo alveolar inferior (IAN). Um) imagem de IAN no grupo somente para reconstrução. B) imagem de IAN na reconstrução + grupo CSGB (bloco do gânglio simpático cervical). Regeneração do nervo (região entre pontas de seta brancas) é observada em ambos os grupos. Esta figura foi previamente publicada por Shionoya et al 18 e é reproduzido com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: análise de microscopia eletrônica azul e transmissão toluidina do nervo alveolar inferior regenerado (IAN). Um - C) semi finas secções transversais de IAN na pós-reconstrução 3 meses manchada de toluidina azuis. Imagens mostram os segmentos distais do IAN esquerdo regenerado em cada grupo, conforme indicado. D - F) imagens de microscopia eletrônica de transmissão de cortes semi finos, mostrando as fibras nervosas mielinizadas e não-mielinizadas (preto e branco pontas de seta, respectivamente). Barras de escala representam 50 µm em (A) - (C) e 5 µm (D) - (F). Controle normal: segmento central de certo IAN no grupo somente para reconstrução. Esta figura foi previamente publicada por Shionoya et al 18 e é reproduzido com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: análise imuno-histoquímica de segmentos distais do regenerada esquerdo nervo alveolar inferior (IAN). A, B) seções do IAN regenerada na pós-reconstrução 3 meses manchada com um anticorpo anti-Neurofilamento (NF) para o grupo de reconstrução-somente (A) e reconstrução + bloco do gânglio simpático cervical (CSGB; B) grupos. Setas pretas indicam axônios regenerados. C, D) seções do IAN regenerada na pós-reconstrução 3 meses manchada com um anticorpo anti-S-100 para o grupo de reconstrução-somente (C) e reconstrução + grupos CSGB (D). Setas brancas indicam as células de Schwann. Escala de barras, 50 µm. Esta figura foi previamente publicada por Shionoya et al 18 e é reproduzido com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Condução nervosa sensorial (m/s) Índice de recuperação
Controle normal 48,5 ± 2,8 -
Grupo reconstrução-somente 36,8 ± 2.9* 0,22 ± 0,04
Grupo de reconstrução + CSGB 42.0 ± 2.4*# 0,35 ± 0,06#

Tabela 1: achados eletrofisiológicos na o nervo alveolar inferior (IAN) aos 3 meses após a cirurgia. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 7). Comparações foram feitas usando um Student não pareado t-teste. IAN, nervo alveolar inferior; CSGB, bloqueio do gânglio simpático cervical. *, p < 0.05 em comparação com o grupo controle normal; #, p < 0.05 em comparação com o grupo reconstrução-somente. Controle normal: segmento central de certo IAN no grupo somente reconstrução; Índice de recuperação: relação da amplitude pico de IAN esquerdo da reconstrução somente ou reconstrução + grupo CSGB à amplitude de pico do controle normal. Esta tabela foi publicada anteriormente por Shionoya et al 18 e é reproduzido com permissão.

Fibras mielinizadas de nervo diâmetro (μm) Densidade de fibras mielinizadas de nervo (contagem/100 μm2) Proporção de tecido nervoso (%) Relação G
Controle normal Centro ± 8,83 3.11 103 ± 8 41,3 ± 3,9 0,62 ± 0,03
Grupo reconstrução-somente Centro 1.5* ± 4.27 126 ± 20 * 2.1* ± 11,6 0.04* ± 0,75
Distal 3.47 ± 1.21* 109 ± 17 * 7.3 ± 2.0 * 0,74 ± 0.04*
Grupo de reconstrução + CSGB Centro 5.11 ± 1.98*# 140 ± 22 *# 15,9 ± 3.0*# 0,68 ± 0.05*#
Distal 4.53 ± 1.36*$ 123 ± 15 *$ 12,5 ± 2.1*$ 0,69 ± 0.04*$

Tabela 2: achados morfológicos no nervo alveolar inferior (IAN) aos 3 meses após a cirurgia. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 7). Comparações foram feitas utilizando o teste de Dunnett. IAN, nervo alveolar inferior; CSGB, bloqueio do gânglio simpático cervical. *, p < 0.05 em comparação com o grupo controle normal; * #, p < 0.05 em comparação com o segmento central do IAN esquerdo no grupo somente reconstrução; * $,p < 0.05 em comparação com a extremidade distal do IAN esquerdo no grupo somente reconstrução. Controle normal: segmento central de certo IAN no grupo somente reconstrução; G relação é a relação do diâmetro do axônio mielinizadas ao diâmetro total de fibras mielinizadas. Esta tabela foi publicada anteriormente por Shionoya et al 18 e é reproduzido com permissão.

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Discussion

Apresentamos um método eficiente para regeneração de IAN usando um tubo de nervo bioabsorvível em combinação com CSGB induzida pelo etanol. Para este estudo foi utilizado os cães, desde outros modelos animais, como ratos, ratos e coelhos, têm uma esperança de vida curta e tamanho de corpo pequeno e portanto, não podem ser usados para executar os procedimentos cirúrgicos precisos. Como o IAN está localizado dentro do canal mandibular, cercado por osso, uma técnica cirúrgica é necessária para evitar dano do nervo e dos vasos sanguíneos, ao realizar a reconstrução do nervo. Uma dica importante técnica para o procedimento é remover cuidadosamente a placa óssea mandibular para minimizar o risco de lesão do nervo e dos vasos. Micro serras e brocas tradicionais não conseguem distinguir entre tecidos moles e duros,21. Além disso, essas ferramentas tendem a escorregar causando danificar o tecido adjacente, especialmente o IAN, por contato acidental22. Portanto, usamos instrumentos cirúrgicos piezoelétricos para o osso, etapas de processamento. Esta é uma técnica de cirurgia de osso novo e inovador que usa microvibrations ultra-sônico de bisturis especializados. Portanto, o tecido mole não sejam danificados mesmo em caso de contacto acidental com as dicas de corte23,24. Microvibrations de 60-200 µm/s a 24-29 kHz são ideais para o corte de tecido mineralizado elástico poupando elástico tecido mole; Isso não é possível em frequências superiores a 50 kHz25. Além disso, as brocas rotacionais ou serras oscilantes requerem uma força para compensar a rotação ou a vibração do instrumento. Comparado com estes instrumentos, instrumentos cirúrgicos piezoelétricos não precisa de aplicação de força extra e tão seguro e preciso processamento de osso é possível26. Isto é especialmente importante nas mãos de um novo usuário.

Outro aspecto importante no nosso método é que a placa óssea não foi corrigida usando placas metálicas, mas foi colocada na sua posição original na mandíbula após a colocação do tubo PGA-C. A razão para isto foi para evitar o risco de exposição da chapa a necrose da mucosa oral, que surge quando usando placas metálicas para fixação. No entanto, em alguns casos a placa óssea desviou-se do site original. Portanto, é crucial realizar uma tomografia computadorizada do osso facial para confirmar que a placa óssea mandibular está na posição correta após a cirurgia. Ao usar uma placa metálica para fixação, sutura apertado deve ser evitado pois pode causar necrose da mucosa oral, devido a distúrbios de fluxo de sangue.

CSGB é um tratamento eficaz para doenças vasculares periféricas e síndromes de dor do rosto e pescoço13,14,15. No entanto, os mecanismos subjacentes a seus efeitos terapêuticos permanecem obscuros. Uma das razões para a falta de pesquisa sobre os efeitos terapêuticos da CSGB é a dificuldade na obtenção de um efeito Simpatolítico consistente e uniforme. Por exemplo, a propagação do bloqueio simpático após CSGB percutânea não é uniforme27,28. Mullenheim et al . 29 implantados cães com um cateter de polietileno, após toracotomia, sob a fáscia e ao lado da cadeia simpática superior e executada CSGB através da injeção de lidocaína através do cateter. Embora essa abordagem pode espalhar o bloqueio simpático para as áreas de alvo, isso acarreta riscos de oclusão do cateter ou luxação, bem como a infecção, especialmente em experiências a longo prazo. Em nosso modelo canino de CSGB, a injeção direta de 99.5% etanol produzido aumenta a longo prazo no fluxo de sangue para a região orofacial ipsilateral. Em nossa abordagem, bloco injeção foi administrada sob visualização directa, então CSGB poderia ser executada com precisão. Portanto, nossa abordagem reduz o risco de distribuição desigual do efeito Simpatolítico e do bloqueio simpático. Este é considerado ser vantajoso especialmente em experiências a longo prazo. Além disso, usamos Termografia para confirmar o sucesso da CSGB, desde que aumenta a temperatura da pele facial do lado do bloco em cima CSGB bem sucedida. Neste caso, a Termografia é útil, porque é simples e não invasivo. Importante, a nasal e não a temperatura da pele facial devem ser medidos, já que não é afetado pelo cabelo do cão. Nosso modelo poderia contribuir para futuras pesquisas sobre os efeitos terapêuticos de CSGB. Em nosso estudo anterior, o fluxo sanguíneo na área orofacial aumentou para 6 a 11 semanas depois ganglionectomy simpático cervical. Este método alternativo de30 pesquisadores podem escolher, se desejado.

A limitação deste estudo é que CSGB induzida pelo etanol coloca o risco de desenvolver síndrome de permanente de Horner (ptose palpebral e Miose)31. Outros métodos, incluindo a ablação por radiofrequência, fenol e simpático ganglionectomy têm sido utilizados para realizar simpatectomias; no entanto, especificamente para simpatectomia do gânglio simpático cervical, somente a ablação por radiofrequência tem sido empregada na prática clínica32,33,34,35. Portanto, a ablação por radiofrequência e anestésicos locais pode ser considerados como um método alternativo para CSGB induzida pelo etanol. Estudos futuros, seria necessários para validar como regeneração nervosa, mediada por um tubo de nervo bioabsorvível pode ser reforçada por CSGB com um anestésico local ou ablação por radiofrequência.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo departamento de órgãos Bioartificial em Kyoto University Institute para a ciência médica de fronteira. Gostaríamos de agradecer ao pessoal veterinário do Instituto de ciência médica de fronteira.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NMP Collagen PS Nippon Meatpackers 301-84621 Atelocollagen extracted from young porcine skin by enzyme treatment
Surgical clippers Roboz Surgical Instrument Company RC-5903
Disposable scalpel (No.15) Kai medical 219ABBZX00073000
VarioSurg3 Nakanishi VS3-LED-HPSC, E1133 Piezoelectric surgery for bone processing
4-0 nylon sutures Ethicon 8881H
8-0 nylon sutures Ethicon 2775G
Isepamicin sulfate Nichi-Iko 620005641
Disposable scalpel (No.10) Kai medical 219ABBZX00073000
30-gauge needle Nipro 1134
1-0 absorbable stitches Ethicon J347H
3-0 Nylon stitches Ethicon 8872H
Neo Thermo NEC Avio TVS-700 Infrared thermography 
Neuropack Σ NIHON KOHDEN MEB-5504 Orthodromic recorder for electrophysiological recording
Toluidine Blue Sigma-Aldrich T3260-5G
Light microscope Keyence BZ-9000
Mouse anti-human neurofilament protein monoclonal antibody DAKO N1591
Polyclonal rabbit anti-S100 antibody DAKO Z0311
Transmission electron microscopy Hitachi High Technologies Hitachi H-7000
Dynamic cell count Keyence BZ-H1C Software for morphological evaluation

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References

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Aplicações de bloco do gânglio simpático Cervical induzida pelo etanol para promover a regeneração do nervo Alveolar Inferior canino usando um nervo Artificial
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Shionoya, Y., Sunada, K., Tsujimoto, G., Shigeno, K., Nakamura, T. Ethanol-Induced Cervical Sympathetic Ganglion Block Applications for Promoting Canine Inferior Alveolar Nerve Regeneration Using an Artificial Nerve. J. Vis. Exp. (141), e58039, doi:10.3791/58039 (2018).

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