Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ethanol-geïnduceerde cervicale sympathiek Ganglion blok toepassingen voor het bevorderen van Canine inferieur alveolaire zenuw regeneratie met behulp van een kunstmatige zenuw

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58039
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3
1Department of Dental Anesthesia, Nippon Dental University Hospital at Tokyo, 2Department of Dental Anesthesiology, Nippon Dental University School of Life Dentistry at Tokyo, 3Department of Bioartificial Organs, Institute for Frontier Medical Science, Kyoto University

Summary

We het effect van cervicale sympathiek ganglion blok op reparatie van de zenuw met behulp van kunstmatige zenuw conduits geëvalueerd. Mannelijke beagle honden werden elk geïmplanteerd met een kunstmatige zenuw over een 10-mm gat in de linker inferieur alveolaire zenuw; linker cervicale sympathiek ganglion werd geblokkeerd door het injecteren van 99,5% ethanol via laterale Thoracotomie.

Abstract

Polyglycolic zuur collageen (PGA-C) buizen zijn bio-absorbeerbare zenuw buizen gevuld met collageen van multi kamer structuur, die bestaan uit dunne collageen films. Gunstige klinische resultaten zijn bereikt bij het gebruik van deze buizen voor de behandeling van beschadigde inferieur alveolaire zenuw (IAN). Een kritieke factor voor de succesvolle zenuw regeneratie met behulp van PGA-C-buizen is bloedtoevoer naar het omringende weefsel. Cervicale sympathiek ganglion blok (CSGB) maakt een sympathieke blokkade in de regio van het hoofd en de hals waardoor bloed stroomt in het gebied. Om te zorgen voor een voldoende effect, moet de blokkade worden beheerd met lokale anesthetica één tot twee keer per dag gedurende verschillende opeenvolgende weken; Dit vormt een uitdaging bij het maken van dierlijke modellen voor het onderzoeken van deze techniek. Om deze beperking, ontwikkelden we een ethanol-geïnduceerde CSGB in een hoektand model van lange termijn toename van de doorbloeding in het orofaciale gebied. Wij onderzocht of IAN regeneratie via PGA-C buis implantatie kan worden verbeterd door dit model. Veertien Beagles waren elk geïmplanteerd met een PGA-C buis over een 10-mm gat in de linker IAN. De IAN ligt binnen de mandibulaire gracht omgeven door bot, dus we kozen piëzo-elektrische chirurgie, bestaande uit ultrasone golven, voor bot verwerking, om te minimaliseren van het risico van verwonding van de zenuw en schip. Een goed resultaat van de chirurgie werd verkregen met deze aanpak. Een week na de operatie, werden zeven van deze honden onderworpen aan linker CSGB door injectie van ethanol. Ethanol-geïnduceerde CSGB geresulteerd in verbeterde zenuw regeneratie, wat suggereert dat de verhoogde bloedtoevoer effectief zenuw regeneratie in IAN gebreken bevordert. Deze honden model kan bijdragen aan verdere onderzoek naar de langetermijneffecten van CSGB.

Introduction

In veel gevallen is traumatisch letsel van de inferieure alveolaire zenuw (IAN) iatrogene, wordt vaak veroorzaakt door de winning van de derde Kies of de plaatsing van implantaten1,2,3. Letsel van de IAN kan leiden tot tekorten in thermische en touch sensaties evenals paresthesie, dysaesthesia, hypoesthesia en allodynia. Zenuw verwonding wordt behandeld, niet alleen door conservatieve therapie, maar ook door andere methoden, met inbegrip van wordt en de plaatsing van de autograft. Deze methoden hebben echter nadelen, waaronder vaak het gebrek aan verbetering van het symptoom en neurologische gebreken aan de donor site4,5,6.

De kunstmatige zenuw — polyglycolic zuur-collageen (PGA-C) buis werd oorspronkelijk ontwikkeld in Japan. Het is een bio-absorbeerbare buis met zijn innerlijke lumen gevuld met een spongiforme collageen7. In dierproeven, deze buis werd gebruikt voor het verbeteren van de zenuw regeneratie bij beagle honden met peroneale zenuw defect, en ter bevordering van de hogere mate van herstel dan zenuw autologe transplantatie8werd getoond. De klinische toepassing van de PGA-C buis begon in 2002 bij patiënten met perifere zenuw letsel. Bovendien zijn gunstige klinische resultaten bereikt bij de behandeling van trigeminal neuropathie (IAN en meertalige zenuw)9,10,11. Een kritieke factor voor succesvolle zenuw regeneratie met behulp van PGA-C-buizen is bloedtoevoer naar het omliggende weefsel8. Cervicale sympathiek ganglion blok (CSGB) wordt gemaakt van een sympathiek blokkade in het hoofd en de nek regio en verhoogt de bloedtoevoer naar de respectieve bezenuwde gebied12; Dus, het is gebruikt bij de behandeling van complex regionaal pijnsyndroom en bloedsomloop insufficiëntie13,14,15. Nochtans, zijn er slechts enkele experimentele onderzoek naar de werkzaamheid van CSGB in toenemende bloed stroom-16,17. Om te zorgen voor adequate CSGB-efficiëntie, moet de blokkade worden toegepast samen met lokale verdoving eenmaal of tweemaal dagelijks voor enkele weken, dus poseren een uitdaging bij het genereren van diermodellen om te onderzoeken van deze techniek. Om deze beperking, in een eerdere studie, ontwikkelden we een Honds model van langdurige verhoogde bloedtoevoer in de orofaciale regio18. Het model werd gegenereerd door het uitvoeren van een CSGB door het injecteren van 99,5% ethanol. We geëvalueerd de mondelinge mucosal bloedstroom en nasale huidtemperatuur door laser Doppler flowmetrie en infrarood thermografie eenmaal per week gedurende 12 weken. We vonden dat de doorbloeding van de orofaciale regio 7 – 10 weken in dit model werd verhoogd.

We geëvalueerd in de huidige studie, de effecten van ethanol-geïnduceerde CSGB op zenuw regeneratie.
De PGA-C buis werd ingeplant beagle honden over een 10-mm gat in de linker IAN. Een week later, werd CSGB uitgevoerd door het injecteren van ethanol. Drie maanden na de operatie, uitgevoerd we allerlei morfologische, elektrofysiologische en histologische studies om te evalueren van de effecten van CSGB op de zenuw regeneratie. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor IAN wederopbouw met een PGA-C buis en de ethanol-geïnduceerde CSGB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de leidende beginselen voor de zorg en het gebruik van dieren en goedgekeurd door het Comité voor dierlijke onderzoek van de Universiteit van Kyoto (Kyoto, Japan; autorisatienummer: R-16-16). Alle inspanningen werden geleverd om te minimaliseren van dierenleed, en alle onderdelen van dit verslag houden aan het aankomen (dier onderzoek: rapportage van in Vivo experimenten) richtlijnen.

1. fabricage van de PGA-C-buis

  1. Gebruiken om de kunstmatige zenuw-leiding door middel van een absorbeerbare polyglycolic zuur (PGA) buis, een buisvormige vlechten machine is uitgerust met 48 spindels en vijf PGA vezels, bestaat uit bundels van 26 filamenten (Figuur 1)18.
  2. Om het oppervlak van de buis PGA hydrofiele, worden blootgesteld aan plasma kwijting.
  3. 1% v/w atelocollagen in waterstofchloride oplossing7gebruiken.
    Opmerking: Atelocollagen is onttrokken varkens huid via enzym behandeling en onderworpen aan een viruscontrole. Het voornamelijk bestaat uit type I (70-80%) en type III collageen, de verhouding die beschreven in detail elders wordt7. Bereid de collageen-oplossing door het oplossen van 1 g collageen in 100 mL hydrochloride oplossing (pH = 3.0). Aangezien de dichtheid van de oplossing van waterstofchloride ongeveer 1.0 is, is de concentratie van w/w collageen bijna 1%.
  4. Jas van de buis met de collageen lagen door het herhaaldelijk te dompelen in de 1% collageen hydrochloride oplossing voor 5 s telkens.
    1. Na het dompelen, droge de buis op een schone bankje bij kamertemperatuur. Voer volgende dompelen als u zeker bent van dat de buis is volledig droog (ongeveer 6 h voor droging).
    2. Herhaal het coatingproces 10 keer.
  5. Onderwerp van de PGA-C buis tot 140 ° C gedurende 24 uur onder vacuüm (dehydrothermal behandeling), om bio-absorptie en crosslinking van de collageen moleculen. Uitvoeren van het hele proces onder aseptische condities.
    Opmerking: Deze procedure genereert een buis van de uiteindelijke lengte 14-mm, 3 mm binnendiameter en 50-μm wanddikte.

2. de chirurgische ingreep Set-up

  1. Het gebruik van volwassen mannelijke beagles 9.0 naar 13,0 kg wegen.
    1. Huisdieren in aparte kooien, onder gecontroleerde kennel voorwaarden (12 uur licht en donker cyclus).
    2. Voorzien van vast voedsel en water ad libitum.
  2. Weeg de beagles.
  3. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten.
  4. Don gesteriliseerde handschoenen en desinfecteer alle oppervlakken van de operationele omgeving met een 80% ethanol-oplossing. Gooi de gebruikte handschoenen.
  5. Uitvoeren van chirurgische wassen van de handen.
  6. Zet op een vers masker, jurk, en steriele handschoenen.

3. narcose en voorbereiding van de huid

  1. Anesthetize de hond met een mengsel van 5 mg/kg ketamine hydrochloride en 1 mg/kg xylazine door een intramusculaire injectie.
  2. Intubate door een tracheale buis van 7,5 mm diameter en 25 cm lengte.
  3. Plaats de hond op de juiste zijligging. Handhaven van algemene anesthesie met 3,2% Sevofluraan met zuurstof (1,0 L/min).
  4. Gebruik van een verwarming pad te handhaven van de lichaamstemperatuur bij 37 ° C.
  5. Toepassing een oogheelkundige gel over het voorste oppervlak van de ogen aan het hoornvlies slijtage voorkomen.
  6. Zorgvuldig scheren het chirurgische gebied (linker borst gebied) met behulp van chirurgische tondeuse. Spray een aanzienlijke hoeveelheid alcoholische oplossing lopen over de operatieve site. Wacht ten minste 15 sec. Herhaal de toepassing 3 keer.
  7. Het opnemen van de hartslag en zuurstof saturatie tijdens de operatie.

4. inferieur alveolaire zenuw reconstructie met behulp van PGA-C tube: ontwikkeling van het Model alleen-wederopbouw

  1. 3 mL 1% lidocaïne met behulp van een 27 G naald aan de linker mandibulaire tandvlees als een plaatselijke verdoving en pijnstiller injecteren.
  2. Voer een dwarse insnijding van 5 cm met een mes scalpel nummer 15 in de linker mandibulaire tandvlees, bloot de kaken van het dier.
  3. Piëzo-elektrische ultrasone trillingen te vermalen het proximale aspect van de onderkaak in een 3 cm × 8-mm rechthoek door de achterste geestelijke foramen gebruiken
    Opmerking: De frequentie van de trilling was 28 \u2012 32 kHz.
  4. Het verwijderen van het frontgedeelte van de mandibulaire bot plaat (afmetingen, 3 cm × 8 mm) bloot de linker IAN (figuur 2A)18.
    Opmerking: De wederopbouw site correspondeert met de apex van de hoofdmap van de eerste kies
  5. Transect de IAN met een scalpel om het verwijderen van een segment van 10 mm.
  6. Plaats de proximale en distale stompen van de afgehakte zenuw in de zenuw buis tot een diepte van 2 mm.
  7. Gebruik van de 8-0 nylon hechtingen en een chirurgische Microscoop op 8 X vergroting tot suture van de buis aan de proximale en distale zenuw eindigt (figuur 2B)18.
  8. De bot plaat terug naar de oorspronkelijke site in de onderkaak.
  9. Sluit de wond met 4-0 nylon hechtingen.
  10. Een dag na de operatie, bevestigen dat de mandibulaire bot plaat in de juiste positie.
    1. 4.10.1 uitvoeren computertomografie (CT) beeldvorming van het gezicht bot onder verdoving. CT parameters als volgt instellen: 120 kVp 200 mAs, 0.5 mm/s, segment van 0.5 mm dikte.
      1. Beheren van anesthesie met behulp van een mengsel van 5 mg/kg ketamine hydrochloride en 1 mg/kg xylazine (Figuur 3).
  11. Ampicilline (100 mg/dag) als een antibioticum en paracetamol (100 mg/dag) als pijnstiller voor een week na de operatie beheren.

5. ethanol-geïnduceerde CSGB: ontwikkeling van de wederopbouw + CSGB Model

  1. IAN reconstructie uit te voeren zoals beschreven in sectie 4 en laat een week voor herstel.
  2. Anesthetize van het dier met 1,5% Sevofluraan in zuurstof (4 L/min) en lucht (6 L/min). Scheren en reinig het beoogde chirurgische veld, zoals beschreven in sectie 3.
  3. Markeer de regel van de incisie met een marker chirurgische huid door een streep op het linker borst gebied (Figuur 4, de lijn van de incisie is 20 cm in lengte).
  4. 5 mL 1% lidocaïne met behulp van een naald 21 G aan de linker kant borst gebied als een plaatselijke verdoving en pijnstiller injecteren.
  5. Incise de huid van de borst links met een mes van de scalpel nummer 10.
  6. Incise de vetlaag met een elektrische scalpel de spier fascia bloot te stellen.
  7. De musculus serratus ventralis spier en de musculus scalenus bloot.
  8. De musculus serratus ventralis spier- en scalenus spier van ventrale aan dorsale bloot van de tweede en derde ribben (Figuur 5) te verhogen.
  9. Het uitvoeren van een linker laterale Thoracotomie op de tweede en derde intercostaalruimte bloot de linker cervicale sympathiek ganglion (Figuur 6).
  10. 0,2 mL ethanol 99,5% injecteren in de cervicale sympathiek ganglion met behulp van een naald 30 G onder directe visualisatie (Figuur 7).
  11. Sluit de intercostale ruimte met onderbroken 1-0 absorbeerbare steken.
  12. Sluit de huid met onderbroken 3-0 nylon steken.
  13. Ampicilline (100 mg/dag) als een antibioticum en paracetamol (100 mg/dag) als pijnstiller voor een week na de operatie beheren.
  14. Op 1 week na CSGB, gezichtshuid temperatuur met infrarood thermografie te bevestigen van de CSGB te meten.

6. elektrofysiologische opnames

  1. Anesthetize voor het meten van sensorische zenuw actiepotentiaal (breuk) en sensorische zenuw geleiding snelheid (SCV) van de IAN drie maanden na de wederopbouw, dieren zoals beschreven in sectie 3.
    Let op: Module en SCV moeten worden gemeten aan de controle van experimentele en normale weerszijden voor elke hond in beide behandelgroepen.
  2. Maak een incisie in de linker mandibulaire tandvlees met een mes van de scalpel nummer 10.
  3. Verwijder voorzichtig de mandibulaire bot plaat om te voorkomen beschadiging van de geregenereerde zenuw fysiek.
  4. Stimuleren de IAN met behulp van een paar naald elektroden, om de module en de SCV te registreren.
    1. Plaats de elektroden proximally aan de leiding van de zenuw.
    2. Toepassing van 10-kHz elektrische prikkel 20 keer.
  5. Analyseer de resultaten.
    1. MODULE bepalen door het berekenen van de amplitude van de gemiddelde respons naar de elektrische stimulatie.
    2. Het meten van de piek latentie en de maximale amplitude van de opnamen van de grafiek.
    3. De index van het herstel met de volgende vergelijking berekenen: maximale amplitude van de linker IAN van de wederopbouw-only of wederopbouw + CSGB groep / piek amplitude van de normale controle (centraal segment van de juiste IAN in de alleen-wederopbouw groep)19 ,20.

7. histologische analyse

  1. Sectie voorbereiding
    1. Drie maanden na de wederopbouw, oogsten de linker IAN, met inbegrip van 1 cm van de zenuw aan weerszijden van de gereconstrueerde site.
    2. Oogst de juiste IAN op het niveau dat overeenkomt met het oogstgebied aan de linkerkant.
    3. Voorvoegsel de geoogste zenuwen door onderdompeling in 2,5% Glutaaraldehyde in een bufferoplossing van 0,1 M cacodylate (pH 7.4, 48 ° C, 24 h).
    4. Postfix met osmium tetroxide 2%-oplossing (48 ° C, 4 h) en kaliumferrocyanide in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4, 2 h).
    5. Uitdrogen van de zenuwen met een reeks van graded ethanol oplossingen.
    6. Insluiten in epoxyhars (paraffine).
    7. Het gedeelte van de monsters bij een dikte van 0.5 \u2012 1.0 μm.
  2. Toluïdine blauw kleuring en morfologische analyse
    1. Vlek secties met toluïdine blauwe oplossing.
    2. Verkrijgen van microscopie beelden met behulp van een optische Microscoop, bij 400 X vergroting op de volgende gebieden langs de monsters: links IAN, het centrum van de geregenereerde segment en 2 mm distally tot de stomp; juiste IAN, het midden van het segment van de IAN overeenkomt met de site van de oogst aan de linkerkant.
    3. Selecteer afbeeldingen van alle regio's met geregenereerde zenuwvezels.
      1. Willekeurig selecteren 8 \u2012 10 gebieden van 100 μm × 100 μm, bevattende geregenereerd zenuwvezels.
      2. Uitvoeren van morfologische analyse met behulp van een geschikte software voor het meten van de volgende parameters: myelinated zenuw fiber diameter (μm) en dichtheid (graaf/gebied), zenuwen weefsel percentage, en G-ratio (myelinated axon diameter/myelinated zenuw fiber diameter ).
  3. Immunokleuring
    1. Volg standaardprotocollen voor paraffine sectie kleuring.
    2. Incubeer met primaire antilichamen gedurende 30 minuten bij 25 ° C.
    3. Wassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing 3 keer bij 25 ° C.
    4. Incubeer met secundaire antilichamen aangeduid met mierikswortelperoxidase gedurende 30 minuten bij 25 ° C.
    5. Beelden met behulp van een lichte Microscoop te verkrijgen.
  4. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
    1. Zenuwen bereiden zoals beschreven in stap 7.1.
    2. Sectie zenuwen bij een dikte van 70 \u2012 90 μm met behulp van een ultramicrotome.
    3. Secties met Reynold van lood citraat en uranyl vlek.
    4. Onderzoeken en beeld door transmissie-elektronenmicroscopie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We hebben vastgesteld dat een verhoging van de temperatuur van de huid van het gelaat van de geblokkeerde kant 1 week na de linker CSGB (Figuur 8).

Op 3 maanden na wederopbouw, de buis van de PGA-C op het gebied van de wederopbouw werd geabsorbeerd en regeneratie van de inferieure alveolaire zenuw werd waargenomen in de wederopbouw alleen- en wederopbouw + CSGB groepen (figuur 9A, B)18.

MODULE was meetbaar in beide zijden van de wederopbouw van de wederopbouw + CSGB en dit is een alleen-wederopbouw groepen. De resultaten van het elektrofysiologische evaluatie worden samengevat in tabel 118. De index van het herstel en de SCV waren significant hoger in de wederopbouw + CSGB dan in de alleen-wederopbouw groep.

We waargenomen myelinated zenuwvezels op de Midden- en distale segmenten van de geregenereerde IAN in de wederopbouw alleen- en wederopbouw + CSGB groepen (figuur 10A, B)18. De wederopbouw alleen- en wederopbouw + CSGB groepen toonde kleinere geregenereerd myelinated zenuw diameters in vergelijking met de normale controlegroep (centraal segment van de juiste IAN in de wederopbouw groep, Figuur 10 c). Onrijpe myelinated zenuwvezels werden ook waargenomen.

Onderzoek van de wederopbouw alleen-, wederopbouw- + CSGB-groepen met behulp van TEM toonde geregenereerde myelinated zenuwvezels en Schwann cellen (Figuur 10 d, E). Figuur 10F toont deze resultaten van TEM voor de normale controlegroep (centraal segment van de juiste IAN in de wederopbouw-groep).

De aanwezigheid van geregenereerde axonen en cellen van Schwann werd bevestigd tijdens de Midden- en distale segmenten van de wederopbouw alleen- en wederopbouw + CSGB groepen, door kleuring met anti-neurofilament (NF) en anti-S100 antilichamen, respectievelijk (Figuur 11 )18.

Morfologische evaluatieresultaten worden samengevat in tabel 218. De diameter van de myelinated zenuw vezels in het midden van de geregenereerde links IAN segment was 4,27 ± 1,5 µm in de groep van de wederopbouw en 5.11 ± 1.98 µm in de CSGB groep, terwijl op de distale segment van de geregenereerde links IAN de diameter 3,47 ± 1.21 µm in het re­ tion groep en 4.53 ± 1.36 µm in de CSGB-groep. In beide gevallen is de diameter aanzienlijk groter in de CSGB-groep, die ook blijk gegeven van een aanzienlijk hoger myelinated zenuw fiber dichtheid en zenuw weefsel percentage in zowel het midden en het distale segment van de geregenereerde links IAN. G was-de verhouding in het midden van de geregenereerde links IAN 0,75 ± 0,04 in de groep van de wederopbouw en 0.68 ± 0,05 in de CSGB groep, terwijl in het distale gedeelte het was 0,74 ± 0,04 in de groep van de wederopbouw en 0,69 ± 0,04 in de CSGB-groep. Dus, in beide gevallen, de G-verhouding was significant kleiner in de CSGB-groep.

Het formaat van het monster voor de wederopbouw alleen- en wederopbouw + CSGB groepen waren n = 7. De statistische analyses voor de diameter van de myelinated zenuw fiber en dichtheid, G-verhouding en SCV werden uitgevoerd met behulp van Dunnett-test. Analyse van de herstel-index werd uitgevoerd met behulp van een ongepaard Student t-test. Het niveau van de statistische significantie werd vastgesteld op 5% (p < 0,05).

Figure 1
Figuur 1: Polyglycolic zuur buis gevuld met collageen spons. A) bruto beeld van de buis. De uiteindelijke afmetingen van de zenuw leiding waren 14 mm lengte, inwendige diameter van 3 mm en wanddikte van 50 µm. B) Scanning electron opname van de buis. Dit cijfer is eerder gepubliceerd door Shionoya et al. 18 en is herdrukt met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: links inferieur alveolaire zenuw (IAN) pre-en post wederopbouw. A) pre wederopbouw afbeelding van de linker IAN na wordt blootgesteld door verwijdering van bot. B) na wederopbouw beeld van de linker IAN gereconstrueerd met behulp van een polyglycolic zuur-collageen buis. Dit cijfer is eerder gepubliceerd door Shionoya et al. 18 en is herdrukt met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: berekend tomografie beeldvorming van het gezicht bot na vertrek inferieur alveolaire zenuw reconstructie. De afbeelding toont aan dat de mandibulaire bot plaat in de juiste positie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: pre-operatieve huid op het gebied van de borst linkerzijde voorafgaand aan de operatie markeringen. Foto tonen de markeringen van de huid voor het uitvoeren van het cervicale sympathiek ganglion blok. De lijn van de incisie is 20 cm in lengte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: operationele weergave van het cervicale sympathiek ganglion blok: pre Thoracotomie. Afbeelding toont de tweede en derde ribben na de vergroting van de musculus serratus ventralis en scalenus spieren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: operationele weergave van het cervicale sympathiek ganglion blok: na Thoracotomie. Afbeelding toont de linker cervicale sympathiek ganglion na laterale Thoracotomie op de tweede en derde intercostale ruimte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: cervicale sympathiek ganglion pre-en post ethanol injectie met behulp van een naald 30 G. A) Pre ethanol injectie beeld van de linker cervicale sympathiek ganglion. B) na ethanol injectie afbeelding van de linker cervicale sympathiek ganglion. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: Thermogram na linker cervicale sympathiek ganglion blok (CSGB). De thermogram werd één week na de CSGB overgenomen door ethanol injectie. Merk op dat de temperatuur van de huid van het gelaat aan de linkerzijde hoger dan aan de contralaterale zijde is. De kleurenbalk toont u temperatuur in ° C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9: geregenereerd inferieur alveolaire zenuw (IAN). Een) beeld van de IAN in de alleen-wederopbouw groep. B) afbeelding van de IAN in de wederopbouw + CSGB (cervicale sympathiek ganglion blok) groep. Zenuw regeneratie (regio tussen witte pijlpunten) is waargenomen in beide groepen. Dit cijfer is eerder gepubliceerd door Shionoya et al. 18 en is herdrukt met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 10
Figuur 10: toluïdine blauw en Transmissie Electronenmicroscopie analyse van de geregenereerde inferieur alveolaire zenuw (IAN). Een - C) semi-thin dwarse secties van de IAN op 3 maanden na wederopbouw gekleurd met toluïdine blauw. Afbeeldingen tonen de distale segmenten van de geregenereerde links IAN in elke groep, zoals aangegeven. D - F) Transmissie Electronenmicroscopie beelden van semi-dunne gedeelten met myelinated en niet-myelinated zenuwvezels (zwarte en witte pijlpunten, respectievelijk). Schaal staven 50 µm in (A) - (C) en 5 µm (D) - (F). Normale controle: centraal segment van de juiste IAN in de alleen-wederopbouw groep. Dit cijfer is eerder gepubliceerd door Shionoya et al. 18 en is herdrukt met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 11
Figuur 11: analyse van Immunohistochemical van distale segmenten van de geregenereerde links inferieur alveolaire zenuw (IAN). A, B) secties van de geregenereerde IAN op 3 maanden na wederopbouw gekleurd met een anti-neurofilament (NF) antilichaam voor de wederopbouw-alleen groep (A) en wederopbouw + cervicale sympathiek ganglion blok (CSGB; B) groepen. Zwarte pijlpunten geven geregenereerde axonen. C, D) secties van de geregenereerde IAN op 3 maanden na wederopbouw gekleurd met een anti-S-100-antilichaam voor de wederopbouw-alleen groep (C) en wederopbouw + CSGB (D) groepen. Witte pijlpunten geven cellen van Schwann. Schaal bars, 50 µm. Dit cijfer is eerder gepubliceerd door Shionoya et al. 18 en is herdrukt met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Sensorische zenuw conductie (m/s) Herstel index
Normale controle 48.5 ± 2.8 -
Dit is een alleen-wederopbouw groep 36.8 ± 2.9* 0,22 ± 0,04
Wederopbouw + CSGB groep 42.0 ± 2.4*# 0.35 ± 0.06#

Tabel 1: elektrofysiologische bevindingen in de inferieur alveolaire zenuw (IAN) op 3 maanden na de operatie. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking (n = 7). Vergelijkingen werden gemaakt met behulp van een ongepaard Student t-test. IAN, inferieur alveolaire zenuw; CSGB, cervicale sympathiek ganglion blok. *, p < 0.05 in vergelijking met de normale controlegroep; #, p < 0.05 in vergelijking met de alleen-wederopbouw groep. Normale controle: centraal segment van de juiste IAN in de alleen-wederopbouw groep; Herstel index: de verhouding van de amplitude van de piek van de linker IAN van de wederopbouw-only of wederopbouw + CSGB-Fractie aan de maximale amplitude van de normale controle. Deze tabel werd eerder gepubliceerd door Shionoya et al. 18 en is herdrukt met toestemming.

De diameter van de myelinated zenuw fiber (μm) Myelinated zenuw fiber dichtheid (graaf/100 μm2) Aandeel van zenuwweefsel (%) G verhouding
Normale controle Center 8.83 ± 3.11 103 ± 8 41.3 ± 3,9 0.62 ± 0,03
Dit is een alleen-wederopbouw groep Center 4,27 ± 1.5* 126 min of meer 20 * 11.6 ± 2.1* 0,75 ± 0.04*
Distale 3.47 ± 1.21* 109 ± 17 * 7.3 ± 2.0* 0,74 ± 0.04*
Wederopbouw + CSGB groep Center 5.11 ± 1.98*# 140 ± 22 *# 15.9 ± 3.0*# 0.68 ± 0.05*#
Distale 4.53 ± 1.36*$ 123 ± 15 *$ 12.5 ± 2.1*$ 0,69 ± 0.04*$

Tabel 2: morfologische bevindingen in de inferieure alveolaire zenuw (IAN) op 3 maanden na de operatie. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking (n = 7). Er werden vergelijkingen gemaakt met behulp van Dunnett-test. IAN, inferieur alveolaire zenuw; CSGB, cervicale sympathiek ganglion blok. *, p < 0.05 in vergelijking met de normale controlegroep; * #, p < 0,05 ten opzichte van het midden segment van de linker IAN in de alleen-wederopbouw groep; * $,p < 0,05 ten opzichte van het distale einde van de linker IAN in de alleen-wederopbouw groep. Normale controle: centraal segment van de juiste IAN in de alleen-wederopbouw groep; G verhouding is de verhouding van de diameter van de myelinated axon aan de diameter van de totale myelinated vezel. Deze tabel werd eerder gepubliceerd door Shionoya et al. 18 en is herdrukt met toestemming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Met behulp van een bioabsorbable zenuw buis in combinatie met CSGB ethanol-geïnduceerde presenteren we een efficiënte methode voor IAN regeneratie. Voor deze studie gebruikten we honden, aangezien andere dierlijke modellen, zoals muizen, ratten en konijnen, een korte levensverwachting en kleine lichaamslengte hebben, en vandaar kunnen niet worden gebruikt voor het uitvoeren van de precieze chirurgische procedures. De IAN bevindt zich binnen de mandibulaire gracht omgeven door bot, is een chirurgische techniek noodzakelijk zenuwen en bloedvat om schade te voorkomen bij het uitvoeren van de wederopbouw van de zenuw. Een belangrijke technische tip voor de procedure is om zorgvuldig de mandibulaire bot plaat om te minimaliseren van het risico van verwonding van de zenuw en schip. Traditionele burs en micro zagen geen onderscheid maken tussen harde en zachte weefsel21. Bovendien hebben deze hulpprogramma's de neiging te glijden veroorzaakt beschadiging van de aangrenzende weefsel, vooral de IAN, door toevallige contact22. We gebruikten daarom piëzo-elektrische chirurgische instrumenten voor het bot verwerken stappen. Dit is een nieuwe en innovatieve bot operatie techniek die gebruikmaakt van ultrasone microvibrations van gespecialiseerde scalpels. Dus, zacht weefsel niet beschadigd kunnen worden zelfs bij toevallige contact met de cutting tips23,24. Microvibrations van 60-200 µm/s op 24-29 kHz zijn optimaal voor het snijden van elastische gemineraliseerde weefsel terwijl sparend elastische weke delen; Dit is niet mogelijk bij frequenties boven 50 kHz25. Bovendien, roterende burs of oscillerende zagen vereisen een kracht om het tegengaan van de rotatie of de trilling van het instrument. In vergelijking met deze instrumenten, piëzo-elektrische chirurgische instrumenten hoeft niet toepassing van extra kracht en zo veilig en nauwkeurige verwerking van het bot is mogelijk26. Dit is vooral belangrijk in de handen van een nieuwe gebruiker.

Een ander belangrijk aspect in onze werkwijze is dat de plaat bot was niet vastgesteld met behulp van metalen platen maar in de oorspronkelijke positie in de onderkaak na de plaatsing van de PGA-C-buis geplaatst werd. De reden hiervoor was om te voorkomen dat het risico van blootstelling van de plaat aan mondelinge mucosal necrose, die ontstaat bij het gebruik van metalen platen voor fixatie. Echter in sommige gevallen de bot plaat afgeweken van de oorspronkelijke site. Het is daarom van cruciaal belang voor het uitvoeren van een CT-scan van het gezicht bot om te bevestigen dat de mandibulaire bot plaat in de juiste positie na de operatie is. Wanneer u een metalen plaat voor fixatie, moet strakke betreft worden vermeden als het mondelinge mucosal necrose als gevolg van verstoringen in de gasstroom bloed kan veroorzaken.

CSGB is een effectieve behandeling van perifere vaatziekten en pijnsyndromen van het gezicht en de hals13,14,15. Nochtans, de mechanismen die ten grondslag liggen aan de therapeutische gevolgen ervan onduidelijk blijven. Een van de redenen voor het gebrek aan onderzoek over de therapeutische effecten van CSGB is de moeilijkheid in het verkrijgen van een consistent en uniform sympatholytic effect. De verspreiding van de blokkade van de sympathische na percutane CSGB is bijvoorbeeld niet uniform27,28. Mullenheim et al. 29 geïmplanteerd honden met een polyethyleen katheter, na Thoracotomie, onder de fascia en langs de bovenste sympathieke keten, en CSGB uitgevoerd door het injecteren van lidocaïne via de katheter. Hoewel deze benadering sympathiek blokkade op de gerichte gebieden verspreiden kan, draagt het risico's van occlusie van de katheter of dislocatie, evenals infectie, met name in lange termijn experimenten. In onze canine model van CSGB, de directe inspuiting van 99,5% ethanol geproduceerd op lange termijn toename van de bloedtoevoer naar de ipsilaterale orofaciale regio. In onze aanpak, werd blok injectie toegediend onder directe visualisatie, zodat CSGB konden worden uitgevoerd met precisie. Daarom is onze aanpak vermindert het risico van ongelijke spreiding van het sympatholytic effect en de sympathieke blokkade. Dit wordt beschouwd als nuttig zijn, vooral in lange termijn experimenten. Bovendien, we gewend thermografie bevestigen het succes van CSGB, aangezien de gezichtshuid temperatuur stijgt aan de kant van de blok op succesvolle CSGB. In dit geval is thermografie handig, want het is eenvoudig en noninvasive. Bovenal de neus en niet de temperatuur van de huid van het gelaat moeten worden gemeten, aangezien het niet is beïnvloed door de haren van de hond. Ons model zou kunnen bijdragen tot verder onderzoek over de therapeutische effecten van CSGB. In onze eerdere studie verhoogde bloedstroom in het orofaciale gebied voor 6-11 weken na cervicale sympathiek ganglionectomy. Onderzoekers kunt deze alternatieve methode30 indien gewenst.

De beperking van deze studie is dat ethanol-geïnduceerde CSGB het risico brengt van het ontwikkelen van permanente Horner's syndroom (ptosis en miosis)31. Andere methoden, waaronder radiofrequente ablatie, fenol en sympathieke ganglionectomy zijn gebruikt voor het uitvoeren van sympathectomies; echter specifiek voor sympathectomy van de cervicale sympathiek ganglion, is alleen RadioFrequente ablatie werkzaam in de klinische praktijk32,33,34,35. Daarom kan RadioFrequente ablatie en lokale anesthetica worden beschouwd als een alternatieve methode om ethanol-geïnduceerde CSGB. Toekomstige studies zou nodig zijn om te controleren hoe zenuw regeneratie gemedieerd door een buis van bioabsorbable zenuw kan worden verbeterd door de CSGB met een plaatselijke verdoving of radiofrequentie ablatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door het departement voor de organen van de Bioartificial in Kyoto University Institute voor Frontier medische wetenschap. We zouden graag bedanken het veterinaire personeel van het Instituut voor Frontier medische wetenschap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NMP Collagen PS Nippon Meatpackers 301-84621 Atelocollagen extracted from young porcine skin by enzyme treatment
Surgical clippers Roboz Surgical Instrument Company RC-5903
Disposable scalpel (No.15) Kai medical 219ABBZX00073000
VarioSurg3 Nakanishi VS3-LED-HPSC, E1133 Piezoelectric surgery for bone processing
4-0 nylon sutures Ethicon 8881H
8-0 nylon sutures Ethicon 2775G
Isepamicin sulfate Nichi-Iko 620005641
Disposable scalpel (No.10) Kai medical 219ABBZX00073000
30-gauge needle Nipro 1134
1-0 absorbable stitches Ethicon J347H
3-0 Nylon stitches Ethicon 8872H
Neo Thermo NEC Avio TVS-700 Infrared thermography 
Neuropack Σ NIHON KOHDEN MEB-5504 Orthodromic recorder for electrophysiological recording
Toluidine Blue Sigma-Aldrich T3260-5G
Light microscope Keyence BZ-9000
Mouse anti-human neurofilament protein monoclonal antibody DAKO N1591
Polyclonal rabbit anti-S100 antibody DAKO Z0311
Transmission electron microscopy Hitachi High Technologies Hitachi H-7000
Dynamic cell count Keyence BZ-H1C Software for morphological evaluation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Sabbagh, M., Okeson, J. P., Bertoli, E., Medynski, D. C., Khalaf, M. W. Persistent pain and neurosensory disturbance after dental implant surgery: prevention and treatment. Dental Clinics of North America. 59 (1), 143-156 (2015).
  2. Chaushu, G., Taicher, S., Halamish-Shani, T., Givol, N. Medicolegal aspects of altered sensation following implant placement in the mandible. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 17 (3), 413-415 (2002).
  3. Robinson, P. P., Loescher, A. R., Yates, J. M., Smith, K. G. Current management of damage to the inferior alveolar and lingual nerves as a result of removal of third molars. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 42 (4), 285-292 (2004).
  4. Gregg, J. M. Studies of traumatic neuralgia in the maxillofacial region: symptom complexes and response to microsurgery. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 48 (2), 135-140 (1990).
  5. Pogre, M. A. The results of microneurosurgery of the inferior alveolar and lingual nerve. Journal of Oral and Maxillofacial Sureryg. 60 (5), 485-489 (2002).
  6. Strauss, E. R., Ziccardi, V. B., Janal, M. N. Outcome assessment of inferior alveolar nerve microsurgery: a retrospective review. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 64 (12), 1767-1770 (2006).
  7. Nakamura, T., et al. Experimental study on the regeneration of peripheral nerve gaps through a polyglycolic acid-collagen (PGA-collagen) tube. Brain Research. 1027 (1-2), 18-29 (2004).
  8. Yoshitani, M., et al. Experimental repair of phrenic nerve using a polyglycolic acid and collagen tube. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 133 (3), 726-732 (2007).
  9. Seo, K., et al. One-year outcome of damaged lingual nerve repair using a PGA-collagen tube: a case report. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 66 (7), 1481-1484 (2008).
  10. Seo, K., et al. Protracted delay in taste sensation recovery after surgical lingual nerve repair: a case report. Journal of Medical Case Reports. 7, 77 (2013).
  11. Seo, K., Terumitsu, M., Inada, Y., Nakamura, T., Shigeno, K., Tanaka, Y. Prognosis after surgical treatment of trigeminal neuropathy with a PGA-c tube: report of 10 Cases. Pain Medicine. 17 (12), 2360-2368 (2016).
  12. Okuda, Y., Kitajima, T. Comparison of stellate ganglion block with intravascular infusion of prostaglandin e1 on brachial artery blood flow in dogs. Anesthesia and Analgesia. 84 (6), 1329-1332 (1997).
  13. Kohjitani, A., Miyawaki, T., Kasuya, K., Shimada, M. Sympathetic activity-mediated neuropathic facial pain following simple tooth extraction: a case report. Cranio. 20 (2), 135-138 (2002).
  14. Melis, M., Zawawi, K., al-Badawi, E., Lobo Lobo, S., Mehta, N. Complex regional pain syndrome in the head and neck: a review of the literature. Journal of Orofacial Pain. 16 (2), 93-104 (2002).
  15. Salvaggio, I., Adducci, E., Dell'Aquila, L., Rinaldi, S., Marini, M., Zappia, L., Mascaro, A. Facial pain: a possible therapy with stellate ganglion block. Pain Medicine. 9 (7), 958-962 (2008).
  16. Atsumi, M., Sunada, K. The effect of superior cervical ganglion resection on peripheral facial palsy in rats. Journal of Anesthesia. 30 (4), 677-683 (2016).
  17. Hanamatsu, N., Yamashiro, M., Sumitomo, M., Furuya, H. Effectiveness of cervical sympathetic ganglia block on regeneration of the trigeminal nerve following transection in rats. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 27 (3), 268-276 (2002).
  18. Shionoya, Y., Sunada, K., Shigeno, K., Nakada, A., Honda, M., Nakamuram, T. Can nerve regeneration on an artificial nerve conduit be enhanced by ethanol-induced cervical sympathetic ganglion block? PLoS One. 12 (12), e0189297 (2017).
  19. Suzuki, Y., Tanihara, M., Ohnishi, K., Suzuki, K., Endo, K., Nishimura, Y. Cat peripheral nerve regeneration across 50 mm gap repaired with a novel nerve guide composed of freeze-dried alginate gel. Neuroscience Letters. 259 (2), 75-78 (1999).
  20. Ichihara, S., et al. Development of new nerve guide tube for repair of long nerve defects. Tissue Engineering, Part C, Methods. 15 (3), 387-402 (2009).
  21. Grenga, V., Bovi, M. Piezoelectric surgery for exposure of palatally impacted canines. Journal of Clinical Orthodontics. 38, 446-448 (2004).
  22. Degerliyurt, K., Akar, V., Denizci, S., Yucel, E. Bone lid technique with piezosurgery to preserve inferior alveolar nerve. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 108 (6), e1-e5 (2009).
  23. Kotrikova, B., et al. Piezosurgery--a new safe technique in cranial osteoplasty? International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 35 (5), 461-465 (2006).
  24. Vercellotti, T. Piezoelectric surgery in implantology: a case report-a new piezoelectric ridge expansion technique. International Journal of Periodontics and Restorative Dentistry. 20 (4), 358-365 (2000).
  25. Stübinger, S., Kuttenberger, J., Filippi, A., Sader, R., Zeilhofer, H. F. Intraoral piezosurgery: Preliminary results of a new technique. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 63 (9), 1283-1287 (2005).
  26. Eggers, G., Klein, J., Blank, J., Hassfeld, S. Piezosurgery: an ultrasound device for cutting bone and its use and limitations in maxillofacial surgery. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 42 (5), 451-453 (2004).
  27. Hardy, P. A., Wells, J. C. Extent of sympathetic blockade after stellate ganglion block with bupivacaine. Pain. 36 (2), 193-196 (1989).
  28. Hogan, Q. H., Erickson, S. J., Haddox, J. D., Abram, S. E. The spread of solutions during stellate ganglion block. Regional Anesthesia. 17 (2), 78-83 (1992).
  29. Mullenheim, J., et al. Left stellate ganglion block has only small effects on left ventricular function in awake dogs before and after induction of heart failure. Anesthesia and Analgesia. 91 (4), 787-792 (2000).
  30. Tsujimoto, G., Sunada, K., Nakamura, T. Effect of cervical sympathetic ganglionectomy on facial nerve reconstruction using polyglycolic acid-collagen tubes. Brain Research. 1669, 79-88 (2017).
  31. Ghai, A., Kaushik, T., Kumar, R., Wadhera, S. Chemical ablation of stellate ganglion for head and neck cancer pain. Acta Anaesthesiologica Belgica. 67 (1), 6-8 (2016).
  32. Forouzanfar, T., van Kleef, M., Weber, W. E. Radiofrequency lesions of the stellate ganglion in chronic pain syndromes: retrospective analysis of clinical efficacy in 86 patients. Clinical Journal of Pain. 16 (2), 164-168 (2000).
  33. Ohno, K., Oshita, S. Transdiscal lumbar sympathetic block: a new technique for a chemical sympathectomy. Anesthesia and Analgesia. 85 (6), 1312-1316 (1997).
  34. Slappendel, R., Thijssen, H. O., Crul, B. J., Merx, J. L. The stellate ganglion in magnetic resonance imaging: a quantification of the anatomic variability. Anesthesiology. 83 (2), 424-426 (1995).
  35. Wang, Y. C., Wei, S. H., Sun, M. H., Lin, C. W. A new mode of percutaneous upper thoracic phenol sympathicolysis: report of 50 cases. Neurosurgery. 49 (3), 628-634 (2001).

Tags

Neurowetenschappen en kwestie 141 neurowetenschappen in situ weefselengineering kunstmatige zenuw Goten polyglycolic zuur-collageen buis cervicale sympathiek ganglion blok canine model
Ethanol-geïnduceerde cervicale sympathiek Ganglion blok toepassingen voor het bevorderen van Canine inferieur alveolaire zenuw regeneratie met behulp van een kunstmatige zenuw
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shionoya, Y., Sunada, K., Tsujimoto, … More

Shionoya, Y., Sunada, K., Tsujimoto, G., Shigeno, K., Nakamura, T. Ethanol-Induced Cervical Sympathetic Ganglion Block Applications for Promoting Canine Inferior Alveolar Nerve Regeneration Using an Artificial Nerve. J. Vis. Exp. (141), e58039, doi:10.3791/58039 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter