Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Этанол индуцированной шейного ганглия симпатичная(ый) блок приложений для содействия регенерации собак нижнеальвеолярного нерва с помощью искусственных нерва

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58039
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3
1Department of Dental Anesthesia, Nippon Dental University Hospital at Tokyo, 2Department of Dental Anesthesiology, Nippon Dental University School of Life Dentistry at Tokyo, 3Department of Bioartificial Organs, Institute for Frontier Medical Science, Kyoto University

Summary

Мы оценивали влияние шейного ганглия симпатичная(ый) блока на нерв ремонт с использованием искусственных нервных проводников. Мужчины Бигл собак были каждый имплантируются с искусственным нерва через 10-мм разрыв в левого нижнего альвеолярного нерва; левый шейного ганглия симпатичная(ый) был заблокирован путем инъекций 99,5% этанола через боковые торакотомии.

Abstract

Полигликолидная кислота коллагена (PGA-C) трубы являются Био рассасывающиеся нерва трубы заполнены с коллагеном многокамерные структуры, которые состоят из тонких коллагена фильмов. Благоприятные клинические результаты были достигнуты при использовании эти трубы для лечения поврежденных нижнеальвеолярного нерва (IAN). Решающим фактором для успешного нерва регенерации с помощью трубки PGA-C является кровоснабжение в окружающие ткани. Симпатичная(ый) шейного ганглия блок (CSGB) создает симпатическая блокада в регионе головы и шеи, таким образом увеличивая приток крови в этом районе. Для обеспечения адекватного эффекта, блокада должна управляться с местной анестезией один-два раза в сутки в течение нескольких недель подряд; Это создает проблему при создании животных моделей для расследования этой техники. Чтобы устранить это ограничение, мы разработали этанола индуцированной CSGB в собачьей модели долгосрочного увеличения притока крови в регионе орофациалъная. Мы рассмотрели ли Ян регенерации через PGA-C трубки имплантации может быть повышена благодаря этой модели. Четырнадцать гончих каждый были имплантированы с PGA-C трубки через 10-мм разрыв в левой Ян. Ян расположен в нижнечелюстной канал, окруженный кости, поэтому мы выбрали пьезоэлектрический хирургии, состоящий из ультразвуковых волн, для обработки костей, с тем чтобы свести к минимуму риск повреждения нерва и судна. Хороший результат хирургического был получен с этим подходом. Через неделю после операции, семь из этих собак были подвергнуты левой CSGB путем инъекций этанола. Этанол индуцированной CSGB привели к улучшению нерва регенерации, предполагая, что увеличение кровотока эффективно способствует регенерации нервных Ян дефекты. Эта собак модель может способствовать дальнейшие исследования по вопросу о долгосрочных последствиях CSGB.

Introduction

Во многих случаях травматических повреждений нижнеальвеолярного нерва (Ян) ятрогенные, часто вызваны извлечения третьего моляра или размещение импланты1,2,3. Травмы Ян может привести к дефицита в тепловой и сенсорных ощущений парестезия, dysesthesia, гипестезия, а также аллодиния. Повреждение нерва рассматривается не только консервативной терапии, но и другие методы, включая сшивания и аутотрансплантатом размещения. Однако эти методы имеют недостатки, которые часто включают в себя отсутствие улучшения симптомов и неврологических дефектов на доноров сайт4,5,6.

Искусственные нерва — трубка Полигликолидная кислота коллаген (PGA-C) был первоначально разработан в Японии. Это био рассасывающиеся трубка с его внутренней люмен, заполнены с губчатой коллаген7. В экспериментов на животных эта трубка была использована для повышения регенерации нервных в Бигл собак с дефектом малоберцового нерва и была показана способствовать высокий уровень восстановления чем трансплантации аутологичных нерв8. Клиническое применение трубки PGA-C началось в 2002 году в больных с повреждений периферических нервов. Кроме того благоприятные клинические результаты были достигнуты в лечении тройничного нерва нейропатия (IAN и язычной нерва)9,10,11. Решающим фактором для успешного нерва регенерации с помощью трубки PGA-C является кровоснабжение в окружающие ткани8. Симпатичная(ый) шейного ганглия блок (CSGB) создает симпатическая блокада в регионе головы и шеи и увеличивает приток крови к соответствующей области иннервируемые12; Таким образом он был использован в лечении комплекс регионального болевого синдрома и недостаточность кровообращения13,14,15. Однако там были лишь несколько экспериментальных исследований эффективности CSGB в крови увеличение потока16,17. Для обеспечения надлежащей эффективности CSGB, блокада должны применяться совместно с местной анестезией один или два раза ежедневно в течение нескольких недель, таким образом создает вызов при генерации животных моделей для расследования этой техники. Для решения это ограничение, в предыдущем исследовании, мы разработали модель собак долгосрочное увеличение кровотока в регионе орофациалъная18. Модель была создана, выполняя CSGB путем инъекций 99,5% этанола. Мы оценивали устные слизистой оболочки ЖКТ потока и температуры кожи носа Лазерная доплеровская флоуметрия и инфракрасная термография один раз в неделю в течение 12 недель. Мы обнаружили, что поток крови орофациалъная региона была увеличена на 7 – 10 недель в этой модели.

В настоящем исследовании мы оценивали эффекты этанола индуцированной CSGB на регенерацию нерва.
PGA-C трубки был имплантирован в Бигл собак через 10-мм разрыв в левой Ян. Неделю спустя, CSGB была выполнена путем инъекций этанола. Через три месяца после операции, мы провели целый ряд электрофизиологических, гистологические и морфологических исследований для оценки воздействия CSGB на регенерацию нерва. Мы предоставляем подробный протокол для реконструкции Ян, с помощью трубки PGA-C и этанола индуцированной CSGB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Это исследование было проведено в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования животных и утверждена Комитетом для животных исследований университета Киото (Киото, Япония; номер авторизации: R-16-16). Были предприняты все усилия для сведения к минимуму страдания животных, и все разделы настоящего доклада придерживаться прибытие (животное исследования: отчетность в естественных условиях экспериментов) руководящие принципы.

1. Изготовление трубки PGA-C

  1. Для изготовления искусственных нерва канала с помощью рассасывающиеся Полигликолидная кислота (PGA) трубки, используйте трубчатые плетение машина оснащена 48 шпинделей и пяти PGA волокон, состоящая из пучков 26 нитей (рис. 1)18.
  2. Чтобы отрисовать поверхность трубки PGA гидрофильные, подвергайте его плазмы разряда.
  3. Используйте 1% v/w кожи гидрохлорида раствор7.
    Примечание: Кожи извлекается из свиной кожи через фермента лечения и подвергается проверку вируса. Он главным образом состоит из типа I (70-80%) и тип III коллагена, отношение которого подробно изложены в других местах7. Приготовляют раствор коллагена, растворяя коллагена 1 г в 100 мл гидрохлорида раствор (pH = 3.0). Поскольку плотность раствора гидрохлорид приблизительно 1.0, w/w коллаген концентрация составляет почти 1%.
  4. Слой трубку с коллагеном слои, неоднократно окунать его в 1% раствор гидрохлорида коллагена для 5 s каждый раз.
    1. После погружения, сухие трубку на лавочке чистой при комнатной температуре. Выполнение следующего погружения после того, что трубка полностью высохнет (около 6 ч для воздушной сушки).
    2. Повторите процесс покрытия 10 раз.
  5. Тема трубки PGA-C до 140 ° C для 24 h под вакуумом (dehydrothermal лечение), для того чтобы контролировать био поглощение и сшивки молекул коллагена. Выполните весь процесс в асептических условиях.
    Примечание: Данная процедура создает трубки конечной длины 14-мм, внутренний диаметр 3 мм и толщиной стенки 50 мкм.

2. хирургическая процедура настройки

  1. Используйте взрослых мужчин гончих, весом 9.0 до 13,0 кг.
    1. Дом животные в отдельных клетках, в условиях контролируемой питомника (12-h светлых и темных цикла).
    2. Обеспечивают твердой пищи и воды ad libitum.
  2. Весят гончих.
  3. Автоклав всех хирургических инструментов.
  4. Дон стерилизованное Перчатки и продезинфицируйте все поверхности эксплуатации установки с 80% этанола раствор. Выбросите перчатки.
  5. Выполняют хирургические для мытья рук.
  6. Наденьте маску свежие, платье и стерильные перчатки.

3. анестезия и подготовки кожи

  1. Анестезировать собаку с смесью кетамина гидрохлорид 5 мг/кг и ксилазина 1 мг/кг внутримышечно.
  2. Интубации трахеи трубку диаметром до 25 см длиной 7,5 мм.
  3. Место собака на правой боковой позиции. Поддержание общей анестезии с 3,2% севофлюран с кислородом (1,0 Л/мин).
  4. Используйте грелку для поддержания температуры тела при 37 ° C.
  5. Применить глазной гель на передней поверхности глаза, чтобы избежать роговицы ссадины.
  6. Тщательно бритья операционного поля (области груди слева) с помощью хирургического. Клипперс. Спрей значительное количество спиртовый раствор над постановляющей части сайта. Подождите по крайней мере 15 секунд повторить процедуру 3 раза.
  7. Запишите пульс и насыщение кислородом во время операции.

4. нижнего альвеолярного нерва реконструкции с помощью PGA-C трубки: Разработка модели только для реконструкции

  1. Придать 3 мл 1% лидокаина, с помощью иглы 27 G к левой нижней челюсти десны как местной анестезии и обезболивающее.
  2. Выполните 5-см поперечный разрез с лезвием скальпеля число 15 в левой нижней челюсти десны, подвергать мандибулы животного.
  3. Используйте пьезоэлектрических ультразвуковых колебаний для перемалывания проксимальных аспект нижней челюсти в прямоугольник 8-мм 3-cm × через задний психического отверстия.
    Примечание: Частота вибрации был 28 \u2012 32 кГц.
  4. Удаление лобной частью нижнечелюстной кости пластиной (размеры, 3 см × 8 мм), чтобы разоблачить левой Ян (рисунок 2A)18.
    Примечание: Реконструкция сайта соответствует корневой вершины первого моляра
  5. Разрез Ян с помощью скальпеля удалить сегмент 10-мм.
  6. Вставьте проксимальном и дистальном пни разорвала нерва нерва трубку на глубину до 2 мм.
  7. Использовать 8-0 нейлон швы и хирургический Микроскоп на 8 крат для шовные трубы на проксимальном и дистальном нерв кончается (рис. 2B)18.
  8. Возвращение костей пластиной в исходный сайт в нижней челюсти.
  9. Закройте рану швы нейлон 4-0.
  10. Один день после операции, убедитесь, что плита нижнечелюстной кости находится в правильном положении.
    1. 4.10.1 выполняют томография компьютерная томография (КТ) лицевой кости под наркозом. Задайте параметры CT следующим: 120 kVp, 200 МАС, 0.5 мм/сек, толщина среза 0,5 мм.
      1. Администрировать анестезии, используя смесь 5 мг/кг кетамин Ксилазина гидрохлорид и 1 мг/кг (рис. 3).
  11. Управлять ампициллин (100 мг/день) как антибиотик и ацетаминофен (100 мг/день) в качестве обезболивающего за неделю после операции.

5. этанол индуцированной CSGB: развитие реконструкции + CSGB модель

  1. Выполнение реконструкции Ян, как описано в разделе 4 и позволяют в неделю для восстановления.
  2. Анестезировать животное с севофлюран 1,5% кислорода (4 Л/мин) и воздух (6 Л/мин). Бритья и очистки предполагаемой операционного поля, как описано в разделе 3.
  3. Марк линии разреза с маркером хирургической кожи путем рисования линии на левой груди области (рис. 4, линии разреза — 20 см в длину).
  4. Придать 5 мл 1% лидокаина, используя иглой 21 G к левой стороне груди области как местного анестетика и болеутоляющее.
  5. Надрезать кожу груди левой стороне с лезвием скальпеля число 10.
  6. Надрезать толстый слой с электрическим скальпель подвергать мышечной фасции.
  7. Разоблачить зубчатой брюшной мышцы и мышцы scalenus.
  8. Поднимите зубчатой брюшной мышцы и мышцы scalenus от вентральный спинной подвергать второго и третьего ребра (рис. 5).
  9. Выполнение левого бокового торакотомия на втором и третьем межреберных пространства подвергать левой шейки матки симпатичная(ый) ганглии (рис. 6).
  10. Inject 0,2 мл 99,5% этанола в шейного ганглия симпатичная(ый), иглой 30 G под прямой визуализации (рис. 7).
  11. Закройте межреберное пространство с Прерванный 1-0 рассасывающиеся швы.
  12. Закройте кожи с нейлон швы прерванный 3-0.
  13. Управлять ампициллин (100 мг/день) как антибиотик и ацетаминофен (100 мг/день) в качестве обезболивающего за неделю после операции.
  14. На 1 неделю после CSGB измерения температуры кожи лица с инфракрасной термографии для подтверждения CSGB.

6. Электрофизиологические записи

  1. Чтобы измерить чувствительных нервных действий потенциал (SNAP) и скорость проводимости чувствительных нервных (SCV) Ян через три месяца после реконструкции, анестезировать животных, как описано в разделе 3.
    Примечание: Оснастки и КСМ должны измеряться на обеих сторонах экспериментальных и нормального управления для каждой собаки в обеих группах.
  2. Сделать надрез в левой нижней челюсти десны с лезвием скальпеля число 10.
  3. Осторожно удалите пластину нижнечелюстной кости, чтобы избежать повреждения физической регенерирующих нервных.
  4. Стимулировать Ян, с помощью пары электродов иглы, чтобы записать оснастки и КСМ.
    1. Вставьте электродов проксимально нерва каналом.
    2. Примените электрические стимул 10 кГц 20 раз.
  5. Проанализируйте результаты.
    1. Определите привязки путем вычисления амплитуды среднее время ответа для электрической стимуляции.
    2. Измерьте задержку пик и пиковой амплитудой от записи диаграммы.
    3. Рассчитать восстановления индекса с помощью следующего уравнения: пик амплитуда левой Ян только для восстановления или реконструкции + CSGB group / пик амплитуды нормального управления (Центральный сегмент правой Ян в группе только для реконструкции)19 ,20.

7. гистологический анализ

  1. В разделе Подготовка
    1. Через три месяца после реконструкции, урожай левой Ян, включая 1 см нерва с обеих сторон, реконструированной сайта.
    2. Урожай право Ян на уровне, соответствующем сайте урожай на левой стороне.
    3. Префикс заготовленной нервы методом погружения в низкотемпературном растворе глютаральдегида 2,5% в 0,1 М растворе cacodylate буфера (рН 7,4, 48 ° C, 24 ч).
    4. Постфиксная с 2% раствор осмия тетраоксид (48 ° C, 4 ч) и Ферроцианид калия в 0,1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,4, ч. 2).
    5. Обезвоживает нервы с серией градуированных этанола решения.
    6. Внедрите в эпоксидной смолы (парафина).
    7. Раздел образцов на толщину 0,5 мкм \u2012 1.0.
  2. Толуидиновый синий окрашивание и морфологический анализ
    1. Пятно секции раствором толуидиновый синий.
    2. Получение микроскопии изображений с помощью оптического микроскопа, при 400-кратном в следующих регионах вдоль образцы: слева Ян, центр регенерированный сегмента и 2 мм дистально в ПНЕ; правый Ян, центр сегмента Ян, соответствующий сайт урожай на левой стороне.
    3. Выберите изображения всех регионов с регенерации нервных волокон.
      1. Случайным образом выбрать 8 районов \u2012 10 мкм 100 × 100 мкм содержащих регенерации нервных волокон.
      2. Морфологический анализ с использованием соответствующего программного обеспечения для измерения следующих параметров: диаметр Миелинизированные нервные волокна (мкм) и плотности (количество/район), нервные ткани процент и G-коэффициент (Миелинизированные аксона диаметр/Миелинизированные нервные волокна диаметром ).
  3. Иммуноокрашивания
    1. Выполните стандартные протоколы для окрашивания раздел парафина.
    2. Проинкубируйте с первичного антитела для 30 мин при температуре 25 ° C.
    3. Промойте фосфат амортизированное saline 3 раза при 25 ° C.
    4. Проинкубируйте с вторичные антитела, помечены пероксидаза 30 мин при температуре 25 ° C.
    5. Получение изображения с помощью световой микроскоп.
  4. Просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА)
    1. Подготовьте нервы, как описано в пункте 7.1.
    2. Нервы в разделе толщина 70 \u2012 90 мкм с помощью ultramicrotome.
    3. Пятно секции с Рейнольдса цитрат свинца и уранила.
    4. Изучение и изображения, просвечивающей электронной микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы наблюдали увеличение температуры кожи лица стороны заблокирован 1 неделю после левой CSGB (рис. 8).

На 3 месяца после реконструкции PGA-C трубки в области реконструкции была поглощена и регенерации нижнеальвеолярного нерва наблюдалось в только для восстановления и реконструкции + CSGB групп (Рисунок 9а, Б)18.

SNAP был измеримых в обе реконструкции реконструкции + CSGB и реконструкции только для групп. Результаты электрофизиологического оценки кратко излагаются в таблице 118. Восстановления индекса и КСМ были значительно выше в реконструкции + CSGB, чем в группе только для восстановления.

Мы наблюдали Миелинизированные нервные волокна на Центральной и дистальные сегменты регенерированный Ян в только для восстановления и реконструкции + CSGB групп (Рисунок 10А, B)18. Только для восстановления и реконструкции + CSGB групп показали меньше регенерировать Миелинизированные нервные диаметры по сравнению с обычной контрольной группы (Центральный сегмент правой Ян в группе реконструкции, рис. 10 c). Были также отмечены незрелых Миелинизированные нервные волокна.

Рассмотрение только для реконструкции, реконструкции + CSGB групп с использованием ТЕА показал регенерированный Миелинизированные нервные волокна и Шванновские клетки (рис. 10D, Е). 10F рисунке эти результаты ТЕА для обычной контрольной группы (Центральный сегмент правой Ян в группе реконструкции).

Присутствие регенерированный аксонов и Шванновские клетки был подтвержден на уровне центральных и дистальные сегменты только для восстановления и реконструкции + CSGB группы, путем пятнать с анти neurofilament (NF) и антитела анти С100, соответственно (рис. 11 )18.

Морфологической оценки результаты кратко излагаются в таблице 218. Диаметр Миелинизированные нервные волокна в центре регенерированный сегмента левой Ян был 4.27 ± 1,5 мкм в группе реконструкции и 5.11 ± 1,98 мкм в группе CSGB, в то время как в дистальный сегмент регенерированный левой Ян диаметр был 3.47 ± 1.21 мкм в реконструкция ции группы и 4.53 ± 1,36 мкм в группе CSGB. В обоих случаях диаметр был значительно больше в группе CSGB, которая также продемонстрировала значительно более высокий процент ткани плотностью и нерва Миелинизированные нервные волокна в центре и дистальный сегмент регенерированный левой Ян. G-коэффициент в центре регенерированный левой Ян был 0,75 ± 0,04 в группе реконструкции и 0.68 ± 0,05 в группе CSGB, в то время как в дистальной части было 0.74 ± 0,04 в группе реконструкции и 0,69 ± 0,04 в группе CSGB. Таким образом в обоих случаях, G-соотношение было значительно меньше в группе CSGB.

Образец размеры для только для восстановления и реконструкции + CSGB группы были n = 7. Статистический анализ для Миелинизированные нервные волокна диаметром и плотность, G-коэффициент и КСМ были проведены с использованием Дуннетт в тест. Был проведен анализ восстановления индекса с использованием качестве непарный студента t-теста. На 5% (p < 0,05) был установлен уровень статистической значимости.

Figure 1
Рисунок 1: Полигликолидная кислота трубки заполнены с коллагеновая губка. A) валового изображение трубки. Окончательные размеры нерва каналом были длиной 14 мм, внутренний диаметр 3 мм и толщина стенки 50 мкм. B) сканирование электронная микрофотография трубки. Эта цифра была ранее опубликована в Shionoya и др. 18 и перепечатана с разрешения автора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: слева нижнеальвеолярного нерва (Ян) до и после реконструкции. A) до реконструкции изображения левой Ян после разоблачения путем удаления кости. B) после реконструкции изображения левой Ян реконструирован, с помощью трубки Полигликолидная кислота коллаген. Эта цифра была ранее опубликована в Shionoya и др. 18 и перепечатана с разрешения автора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Компьютерная томография томография костей лица после реконструкции нижнеальвеолярного нерва. Изображение показывает, что пластина нижнечелюстной кости находится в правильном положении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: предоперационное кожи отметины на левой грудной области до хирургии. Фотография, показаны маркировка кожи перед выполнением блока симпатичная(ый) шейного ганглия. Линии разреза — 20 см в длину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: действующие вид блока шейного ганглия симпатичная(ый): до торакотомии. Изображение показывает второго и третьего ребра после подъема зубчатой брюшной и scalenus мышц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: действующие вид блока шейного ганглия симпатичная(ый): после торакотомии. Изображение показывает левой шейного ганглия симпатичная(ый) после боковой торакотомия на втором и третьем межреберных пространства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: симпатичная(ый) шейного ганглия до и после этанола инъекций иглой 30 G. A) До этанола инъекции изображение левой шейки матки симпатичная(ый) ганглия. B) этанола после инъекции изображение левой шейки матки симпатичная(ый) ганглия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: термограммы после левой шейного ганглия симпатичная(ый) блока (CSGB). Термограммы была приобретена через одну неделю после CSGB введения этанола. Обратите внимание, что температура кожи лица на левой стороне является выше, чем на контралатеральную сторону. Панель цвета указывает температуры в ° C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9: регенерировать нижнеальвеолярного нерва (IAN). ) Изображение Ян в группе только для восстановления. B) изображение Ян в реконструкции + группа CSGB (шейного ганглия симпатичная(ый) блок). Регенерацию нерва (регион между белые стрелки) наблюдается в обеих группах. Эта цифра была ранее опубликована в Shionoya и др. 18 и перепечатана с разрешения автора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 10
Рисунок 10: толуидиновый синий и передачи электронной микроскопии анализ регенерированный нижнеальвеолярного нерва (IAN). - C) полутонкая поперечной разделы Ян в 3 месяца после реконструкции витражи с толуидиновый синий. Изображения показывают дистальные сегменты регенерированный левой Ян в каждой группе, как указано. D - F) передачи электронной микроскопии изображений от полутонкая секции показаны циклопоид и не Миелинизированные нервные волокна (черные и белые стрелки, соответственно). Масштаб бары представляют 50 мкм в (A) - (C) и 5 мкм (D) - (F). Обычный элемент управления: Центральный сегмент правой Ян в группе только для восстановления. Эта цифра была ранее опубликована в Shionoya и др. 18 и перепечатана с разрешения автора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 11
Рисунок 11: Иммуногистохимический анализ дистальной сегментов регенерированный левого нижнего альвеолярного нерва (IAN). A, B) разделы регенерированный Ян в 3 месяца после реконструкции витражи с антитело против neurofilament (NF) группа (A) только для восстановления и реконструкции + шейного ганглия симпатичная(ый) блок (CSGB; B) групп. Черные стрелки указывают регенерированный аксоны. C, D) разделы регенерированный Ян в 3 месяца после реконструкции витражи с антитела анти S-100 для группы (C) только для восстановления и реконструкции + CSGB (D) группы. Белые стрелки указывают Шванновские клетки. Масштаб бары, 50 мкм. Эта цифра была ранее опубликована в Shionoya и др. 18 и перепечатана с разрешения автора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Сенсорные нервной проводимости (m/s) Восстановления индекс
Обычный элемент управления 48,5 ± 2,8 -
Реконструкция только группы 36,8 ± 2.9* 0.22 ± 0,04
Реконструкция + CSGB группы 42,0 ± 2.4*# 0,35 ± 0,06#

Таблица 1: электрофизиологических выводы в на 3 месяца после операции нижнеальвеолярного нерва (IAN). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 7). Сравнения были сделаны с помощью качестве непарный студента t-теста. Ян, нижнего альвеолярного нерва; CSGB, симпатичная(ый) шейного ганглия блока. *, p < 0,05 по сравнению с обычной контрольной группы; #, p < 0,05 по сравнению с группой только для восстановления. Обычный элемент управления: Центральный сегмент правой Ян в группе только для реконструкции; Восстановления индекс: отношение амплитуды пик левой Ян только для реконструкции или восстановления + CSGB группы пик амплитуды нормального управления. Эта таблица была ранее опубликована в Shionoya и др. 18 и перепечатана с разрешения автора.

Диаметр Миелинизированные нервные волокна (мкм) Миелинизированные нервные волокна плотности (Фото/100 мкм2) Доля нервной ткани (%) G-коэффициент
Обычный элемент управления Центр 8.83 ± 3.11 103 ± 8 41.3 ± 3,9 0,62 ± 0,03
Реконструкция только группы Центр 4.27 ± 1.5* 126 ± 20 * 11,6 ± 2.1* 0.04* 0,75 ±
Дистальная 3.47 ± 1.21* 109 ± 17 * 7,3 ± 2.0* 0.74 ± 0.04*
Реконструкция + CSGB группы Центр 5.11 ± 1.98*# 140 ± 22 *# 15,9 ± 3.0*# 0.68 ± 0.05*#
Дистальная 4.53 ± 1.36*$ 123 ± 15 *$ 12,5 ± 2.1*$ 0,69 ± 0.04*$

Таблица 2: морфологические выводы на 3 месяца после операции в нижнеальвеолярного нерва (IAN). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 7). Сравнения были сделаны с помощью Дуннетт в тест. Ян, нижнего альвеолярного нерва; CSGB, симпатичная(ый) шейного ганглия блока. *, p < 0,05 по сравнению с обычной контрольной группы; * #, p < 0,05 по сравнению с центрального сегмента левой Ян в группе только для реконструкции; * $,p < 0,05 по сравнению с дистального конца левой Ян в группе только для восстановления. Обычный элемент управления: Центральный сегмент правой Ян в группе только для реконструкции; G коэффициент представляет собой отношение Миелинизированные аксона диаметром до всего Миелинизированные волокна. Эта таблица была ранее опубликована в Shionoya и др. 18 и перепечатана с разрешения автора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы представляем эффективный метод для регенерации Ян с помощью трубки bioabsorbable нерва в сочетании с этанолом индуцированной CSGB. Для этого исследования мы использовали собак, поскольку другие животные модели, как мышей, крыс и кроликов, короткой продолжительности жизни и размер малого тела и поэтому не может использоваться для выполнения точных хирургических процедур. Как Ян находится в нижнечелюстной канал, окруженный кости, хирургическая техника необходимо, чтобы избежать повреждения нервов и кровеносных сосудов при выполнении реконструкции нерва. Важные технические подсказка для процедуры является тщательно удалить пластину нижнечелюстной кости для того, чтобы свести к минимуму риск повреждения нерва и судна. Традиционные боры и микро пилы не могут различать между21жестких и мягких тканей. Кроме того эти инструменты, как правило, скольжения, вызывая повреждение прилегающих тканей, особенно Ян, путем случайного контакта22. Поэтому мы использовали пьезоэлектрический хирургические инструменты для кости шагов обработки. Это новые и инновационные костной хирургии техника, которая использует ультразвуковые микроколебания специализированных скальпели. Таким образом даже при случайном контакте с23,советы резки24не повреждены мягких тканей. Микроколебания 60-200 мкм/s 24-29 кГц являются оптимальными для резки упругой ткани минерализованных а избавления упругих мягких тканей; Это не возможно на частотах выше2550 кГц. Кроме того вращательные боры или осциллирующих пилы требуют силы для противодействия вращения или вибрации инструмента. По сравнению с этими документами, пьезоэлектрический хирургические инструменты не требуется применение дополнительных сил и так безопасной и точной обработки кости возможно26. Это особенно важно в руках Роман пользователя.

Другим важным аспектом нашего метода, что кости пластиной не была исправлена с помощью металлических пластин, но был помещен в его первоначальное положение в нижней челюсти после размещения PGA-C трубки. Причина этого заключалась в том, чтобы избежать риска подверженности пластины устные слизистой некроза, которая возникает при использовании металлических пластин для крепления. Однако в некоторых случаях пластину кости отходит от исходного сайта. Таким образом крайне важно для выполнения КТ костей лица для подтверждения, что пластина нижнечелюстной кости находится в правильном положении после операции. При использовании металлические плита для фиксации, плотных швов следует избегать как это может вызвать устные слизистой некроз благодаря кровообращения.

CSGB является эффективное лечение для заболевания периферических сосудов и болевых синдромов14,1513,лица и шеи. Однако механизмы, лежащие в основе его терапевтические эффекты остаются неясными. Одной из причин отсутствия исследований терапевтического эффекта CSGB является трудность получения последовательных и единообразных симпатолитики эффект. Например распространение симпатическая блокада после чрескожной CSGB не является единообразной27,28. Mullenheim и др. 29 имплантированных собак с полиэтиленовый катетер, после торакотомии, под фасции и вместе с верхней симпатической цепочки и выполняется CSGB путем инъекций лидокаина через катетер. Хотя этот подход может распространяться симпатическая блокада в целевых районах, она несет риски окклюзии катетера или вывих, а также инфекции, особенно в ходе долгосрочных экспериментов. В наших собак модели CSGB прямым впрыском 99,5% этанола производится долгосрочного увеличения притока крови к ипсилатеральной орофациалъная региона. В нашем подходе блок инъекций вводили под прямым визуализация, так CSGB может быть выполнена с точностью. Таким образом наш подход уменьшает риск неравномерного распространения симпатолитики эффекта и симпатическая блокада. Это считается выгодным, особенно в ходе долгосрочных экспериментов. Кроме того мы использовали термографии для подтверждения успеха CSGB, так как повышение температуры кожи лица на стороне блока после успешного CSGB. В этом случае термография является полезным, потому что это простой и неинвазивной. Главное не температуры кожи лица и носа следует измерять, так как он не зависит от собаки волосы. Наша модель может способствовать дальнейшие исследования терапевтического эффекта CSGB. В нашем предыдущем исследовании кровотока в зоне орофациалъная увеличилась для 6-11 недель после шейки матки симпатичная(ый) ganglionectomy. Исследователи могут выбрать этот альтернативный метод30 , при желании.

Ограничение этого исследования является, что этанол индуцированной CSGB создает риск развития постоянного Хорнер Синдром (Птоз и миоз)31. Другие методы, включая радиочастотной аблации, фенола и симпатичная(ый) ganglionectomy были использованы для выполнения sympathectomies; Однако специально для симпатэктомия шейного ганглия симпатичная(ый), только радиочастотная абляция был нанят в клинической практике32,33,34,35. Таким образом радиочастотная абляция и местные анестетики можно рассматривать как альтернативный метод для этанола индуцированной CSGB. Будущие исследования необходимо проверить, как регенерации нервных опосредовано bioabsorbable нервной трубки может быть повышена путем CSGB с местной анестезии или радиочастотной аблации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Департаментом Биоискусственная органов в Киото университета институт пограничных медицинской науки. Мы хотели бы поблагодарить сотрудников ветеринарного института пограничной медицинской науки.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NMP Collagen PS Nippon Meatpackers 301-84621 Atelocollagen extracted from young porcine skin by enzyme treatment
Surgical clippers Roboz Surgical Instrument Company RC-5903
Disposable scalpel (No.15) Kai medical 219ABBZX00073000
VarioSurg3 Nakanishi VS3-LED-HPSC, E1133 Piezoelectric surgery for bone processing
4-0 nylon sutures Ethicon 8881H
8-0 nylon sutures Ethicon 2775G
Isepamicin sulfate Nichi-Iko 620005641
Disposable scalpel (No.10) Kai medical 219ABBZX00073000
30-gauge needle Nipro 1134
1-0 absorbable stitches Ethicon J347H
3-0 Nylon stitches Ethicon 8872H
Neo Thermo NEC Avio TVS-700 Infrared thermography 
Neuropack Σ NIHON KOHDEN MEB-5504 Orthodromic recorder for electrophysiological recording
Toluidine Blue Sigma-Aldrich T3260-5G
Light microscope Keyence BZ-9000
Mouse anti-human neurofilament protein monoclonal antibody DAKO N1591
Polyclonal rabbit anti-S100 antibody DAKO Z0311
Transmission electron microscopy Hitachi High Technologies Hitachi H-7000
Dynamic cell count Keyence BZ-H1C Software for morphological evaluation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Sabbagh, M., Okeson, J. P., Bertoli, E., Medynski, D. C., Khalaf, M. W. Persistent pain and neurosensory disturbance after dental implant surgery: prevention and treatment. Dental Clinics of North America. 59 (1), 143-156 (2015).
  2. Chaushu, G., Taicher, S., Halamish-Shani, T., Givol, N. Medicolegal aspects of altered sensation following implant placement in the mandible. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 17 (3), 413-415 (2002).
  3. Robinson, P. P., Loescher, A. R., Yates, J. M., Smith, K. G. Current management of damage to the inferior alveolar and lingual nerves as a result of removal of third molars. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 42 (4), 285-292 (2004).
  4. Gregg, J. M. Studies of traumatic neuralgia in the maxillofacial region: symptom complexes and response to microsurgery. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 48 (2), 135-140 (1990).
  5. Pogre, M. A. The results of microneurosurgery of the inferior alveolar and lingual nerve. Journal of Oral and Maxillofacial Sureryg. 60 (5), 485-489 (2002).
  6. Strauss, E. R., Ziccardi, V. B., Janal, M. N. Outcome assessment of inferior alveolar nerve microsurgery: a retrospective review. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 64 (12), 1767-1770 (2006).
  7. Nakamura, T., et al. Experimental study on the regeneration of peripheral nerve gaps through a polyglycolic acid-collagen (PGA-collagen) tube. Brain Research. 1027 (1-2), 18-29 (2004).
  8. Yoshitani, M., et al. Experimental repair of phrenic nerve using a polyglycolic acid and collagen tube. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 133 (3), 726-732 (2007).
  9. Seo, K., et al. One-year outcome of damaged lingual nerve repair using a PGA-collagen tube: a case report. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 66 (7), 1481-1484 (2008).
  10. Seo, K., et al. Protracted delay in taste sensation recovery after surgical lingual nerve repair: a case report. Journal of Medical Case Reports. 7, 77 (2013).
  11. Seo, K., Terumitsu, M., Inada, Y., Nakamura, T., Shigeno, K., Tanaka, Y. Prognosis after surgical treatment of trigeminal neuropathy with a PGA-c tube: report of 10 Cases. Pain Medicine. 17 (12), 2360-2368 (2016).
  12. Okuda, Y., Kitajima, T. Comparison of stellate ganglion block with intravascular infusion of prostaglandin e1 on brachial artery blood flow in dogs. Anesthesia and Analgesia. 84 (6), 1329-1332 (1997).
  13. Kohjitani, A., Miyawaki, T., Kasuya, K., Shimada, M. Sympathetic activity-mediated neuropathic facial pain following simple tooth extraction: a case report. Cranio. 20 (2), 135-138 (2002).
  14. Melis, M., Zawawi, K., al-Badawi, E., Lobo Lobo, S., Mehta, N. Complex regional pain syndrome in the head and neck: a review of the literature. Journal of Orofacial Pain. 16 (2), 93-104 (2002).
  15. Salvaggio, I., Adducci, E., Dell'Aquila, L., Rinaldi, S., Marini, M., Zappia, L., Mascaro, A. Facial pain: a possible therapy with stellate ganglion block. Pain Medicine. 9 (7), 958-962 (2008).
  16. Atsumi, M., Sunada, K. The effect of superior cervical ganglion resection on peripheral facial palsy in rats. Journal of Anesthesia. 30 (4), 677-683 (2016).
  17. Hanamatsu, N., Yamashiro, M., Sumitomo, M., Furuya, H. Effectiveness of cervical sympathetic ganglia block on regeneration of the trigeminal nerve following transection in rats. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 27 (3), 268-276 (2002).
  18. Shionoya, Y., Sunada, K., Shigeno, K., Nakada, A., Honda, M., Nakamuram, T. Can nerve regeneration on an artificial nerve conduit be enhanced by ethanol-induced cervical sympathetic ganglion block? PLoS One. 12 (12), e0189297 (2017).
  19. Suzuki, Y., Tanihara, M., Ohnishi, K., Suzuki, K., Endo, K., Nishimura, Y. Cat peripheral nerve regeneration across 50 mm gap repaired with a novel nerve guide composed of freeze-dried alginate gel. Neuroscience Letters. 259 (2), 75-78 (1999).
  20. Ichihara, S., et al. Development of new nerve guide tube for repair of long nerve defects. Tissue Engineering, Part C, Methods. 15 (3), 387-402 (2009).
  21. Grenga, V., Bovi, M. Piezoelectric surgery for exposure of palatally impacted canines. Journal of Clinical Orthodontics. 38, 446-448 (2004).
  22. Degerliyurt, K., Akar, V., Denizci, S., Yucel, E. Bone lid technique with piezosurgery to preserve inferior alveolar nerve. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 108 (6), e1-e5 (2009).
  23. Kotrikova, B., et al. Piezosurgery--a new safe technique in cranial osteoplasty? International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 35 (5), 461-465 (2006).
  24. Vercellotti, T. Piezoelectric surgery in implantology: a case report-a new piezoelectric ridge expansion technique. International Journal of Periodontics and Restorative Dentistry. 20 (4), 358-365 (2000).
  25. Stübinger, S., Kuttenberger, J., Filippi, A., Sader, R., Zeilhofer, H. F. Intraoral piezosurgery: Preliminary results of a new technique. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 63 (9), 1283-1287 (2005).
  26. Eggers, G., Klein, J., Blank, J., Hassfeld, S. Piezosurgery: an ultrasound device for cutting bone and its use and limitations in maxillofacial surgery. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 42 (5), 451-453 (2004).
  27. Hardy, P. A., Wells, J. C. Extent of sympathetic blockade after stellate ganglion block with bupivacaine. Pain. 36 (2), 193-196 (1989).
  28. Hogan, Q. H., Erickson, S. J., Haddox, J. D., Abram, S. E. The spread of solutions during stellate ganglion block. Regional Anesthesia. 17 (2), 78-83 (1992).
  29. Mullenheim, J., et al. Left stellate ganglion block has only small effects on left ventricular function in awake dogs before and after induction of heart failure. Anesthesia and Analgesia. 91 (4), 787-792 (2000).
  30. Tsujimoto, G., Sunada, K., Nakamura, T. Effect of cervical sympathetic ganglionectomy on facial nerve reconstruction using polyglycolic acid-collagen tubes. Brain Research. 1669, 79-88 (2017).
  31. Ghai, A., Kaushik, T., Kumar, R., Wadhera, S. Chemical ablation of stellate ganglion for head and neck cancer pain. Acta Anaesthesiologica Belgica. 67 (1), 6-8 (2016).
  32. Forouzanfar, T., van Kleef, M., Weber, W. E. Radiofrequency lesions of the stellate ganglion in chronic pain syndromes: retrospective analysis of clinical efficacy in 86 patients. Clinical Journal of Pain. 16 (2), 164-168 (2000).
  33. Ohno, K., Oshita, S. Transdiscal lumbar sympathetic block: a new technique for a chemical sympathectomy. Anesthesia and Analgesia. 85 (6), 1312-1316 (1997).
  34. Slappendel, R., Thijssen, H. O., Crul, B. J., Merx, J. L. The stellate ganglion in magnetic resonance imaging: a quantification of the anatomic variability. Anesthesiology. 83 (2), 424-426 (1995).
  35. Wang, Y. C., Wei, S. H., Sun, M. H., Lin, C. W. A new mode of percutaneous upper thoracic phenol sympathicolysis: report of 50 cases. Neurosurgery. 49 (3), 628-634 (2001).

Tags

Нейробиологии выпуск 141 неврологии в situ тканевая инженерия искусственных нерва каналом Полигликолидная кислота Коллаген труб шейного ганглия симпатичная(ый) блок собак модель
Этанол индуцированной шейного ганглия симпатичная(ый) блок приложений для содействия регенерации собак нижнеальвеолярного нерва с помощью искусственных нерва
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shionoya, Y., Sunada, K., Tsujimoto, … More

Shionoya, Y., Sunada, K., Tsujimoto, G., Shigeno, K., Nakamura, T. Ethanol-Induced Cervical Sympathetic Ganglion Block Applications for Promoting Canine Inferior Alveolar Nerve Regeneration Using an Artificial Nerve. J. Vis. Exp. (141), e58039, doi:10.3791/58039 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter