Summary
Vi utvärderade effekten av cervikala sympatiska ganglion block på nerv reparera med hjälp av konstgjord nerv conduits. Manliga beaglehundar var varje implanteras med en konstgjord nerv över en 10 mm lucka i den vänstra sämre alveolära nerven; vänstra cervikala sympatiska ganglion blockerades genom att injicera 99,5% etanol via laterala torakotomi.
Abstract
Polyglycolic syra kollagen (PGA-C) rör är bio-absorberbara nerv rör fyllda med kollagen av flera kammare struktur, som består av tunn kollagen filmer. Gynnsamma kliniska resultat har uppnåtts när du använder dessa rör för behandling av skadade sämre alveolära nerv (IAN). En avgörande faktor för framgångsrik nerv regenerering med PGA-C rör är blodtillförseln till omgivande vävnad. Cervikala sympatiska ganglion block (CSGB) skapar en sympatisk blockad i regionen huvud och hals vilket ökar blodflödet i området. För att säkerställa en tillräcklig effekt, måste blockaden administreras med lokalanestetika en till två gånger om dagen i flera veckor; Detta utgör en utmaning när du skapar djurmodeller för att undersöka denna teknik. För att lösa denna begränsning, utvecklade vi en etanol-inducerad CSGB i en hund modell för långsiktig ökning av blodflödet i regionen orofacial. Vi har granskat om IAN förnyelse via PGA-C tube implantation kan förbättras genom denna modell. Fjorton Beagles var varje implanteras med en PGA-C röret över en 10 mm lucka i den vänstra IAN. IAN ligger inom kanalen mandibular omgiven av ben, därför valde vi piezoelektriska kirurgi, bestående av ultraljudsvågor, för ben bearbetning, för att minimera risken för nerv och fartyg skada. Ett bra kirurgiska resultat erhölls med detta synsätt. En vecka efter operationen, utsattes sju av dessa hundar för vänster CSGB genom injektion av etanol. Etanol-inducerad CSGB resulterat i förbättrad nerv förnyelse, vilket tyder på att det ökade blodflödet effektivt främjar nerv förnyelse i IAN defekter. Denna hund modell kan bidra till ytterligare forskning om de långsiktiga effekterna av CSGB.
Introduction
I många fall är traumatisk skada av den sämre alveolära nerven (IAN) iatrogen, ofta orsakas av utvinning av den tredje molar eller placeringen av tandimplantat1,2,3. Skada av IAN kan leda till underskott i thermal och touch förnimmelser och parestesi, dysestesi, hypoestesi, samt allodyni. Nervskada behandlas inte bara av konservativ behandling, men också genom andra metoder, inklusive suturering och autograft placering. Dessa metoder har dock nackdelar, som ofta inkluderar brist symptom förbättring och neurologiska defekter på givaren plats4,5,6.
Den konstgjorda nerven — polyglycolic syra-kollagen (PGA-C) tube utvecklades ursprungligen i Japan. Det är en bio-absorberbara tub med dess inre lumen fylld med en spongiform kollagen7. I djurförsök, detta rör användes för att förbättra nerv förnyelse i beagle-hundar med peroneal nerv defekt och visades att främja högre återhämtning än autolog nerv transplantation8. Klinisk tillämpning av PGA-C röret inleddes 2002 hos patienter med perifera nervskador. Dessutom har gynnsamma kliniska resultat uppnåtts vid behandling av trigeminala neuropati (IAN och språkliga nerv)9,10,11. En avgörande faktor för framgångsrik nerv regenerering med PGA-C rör är blodtillförseln till den omgivande vävnad8. Cervikala sympatiska ganglion block (CSGB) skapar en sympatisk blockad i regionen huvud och hals och ökar blodflödet till den respektive innerverade område12; Det har alltså använts för behandling av komplexa regionala smärtsyndrom och cirkulatorisk insufficiens13,14,15. Det har dock endast några experimentella undersökningar om effekten av CSGB i ökande blod flöde16,17. För att säkerställa adekvat CSGB effektivitet, måste blockaden tillämpas tillsammans med lokalanestetika en eller två gånger dagligen i flera veckor, således utgör en utmaning när du genererar djurmodeller för att undersöka denna teknik. För att åtgärda denna begränsning, i en tidigare studie, utvecklat vi en hund modell av långsiktiga ökat blodflöde i orofacial regionen18. Modellen skapades genom att utföra en CSGB genom att injicera 99,5% etanol. Vi utvärderade oral slemhinne blodflödet och nasal hudens temperatur av laser Doppler flowmetry och infraröd Termografi en gång per vecka i 12 veckor. Vi fann att blodflödet i regionen orofacial höjdes för 7 – 10 veckor i denna modell.
I den aktuella studien utvärderat vi effekterna av etanol-inducerad CSGB på nerv regenerering.
PGA-C röret var implanteras i beagle-hundar över en 10 mm lucka i den vänstra IAN. En vecka senare utfördes CSGB genom att injicera etanol. Tre månader efter operation, utfört vi en mängd elektrofysiologiska, histologiska och morfologiska studier för att utvärdera effekterna av CSGB på nerv regenerering. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för IAN återuppbyggnad med en PGA-C tub och etanol-inducerad CSGB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie utfördes i enlighet med de vägledande principerna för vård och användning av djur och godkänts av kommittén för djur forskning vid Kyoto University (Kyoto, Japan, tillståndsnummer: R-16-16). Alla ansträngningar har gjorts att minimera djurens lidande, och alla delar av detta betänkande följer anländer (djur forskning: rapportering av in Vivo -experiment) riktlinjer.
1. tillverkning av PGA-C röret
- För att fabricera konstgjord nerv specialföretaget med hjälp av en resorberbar polyglycolic syra (PGA) rör, Använd en tubulär fläta maskin utrustad med 48 spindlar och fem PGA fibrer, består av buntar av 26 filament (figur 1)18.
- Om du vill återge PGA tube ytan hydrofil, utsätta det för plasma ansvarsfrihet.
- Använda 1% v/w atelocollagen i hydroklorid lösning7.
Obs: Atelocollagen extraheras från svin huden via enzym behandling och utsätts för en viruskontroll. Det huvudsakligen består av typ I (70 – 80%) och typ III kollagen, förhållandet mellan som beskrivs i detalj på annan plats7. Förbereda kollagen lösningen genom upplösning 1 g kollagen i 100 mL hydroklorid lösning (pH = 3.0). Eftersom tätheten av hydroklorid lösningen är cirka 1,0, är w/w kollagen koncentrationen nästan 1%. - Coat röret med kollagen lagren genom att upprepade gånger doppa det i 1% kollagen hydroklorid lösning för 5 s varje gång.
- Efter doppning, torka röret på en ren bänk vid rumstemperatur. Utför nästa doppning efter att röret är helt torr (ca 6 h för lufttorkning).
- Upprepa beläggningsprocessen 10 gånger.
- Ämne PGA-C röret till 140 ° C under 24 h under vakuum (dehydrothermal behandling), för att kontrollera bio-absorption och crosslinking av kollagen molekyler. Utföra hela processen under aseptiska förhållanden.
Obs: Denna procedur genererar en tub med 14-mm slutliga längd, 3-mm innerdiameter och väggtjocklek 50-μm.
2. kirurgiska ingrepp Set-up
- Använd vuxna manliga beagles väger 9.0 till 13,0 kg.
- Hus djur i separata burar, kontrollerade kennel villkor (12-h ljusa och mörka cykel).
- Ge fast föda och vatten ad libitum.
- Väga beagles.
- Autoklav alla kirurgiska instrument.
- Don steriliserad handskar och desinficera alla ytor av operativa inställningen med 80% etanol lösning. Kassera de använda handskarna.
- Utför kirurgisk handtvätt.
- Sätta på en färsk mask, klänning och sterila handskar.
3. anestesi och huden förberedelse
- Söva hunden med en blandning av 5 mg/kg ketamin hydroklorid och 1 mg/kg xylazin genom en intramuskulär injektion.
- Intubation av en tracheal tub 7,5 mm diameter och 25 cm längd.
- Placera hunden på den höger sidoläge. Upprätthålla allmän anestesi med 3,2% sevofluran med syrgas (1,0 L/min).
- Använda en värmedyna för att bibehålla kroppstemperatur på 37 ° C.
- Applicera en oftalmologiska gel över den främre ytan av ögonen för att undvika korneal nötning.
- Noggrant raka operationsområdet (vänster bröstet) använda kirurgiska clippers. Spraya en betydande mängd alkoholhaltiga lösningen över operationsområdet. Vänta minst 15 sec. Upprepa programmet 3 gånger.
- Registrera puls och syremättnad under operation.
4. sämre alveolära nerv återuppbyggnad med PGA-C tube: utvecklingen av den endast återuppbyggnad-modellen
- Injicera 3 mL 1% lidokain med en 27 G nål till den vänstra mandibular gingiva som en lokalbedövning och smärtstillande.
- Utföra en 5-cm tvärgående snitt med nummer 15 skalpell blad i den vänstra mandibular gingiva, att exponera Underkäkar av djuret.
- Använd piezoelektriska ultraljud vibrationer för att slipa den proximala delen av underkäken i en 3 cm × 8-mm rektangel genom bakre mentala foramen.
Obs: Svängningsfrekvensen var 28 \u2012 32 kHz. - Ta bort den främre delen av mandibular ben plattan (dimensioner, 3 cm × 8 mm) för att exponera den vänstra IAN (figur 2A)18.
Obs: Återuppbyggnad webbplatsen motsvarar rot spetsen av den första molar - Transekt IAN med en skalpell för att ta bort en 10 mm-segmentet.
- Infoga proximala och distala stubbarna av avhuggna nerv i nerv röret till ett djup av 2 mm.
- Använd 8-0 nylon suturer och kirurgiska Mikroskop med 8 X förstoring att suturera röret till proximala och distala nerven slutar (figur 2B)18.
- Returnera ben plattan till sin ursprungliga plats i underkäken.
- Nära såret med 4-0 nylon suturer.
- En dag efter operation, bekräfta att den mandibular ben plattan är i korrekt läge.
- 4.10.1 utföra datortomografi (CT) imaging av ansiktet ben under narkos. Ange parametrar för CT enligt följande: 120 kVp, 200 mAs, 0,5 mm/s, 0.5-mm skiva tjocklek.
- Administrera anestesi med en blandning av 5 mg/kg ketamin hydroklorid och 1 mg/kg xylazin (figur 3).
- 4.10.1 utföra datortomografi (CT) imaging av ansiktet ben under narkos. Ange parametrar för CT enligt följande: 120 kVp, 200 mAs, 0,5 mm/s, 0.5-mm skiva tjocklek.
- Administrera ampicillin (100 mg/dag) som ett antibiotikum och paracetamol (100 mg/dag) som ett smärtstillande medel för en vecka efter operationen.
5. etanol-inducerad CSGB: utveckling av återuppbyggnad + CSGB modell
- Utför IAN återuppbyggnad som beskrivs i avsnitt 4 och tillåta en vecka för återhämtning.
- Söva djuret med 1,5% sevofluran i syre (4 L/min) och luft (6 L/min). Raka och rena avsedda operationsområdet, som beskrivs i avsnitt 3.
- Markera raden snitt med en kirurgisk hud markör genom att rita en linje på vänster sida bröstet (figur 4, raden snitt är 20 cm i längd).
- Injicera 5 mL 1% lidokain med en 21 G nål till vänster bröstet som en lokalbedövning och smärtstillande.
- Incisionsfilm vänster bröst huden med nummer 10 skalpell blad.
- Incisionsfilm fett lager med en elektrisk skalpell att exponera den muskel fascian.
- Exponera serratus ventralis muskler och scalenus muskel.
- Höja serratus ventralis muskel och scalenus muskel från ventrala till dorsala att exponera andra och tredje revbenen (figur 5).
- Utföra en vänster laterala torakotomi på den andra och tredje interkostalrummet att exponera den vänstra cervikala sympatiska ganglion (figur 6).
- Injicera 0,2 mL etanol 99,5% i den cervikala sympatiska ganglion använder en 30 G nål under direkt visualisering (figur 7).
- Stäng interkostalrummet med avbrutna 1-0 resorberbar stygn.
- Nära huden med avbrutna 3-0 nylon stygn.
- Administrera ampicillin (100 mg/dag) som ett antibiotikum och paracetamol (100 mg/dag) som ett smärtstillande medel för en vecka efter operationen.
- 1 vecka efter CSGB, Mät ansiktshud temperatur med IR Termografi att bekräfta CSGB.
6. elektrofysiologiska Recordings
- För att mäta sensoriska nerver aktionspotential (SNAP) och sensorisk nerv överledning hastighet (SCV) av IAN tre månader efter rekonstruktion, söva djur som beskrivs i avsnitt 3.
Obs: SNAPIN och SCV bör mätas på både experimentell och normal kontroll sidorna för varje hund i båda behandlingsgrupperna. - Gör ett snitt i den vänstra mandibular gingiva med nummer 10 skalpell blad.
- Ta försiktigt bort den mandibular ben plattan för att undvika att fysiskt skada regenererad nerven.
- Stimulera den IAN använder ett par visarelektroderna, för att registrera SNAPIN och SCV.
- Sätt elektroderna proximalt till nerv specialföretaget.
- Applicera 10-kHz elektrisk stimulans 20 gånger.
- Analysera resultaten.
- Bestämma SNAPIN genom att beräkna den genomsnittliga svar amplituden till elektrisk stimulering.
- Mäta peak latens och maximal amplitud av diagram inspelningar.
- Beräkna indexet återhämtning med följande ekvation: maximal amplitud av den vänstra IAN den återuppbyggnad-bara eller återuppbyggnad + CSGB grupp / topp amplituden av den normala kontrollen (centrala segment av den högra IAN i gruppen endast återuppbyggnad)19 ,20.
7. histologisk analys
-
Avsnittet förberedelse
- Tre månader efter rekonstruktion, skörda den vänstra IAN, inklusive 1 cm av nerven på vardera sidan av den rekonstruerade webbplatsen.
- Skörda den rätt IAN på den nivå som motsvarar skörden platsen på vänster sida.
- Prefix skördade nerverna genom nedsänkning i 2,5% glutaraldehyd i en 0,1 M cacodylate buffertlösning (pH 7,4, 48 ° C, 24 h).
- Postfix med 2% osmium vanligtvis lösning (48 ° C, 4 h) och kaliumferrocyanid i 0,1 M fosfatbuffertlösning (pH 7,4, 2 h).
- Torka nerverna med en serie av graderade etanol lösningar.
- Bädda in i epoxiharts (paraffin).
- Avsnitt exemplaren med en tjocklek på 0,5 \u2012 1,0 μm.
-
Toluidin blå färgning och Morfologisk analys
- Fläcken sektioner med toluidinblått blå lösning.
- Erhålla mikroskopi bilder med ett optiskt mikroskop, 400 X förstoring på följande regioner längs proverna: lämnade IAN, centrera av regenererad segment och 2 mm distalt till stubben; rätt IAN, i mitten av segmentet IAN motsvarar skörden platsen på vänster sida.
- Välj bilder för alla regioner med regenererad nervfibrer.
- Slumpmässigt utvalda 8 \u2012 10 områden av 100 μm × 100 μm innehållande regenereras nervfibrer.
- Utföra Morfologisk analys med hjälp av en lämplig programvara för att mäta följande parametrar: myeliniserade nerv fiber diameter (μm) och densitet (greve/område), nerv vävnad procentsats och G-ratio (myeliniserade axon diameter/myeliniserade nerv fiber diameter ).
-
Immunfärgning
- Följ standardprotokoll för paraffin avsnitt färgning.
- Inkubera med primära antikroppar för 30 min vid 25 ° C.
- Tvätta med fosfatbuffrad koksaltlösning 3 gånger vid 25 ° C.
- Inkubera med sekundära antikroppar märkta med pepparrotperoxidas-för 30 min vid 25 ° C.
- Få bilder med ett ljusmikroskop.
-
Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Förbereda nerver som beskrivs i steg 7,1.
- Avsnitt nerver med en tjocklek på 70 \u2012 90 μm med hjälp av en ultramicrotome.
- Fläcken sektioner med Reynolds bly citrat och uranyl.
- Undersöka och bild av transmissionselektronmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi observerat en ökning i ansiktshud temperaturen av blockerade sida 1 vecka efter den vänstra CSGB (figur 8).
Vid 3 månader efter rekonstruktion, PGA-C röret på området återuppbyggnad absorberades och regenerering av den sämre alveolära nerven observerades i den återuppbyggnad-bara och återuppbyggnad + CSGB grupper (figur 9A, B)18.
SNAPIN var mätbar i båda återuppbyggnad sidor av återuppbyggnad + CSGB och återuppbyggnad-endast grupper. Resultaten av elektrofysiologiska utvärderingen sammanfattas i tabell 118. Återhämtning indexet och SCV var signifikant högre i återuppbyggnaden + CSGB än i gruppen endast för återuppbyggnad.
Vi observerade myeliniserade nervtrådar på centrala och distala segment av den regenererade IAN i den återuppbyggnad-bara och återuppbyggnad + CSGB grupper (figur 10A, B)18. Den rekonstruktion-bara och återuppbyggnad + CSGB grupper visade mindre regenereras myeliniserade nerv diametrar jämfört med normala kontrollgruppen (centrala segment av den högra IAN i gruppen återuppbyggnad, figur 10C). Omogna myeliniserade nervfibrer observerades också.
Prövning av den återuppbyggnad-bara, återuppbyggnad + CSGB grupper som använder TEM visade regenererad myeliniserade nervfibrer och Schwann celler (figur 10D, E). Figur 10F visar dessa resultat av TEM för normala kontrollgruppen (centrala segment av den högra IAN i gruppen rekonstruktion).
Förekomsten av regenererad axoner och Schwann celler bekräftades vid de centrala och distala segment av den återuppbyggnad-bara och återuppbyggnad + CSGB grupper, genom färgning med anti neurofilament (NF) och anti-S100 antikroppar, respektive (figur 11 )18.
Morfologisk utvärderingsresultaten sammanfattas i tabell 218. Myeliniserade nerv fiber diameter i mitten av segmentet regenererad vänster IAN var 4,27 ± 1,5 µm i gruppen återuppbyggnad och 5.11 ± 1,98 µm i gruppen CSGB, medan i det distala segmentet av den regenererade vänster IAN diameter var 3,47 ± 1,21 µm i initiativ tion-gruppen och 4,53 ± 1,36 µm i gruppen CSGB. I båda fallen var diametern betydligt större i gruppen CSGB, som också visade en signifikant högre myeliniserade nerv fiber densitet och nerv vävnad andel i både centrum och distala segmentet av den regenererade vänster IAN. G-förhållandet i mitten av den regenererade vänster IAN var 0,75 ± 0,04 i gruppen återuppbyggnad och 0,68 ± 0,05 i gruppen CSGB medan den distala delen var 0,74 ± 0,04 i gruppen återuppbyggnad och 0,69 ± 0,04 i gruppen CSGB. Således i båda fallen var G-förhållandet betydligt mindre i gruppen CSGB.
Provets storlekar för den återuppbyggnad-bara och återuppbyggnad + CSGB grupper var n = 7. De statistiska analyserna för myeliniserade nerv fiber diameter och densitet, G-ratio och SCV utfördes med Dunnetts test. Analys av indexet återhämtning utfördes med hjälp av en oparade Student's t-test. Nivån på statistisk signifikans fastställdes till 5% (p < 0,05).
Figur 1: Polyglycolic syra tube fylld med kollagen svamp. A) grov bild av röret. De slutliga dimensionerna nerv specialföretagets var 14 mm längd, 3 mm innerdiameter och väggtjocklek 50 µm. B) Scanning electron Mikrograf av röret. Denna siffra har tidigare publicerats av Shionoya o.a. 18 och återges med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: vänster sämre alveolära nerv (IAN) före och efter återuppbyggnaden. A) före rekonstruktionen bilden av den vänstra IAN efter att exponeras genom avlägsnande av ben. B) efter återuppbyggnaden bilden av den vänstra IAN rekonstrueras med hjälp av en polyglycolic syra-kollagen tube. Denna siffra har tidigare publicerats av Shionoya o.a. 18 och återges med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: beräknad tomografisk avbildning av facial benet efter lämnade sämre alveolära nerv återuppbyggnad. Bilden visar att mandibular ben plattan är i rätt position. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: preoperativ hud markeringar på vänster sida bröstet före kirurgi. Fotografiet visar märkningarna som huden innan du utför cervikala sympatiska ganglion blocket. Snitt linjen är 20 cm i längd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: rörelsens syn på cervikala sympatiska ganglion blocket: före torakotomi. Bilden visar de andra och tredje revben efter att höja serratus ventralis och scalenus musklerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: rörelsens syn på cervikala sympatiska ganglion blocket: efter torakotomi. Bilden visar den vänstra cervikala sympatiska ganglion efter laterala torakotomi på den andra och tredje interkostalrummet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: cervikala sympatiska ganglion före och efter etanol injektion med en 30 G nål. A) Pre etanol injektion bilden av den vänstra cervikala sympatiska ganglion. B) efter etanol injektion bilden av den vänstra cervikala sympatiska ganglion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: TERMOGRAM efter vänster cervikala sympatiska ganglion block (CSGB). TERMOGRAM förvärvades en vecka efter CSGB av etanol injektion. Observera att ansiktshud temperaturen på vänster sida är högre än på den kontralaterala sidan. Färgfältet visar temperatur i ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: regenereras sämre alveolära nerv (IAN). En) bild av IAN i gruppen endast för återuppbyggnad. B) bild av IAN i CSGB (cervikala sympatiska ganglion block) gruppen + återuppbyggnad. Nerv regenerering (region mellan vita pilspetsar) observeras i båda grupperna. Denna siffra har tidigare publicerats av Shionoya o.a. 18 och återges med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: toluidin blå och överföring elektronmikroskopi analys av den regenererade sämre alveolära nerven (IAN). En - C) semi tunna tvärgående snitt av IAN på 3 månader efter rekonstruktion med toluidinblått färgas blå. Bilderna visar de distala segment av den regenererade vänster IAN i varje grupp, som anges. D - F) överföring elektronmikroskopi bilder från semi tunna snitt visar myeliniserade och icke-myeliniserade nervfibrer (svart och vit pilspetsar, respektive). Skala staplarna representerar 50 µm (a) - (C) och 5 µm (D) - (F). Normal styrning: centrala segment av den högra IAN i gruppen endast för återuppbyggnad. Denna siffra har tidigare publicerats av Shionoya o.a. 18 och återges med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: immunhistokemisk analys av distala segment av regenererad vänster sämre alveolära nerv (IAN). A, B) delar av den regenererade IAN på 3 månader efter återuppbyggnaden färgas med en anti neurofilament (NF) antikropp för återuppbyggnad-bara grupp (A) och återuppbyggnad + cervikala sympatiska ganglion block (CSGB; (B) grupper. Svart pilspetsar visar regenererad axoner. C, D) delar av den regenererade IAN på 3 månader efter återuppbyggnaden färgas med en anti-S-100 antikropp för återuppbyggnad-bara gruppen (C) och återuppbyggnad + CSGB (D) grupper. Vita pilar indikerar Schwann celler. Skala barer, 50 µm. Denna siffra har tidigare publicerats av Shionoya o.a. 18 och återges med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Sensorisk nerv överledning (m/s) | Återhämtning index | |
| Normal styrning | 48,5 ± 2,8 | - |
| Endast återuppbyggnad-gruppen | 36,8 ± 2.9* | 0.22 ± 0,04 |
| Återuppbyggnad + CSGB grupp | 42,0 ± 2.4*# | 0,35 ± 0,06# |
Tabell 1: elektrofysiologiska fynd i den sämre alveolära nerv (IAN) 3 månader efter operation. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (n = 7). Jämförelser gjordes med hjälp av en oparade Student's t-test. IAN, sämre alveolära nerv; CSGB, cervikala sympatiska ganglion block. *, p < 0,05 jämfört med normala kontrollgruppen; #, p < 0,05 jämfört med gruppen endast för återuppbyggnad. Normal styrning: centrala segment av den högra IAN i gruppen endast återuppbyggnaden; Återhämtning index: förhållandet mellan peak amplituden av den vänstra IAN den återuppbyggnad-bara eller återuppbyggnad + CSGB grupp till peak amplituden av den normala kontrollen. Denna tabell har tidigare publicerats av Shionoya o.a. 18 och återges med tillstånd.
| Myeliniserade nerv fiber diameter (μm) | Myeliniserade nerv fiber densitet (antal/100 μm2) | Andel av nervvävnad (%) | Baserat på G | ||
| Normal styrning | Center | 8.83 ± 3.11 | 103 ± 8 | 41,3 ± 3.9 | 0,62 ± 0,03 |
| Endast återuppbyggnad-gruppen | Center | 4,27 ± 1.5* | 126 ± 20 * | 11.6 ± 2.1* | 0,75 ± 0.04* |
| Distala | 3,47 ± 1.21* | 109 ± 17 * | 7,3 ± 2.0* | 0,74 ± 0.04* | |
| Återuppbyggnad + CSGB grupp | Center | 5.11 ± 1.98*# | 140 ± 22 *# | 15,9 ± 3.0*# | 0,68 ± 0.05*# |
| Distala | 4.53 ± 1.36*$ | 123 ± 15 *$ | 12,5 ± 2.1*$ | 0.69 ± 0.04*$ | |
Tabell 2: morfologiska fynd i den sämre alveolära nerven (IAN) 3 månader efter operation. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (n = 7). Jämförelser gjordes med Dunnetts test. IAN, sämre alveolära nerv; CSGB, cervikala sympatiska ganglion block. *, p < 0,05 jämfört med normala kontrollgruppen; * #, p < 0,05 jämfört med det centrala segmentet av den vänstra IAN i gruppen endast återuppbyggnaden; * $,p < 0,05 jämfört med den distala änden av den vänstra IAN i gruppen endast för återuppbyggnad. Normal styrning: centrala segment av den högra IAN i gruppen endast återuppbyggnaden; G förhållandet är förhållandet av myeliniserade axon diameter totala myeliniserade fiber diameter. Denna tabell har tidigare publicerats av Shionoya o.a. 18 och återges med tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar en effektiv metod för IAN regenerering med ett biokompatibla nerv rör i kombination med etanol-inducerad CSGB. I denna studie används hundar, sen andra djurmodeller, som möss, råttor och kaniner, har en kort medellivslängd och liten kroppsstorlek, och därmed inte kan användas för att utföra exakt kirurgiska procedurer. Eftersom IAN ligger inom kanalen mandibular omgiven av ben, är en kirurgisk teknik nödvändigt att undvika nerv och blodkärl skador när du utför nerv återuppbyggnad. Ett viktigt tekniskt tips för förfarandet är att noggrant avlägsna mandibular ben plattan för att minimera risken för nerv och fartyg skador. Traditionella burs och micro sågar skilja inte mellan hårda och mjuka vävnad21. Dessutom, tenderar dessa verktyg att glida orsakar skada intilliggande vävnad, speciellt IAN, genom oavsiktlig kontakt22. Vi använde därför piezoelektriska kirurgiska verktyg för benet bearbetningssteg. Detta är en ny och innovativ ben kirurgi teknik som använder ultraljud microvibrations av specialiserade skalpeller. Därför, mjuk vävnad inte är skadade även vid oavsiktlig kontakt med skärande tips23,24. Microvibrations 60-200 µm/s vid 24-29 kHz är optimala för att skära elastisk mineraliserad vävnad samtidigt skona elastisk mjukvävnad; Detta är inte möjligt på frekvenser över 50 kHz25. Roterande burs eller oscillerande sågar krävs dessutom en kraft att motverka den rotation eller vibrationer av instrumentet. Jämfört med dessa instrument, piezoelektriska kirurgiska verktyg behöver inte tillämpningen av extra kraft och så säkra och korrekt ben bearbetning är möjligt26. Detta är särskilt viktigt i händerna på en ny användare.
En annan viktig aspekt i vår metod är att Ben plattan inte fixades med hjälp av metalliskt plattor men placerades i sin ursprungliga position i underkäken efter placering av PGA-C röret. Anledningen till detta var att undvika risken för exponering av plattan för oral slemhinne nekros, som uppstår när du använder metalliska plattor för fixering. Dock i vissa fall avvikit ben plattan från den ursprungliga platsen. Därför är det viktigt att utföra en datortomografi av ansiktet ben att bekräfta att den mandibular ben plattan är i rätt position efter operation. När du använder en metallplatta för fixering, bör tät suturering undvikas eftersom det kan orsaka oral slemhinne nekros på grund av blod flöde störningar.
CSGB är en effektiv behandling för perifera vaskulära sjukdomar och smärtsyndrom av ansikte och hals13,14,15. Mekanismerna bakom dess terapeutiska effekter är dock fortfarande oklart. En orsak till bristen på forskning om de terapeutiska effekterna av CSGB är svårighet att få en konsekvent och enhetlig sympatikolytiska effekt. Spridningen av sympatisk blockad efter perkutan CSGB är exempelvis inte enhetlig27,28. MULLENHEIM o.a. 29 implanteras hundar med en polyeten kateter, efter torakotomi, under fascian och tillsammans med övre sympatiska kedjan, och utförde CSGB genom att injicera lidokain via katetern. Även om detta tillvägagångssätt kan sprida sympatisk blockad på målområdena, medför det risker för katetern ocklusion eller störningen, samt infektion, särskilt i långsiktiga experiment. I vår hund modell av CSGB produceras direkt injektion av 99,5% etanol långsiktig ökning av blodflödet till ipsilaterala orofacial regionen. I vår strategi gavs blockera injektionen under direkt visualisering, så CSGB kunde utföras med precision. Därför minskar vår strategi risken för ojämnt fördelad sympatikolytiska effekten och sympatisk blockad. Detta anses vara en fördel särskilt i långsiktiga experiment. Dessutom använde vi Termografi bekräftar framgången för CSGB, eftersom ansiktshud temperatur ökar på blocket sida vid framgångsrika CSGB. I det här fallet är Termografi användbart eftersom det är enkelt och icke-invasiv. Ännu viktigare, bör nasalen och inte ansiktshud temperaturen mätas, eftersom den inte påverkas av hundens hår. Vår modell kan bidra till ytterligare forskning om de terapeutiska effekterna av CSGB. I vår tidigare studie ökade blodflödet i området orofacial för 6-11 veckor efter cervikala sympatiska ganglionectomy. Forskare kan välja detta alternativ metod30 om så önskas.
Begränsning av denna studie är att etanol-inducerad CSGB utgör risken för att utveckla permanent Horners syndrom (ptos och Mios)31. Andra metoder, inklusive radiofrekvent ablation, fenol och sympatiska ganglionectomy har använts för att utföra sympathectomies; men specifikt för sympathectomy av cervikala sympatiska ganglion, har endast radiofrekvent ablation varit anställd i klinisk praxis32,33,34,35. Därför kan radiofrekvent ablation och lokalanestetika betraktas som en alternativ metod till etanol-inducerad CSGB. Framtida studier skulle vara nödvändig för att validera hur nerv regenerering medieras av ett biokompatibla nerv rör kan förbättras genom CSGB med lokalbedövning eller radiofrekvent ablation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av institutionen av Bioartificial organ i Kyoto University Institute för Frontier medicinsk vetenskap. Vi vill tacka den veterinära personalen vid Institutet för medicinsk spetsforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMP Collagen PS | Nippon Meatpackers | 301-84621 | Atelocollagen extracted from young porcine skin by enzyme treatment |
| Surgical clippers | Roboz Surgical Instrument Company | RC-5903 | |
| Disposable scalpel (No.15) | Kai medical | 219ABBZX00073000 | |
| VarioSurg3 | Nakanishi | VS3-LED-HPSC, E1133 | Piezoelectric surgery for bone processing |
| 4-0 nylon sutures | Ethicon | 8881H | |
| 8-0 nylon sutures | Ethicon | 2775G | |
| Isepamicin sulfate | Nichi-Iko | 620005641 | |
| Disposable scalpel (No.10) | Kai medical | 219ABBZX00073000 | |
| 30-gauge needle | Nipro | 1134 | |
| 1-0 absorbable stitches | Ethicon | J347H | |
| 3-0 Nylon stitches | Ethicon | 8872H | |
| Neo Thermo | NEC Avio | TVS-700 | Infrared thermography |
| Neuropack Σ | NIHON KOHDEN | MEB-5504 | Orthodromic recorder for electrophysiological recording |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Light microscope | Keyence | BZ-9000 | |
| Mouse anti-human neurofilament protein monoclonal antibody | DAKO | N1591 | |
| Polyclonal rabbit anti-S100 antibody | DAKO | Z0311 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi High Technologies | Hitachi H-7000 | |
| Dynamic cell count | Keyence | BZ-H1C | Software for morphological evaluation |
References
- Al-Sabbagh, M., Okeson, J. P., Bertoli, E., Medynski, D. C., Khalaf, M. W. Persistent pain and neurosensory disturbance after dental implant surgery: prevention and treatment. Dental Clinics of North America. 59 (1), 143-156 (2015).
- Chaushu, G., Taicher, S., Halamish-Shani, T., Givol, N. Medicolegal aspects of altered sensation following implant placement in the mandible. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 17 (3), 413-415 (2002).
- Robinson, P. P., Loescher, A. R., Yates, J. M., Smith, K. G. Current management of damage to the inferior alveolar and lingual nerves as a result of removal of third molars. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 42 (4), 285-292 (2004).
- Gregg, J. M. Studies of traumatic neuralgia in the maxillofacial region: symptom complexes and response to microsurgery. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 48 (2), 135-140 (1990).
- Pogre, M. A. The results of microneurosurgery of the inferior alveolar and lingual nerve. Journal of Oral and Maxillofacial Sureryg. 60 (5), 485-489 (2002).
- Strauss, E. R., Ziccardi, V. B., Janal, M. N. Outcome assessment of inferior alveolar nerve microsurgery: a retrospective review. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 64 (12), 1767-1770 (2006).
- Nakamura, T., et al. Experimental study on the regeneration of peripheral nerve gaps through a polyglycolic acid-collagen (PGA-collagen) tube. Brain Research. 1027 (1-2), 18-29 (2004).
- Yoshitani, M., et al. Experimental repair of phrenic nerve using a polyglycolic acid and collagen tube. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 133 (3), 726-732 (2007).
- Seo, K., et al. One-year outcome of damaged lingual nerve repair using a PGA-collagen tube: a case report. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 66 (7), 1481-1484 (2008).
- Seo, K., et al. Protracted delay in taste sensation recovery after surgical lingual nerve repair: a case report. Journal of Medical Case Reports. 7, 77 (2013).
- Seo, K., Terumitsu, M., Inada, Y., Nakamura, T., Shigeno, K., Tanaka, Y. Prognosis after surgical treatment of trigeminal neuropathy with a PGA-c tube: report of 10 Cases. Pain Medicine. 17 (12), 2360-2368 (2016).
- Okuda, Y., Kitajima, T. Comparison of stellate ganglion block with intravascular infusion of prostaglandin e1 on brachial artery blood flow in dogs. Anesthesia and Analgesia. 84 (6), 1329-1332 (1997).
- Kohjitani, A., Miyawaki, T., Kasuya, K., Shimada, M. Sympathetic activity-mediated neuropathic facial pain following simple tooth extraction: a case report. Cranio. 20 (2), 135-138 (2002).
- Melis, M., Zawawi, K., al-Badawi, E., Lobo Lobo, S., Mehta, N. Complex regional pain syndrome in the head and neck: a review of the literature. Journal of Orofacial Pain. 16 (2), 93-104 (2002).
- Salvaggio, I., Adducci, E., Dell'Aquila, L., Rinaldi, S., Marini, M., Zappia, L., Mascaro, A. Facial pain: a possible therapy with stellate ganglion block. Pain Medicine. 9 (7), 958-962 (2008).
- Atsumi, M., Sunada, K. The effect of superior cervical ganglion resection on peripheral facial palsy in rats. Journal of Anesthesia. 30 (4), 677-683 (2016).
- Hanamatsu, N., Yamashiro, M., Sumitomo, M., Furuya, H. Effectiveness of cervical sympathetic ganglia block on regeneration of the trigeminal nerve following transection in rats. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 27 (3), 268-276 (2002).
- Shionoya, Y., Sunada, K., Shigeno, K., Nakada, A., Honda, M., Nakamuram, T. Can nerve regeneration on an artificial nerve conduit be enhanced by ethanol-induced cervical sympathetic ganglion block? PLoS One. 12 (12), e0189297 (2017).
- Suzuki, Y., Tanihara, M., Ohnishi, K., Suzuki, K., Endo, K., Nishimura, Y. Cat peripheral nerve regeneration across 50 mm gap repaired with a novel nerve guide composed of freeze-dried alginate gel. Neuroscience Letters. 259 (2), 75-78 (1999).
- Ichihara, S., et al. Development of new nerve guide tube for repair of long nerve defects. Tissue Engineering, Part C, Methods. 15 (3), 387-402 (2009).
- Grenga, V., Bovi, M. Piezoelectric surgery for exposure of palatally impacted canines. Journal of Clinical Orthodontics. 38, 446-448 (2004).
- Degerliyurt, K., Akar, V., Denizci, S., Yucel, E. Bone lid technique with piezosurgery to preserve inferior alveolar nerve. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 108 (6), e1-e5 (2009).
- Kotrikova, B., et al. Piezosurgery--a new safe technique in cranial osteoplasty? International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 35 (5), 461-465 (2006).
- Vercellotti, T. Piezoelectric surgery in implantology: a case report-a new piezoelectric ridge expansion technique. International Journal of Periodontics and Restorative Dentistry. 20 (4), 358-365 (2000).
- Stübinger, S., Kuttenberger, J., Filippi, A., Sader, R., Zeilhofer, H. F. Intraoral piezosurgery: Preliminary results of a new technique. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 63 (9), 1283-1287 (2005).
- Eggers, G., Klein, J., Blank, J., Hassfeld, S. Piezosurgery: an ultrasound device for cutting bone and its use and limitations in maxillofacial surgery. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 42 (5), 451-453 (2004).
- Hardy, P. A., Wells, J. C. Extent of sympathetic blockade after stellate ganglion block with bupivacaine. Pain. 36 (2), 193-196 (1989).
- Hogan, Q. H., Erickson, S. J., Haddox, J. D., Abram, S. E. The spread of solutions during stellate ganglion block. Regional Anesthesia. 17 (2), 78-83 (1992).
- Mullenheim, J., et al. Left stellate ganglion block has only small effects on left ventricular function in awake dogs before and after induction of heart failure. Anesthesia and Analgesia. 91 (4), 787-792 (2000).
- Tsujimoto, G., Sunada, K., Nakamura, T. Effect of cervical sympathetic ganglionectomy on facial nerve reconstruction using polyglycolic acid-collagen tubes. Brain Research. 1669, 79-88 (2017).
- Ghai, A., Kaushik, T., Kumar, R., Wadhera, S. Chemical ablation of stellate ganglion for head and neck cancer pain. Acta Anaesthesiologica Belgica. 67 (1), 6-8 (2016).
- Forouzanfar, T., van Kleef, M., Weber, W. E. Radiofrequency lesions of the stellate ganglion in chronic pain syndromes: retrospective analysis of clinical efficacy in 86 patients. Clinical Journal of Pain. 16 (2), 164-168 (2000).
- Ohno, K., Oshita, S. Transdiscal lumbar sympathetic block: a new technique for a chemical sympathectomy. Anesthesia and Analgesia. 85 (6), 1312-1316 (1997).
- Slappendel, R., Thijssen, H. O., Crul, B. J., Merx, J. L. The stellate ganglion in magnetic resonance imaging: a quantification of the anatomic variability. Anesthesiology. 83 (2), 424-426 (1995).
- Wang, Y. C., Wei, S. H., Sun, M. H., Lin, C. W. A new mode of percutaneous upper thoracic phenol sympathicolysis: report of 50 cases. Neurosurgery. 49 (3), 628-634 (2001).
