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Neuroscience

Applications de blocs induite par l’éthanol du Ganglion sympathique Cervical pour promouvoir la régénération Canine nerf alvéolaire inférieur à l’aide d’un nerf artificiel

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58039
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3
1Department of Dental Anesthesia, Nippon Dental University Hospital at Tokyo, 2Department of Dental Anesthesiology, Nippon Dental University School of Life Dentistry at Tokyo, 3Department of Bioartificial Organs, Institute for Frontier Medical Science, Kyoto University

Summary

Nous avons évalué l’effet de bloc du ganglion sympathique cervical sur la réparation de nerf à l’aide de conduites nerveuses artificielles. Chiens beagle mâles étaient chacun implantés avec un nerf artificiel à travers un écart de 10 mm dans le nerf alvéolaire inférieur gauche ; ganglion sympathique cervical gauche a été bloqué par l’injection de 99,5 % d’éthanol par thoracotomie latérale.

Abstract

Polyglycolique collagène acide (PGA-C) tubes sont des tubes de nerf BIOABSORBABLES remplis de collagène de structure multichambre, qui se composent de films minces de collagène. Les résultats cliniques favorables ont été réalisés lors de l’utilisation de ces tubes pour le traitement du nerf alvéolaire inférieur endommagé (IAN). Un facteur essentiel pour la régénération des nerfs réussie à l’aide de tubes PGA-C est sanguine dans les tissus environnants. Bloc du ganglion sympathique cervical (CSGB) crée un blocage sympathique dans la région tête et cou, ce qui augmente la circulation sanguine dans la région. Afin d’assurer un effet suffisant, le blocus doit être administré avec des anesthésiques locaux une à deux fois par jour pendant plusieurs semaines consécutives ; Cela pose un défi lors de la création de modèles animaux pour l’étude de cette technique. Pour combler cette lacune, nous avons développé un CSGB induite par l’éthanol dans un modèle canin d’augmentation à long terme dans la circulation sanguine dans la région oro-faciale. Nous avons examiné si la régénération IAN par implantation de tube PGA-C peut être renforcée par ce modèle. Quatorze des Beagles ont été chacun implantés avec un tube de PGA-C sur un espace de 10 mm dans la gauche IAN. L’IAN se trouve dans le canal mandibulaire entouré d’os, donc nous avons choisi la chirurgie piézoélectrique, consistant en des ondes ultrasoniques, pour le traitement de l’OS, afin de minimiser le risque de lésions nerveuses et de navire. Un bon résultat chirurgical a été obtenu grâce à cette approche. Une semaine après la chirurgie, sept de ces chiens furent soumis à gauche CSGB par injection d’éthanol. CSGB induite par l’éthanol a entraîné dans la régénération du nerf améliorées, ce qui suggère que l’augmentation du débit sanguin favorise efficacement la régénération nerveuse dans des défauts de IAN. Ce modèle canin peut contribuer à des recherches plus poussées sur les effets à long terme de l’ONGC.

Introduction

Dans de nombreux cas, des lésions traumatiques du nerf alvéolaire inférieur (IAN) sont iatrogène, souvent causés par l’extraction de la troisième molaire, ou le placement des implants dentaires1,2,3. Blessures de l’IAN peuvent conduire à des déficits en thermique et tactile des sensations ainsi que paresthésie, dysesthésie, hypoesthésie et allodynie. Lésions du nerf sont considérée non seulement par un traitement conservateur, mais aussi par d’autres méthodes, y compris la suture et le placement de l’autogreffe. Cependant, ces méthodes ont des inconvénients, qui comprennent souvent l’absence d’amélioration des symptômes et anomalies neurologiques le donneur site4,5,6.

Le nerf artificiel — polyglycolique tube d’acide-collagène (PGA-C) a été développé au Japon. C’est un tube BIOABSORBABLES avec sa lumière interne rempli d’un collagène de spongiforme7. Lors des expérimentations animales, ce tube a été utilisé pour améliorer la régénération nerveuse chez le chien beagle avec défaut de nerf péronier et a été montré pour promouvoir le niveau de recouvrement supérieur de greffe nerveuse autologue8. L’application clinique de la PGA-C tube a commencé en 2002 chez des patients atteints de lésions des nerfs périphériques. En outre, les résultats cliniques favorables ont été obtenus dans le traitement des neuropathies trigéminales (IAN et le nerf lingual)9,10,11. Un facteur essentiel pour la régénération des nerfs réussie à l’aide de tubes PGA-C est des réserves de sang aux tissus environnants8. Bloc du ganglion sympathique cervical (CSGB) crée un blocage sympathique dans la région de la tête et du cou et augmente le flux sanguin vers la zone innervée respectifs12; ainsi, il a été utilisé dans le traitement du syndrome douloureux régional complexe et insuffisance circulatoire13,14,15. Toutefois, on a seulement quelques études expérimentales sur l’efficacité de l’ONGC en croissant sang écoulement16,17. Pour assurer une efficacité CSGB adéquate, le blocus doit être appliqué avec les anesthésiques locaux une ou deux fois chaque jour pendant plusieurs semaines, posant ainsi un défi lors de la génération de modèles animaux pour enquêter sur cette technique. Pour combler cette lacune, dans une étude précédente, nous avons développé un modèle canin de flux de sang accru à long terme dans la région d’orofacial18. Le modèle a été généré en effectuant un CSGB en injectant 99,5 % d’éthanol. Nous avons évalué le débit sanguin de la muqueuse buccale et la température de la peau nasale par débitmétrie Doppler laser et thermographie infrarouge une fois par semaine pendant 12 semaines. Nous avons constaté que la circulation sanguine de la région oro-faciale a été augmentée de 7 à 10 semaines dans ce modèle.

Dans la présente étude, nous avons évalué les effets du CSGB induite par l’éthanol sur la régénération des nerfs.
Le tube de la PGA-C a été implanté dans chiens beagle à travers un écart de 10 mm dans la gauche IAN. Une semaine plus tard, ONGC a été réalisée par l’injection d’éthanol. Trois mois après la chirurgie, nous avons réalisé diverses études électrophysiologiques, histologiques et morphologiques pour évaluer les effets de l’ONGC sur la régénération des nerfs. Nous fournissons un protocole détaillé pour la reconstruction de IAN en utilisant un tube de PGA-C et le CSGB induite par l’éthanol.

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Protocol

Cette étude a été réalisée conformément aux principes directeurs pour le soin et l’utilisation des animaux et approuvée par le Comité pour la recherche animale de l’Université de Kyoto (Kyoto, Japon ; numéro d’autorisation : R-16-16). Tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum les souffrances animales, et toutes les sections du présent rapport adhèrent à l’arrivée (Animal Research : rapports d’expériences de in Vivo ) lignes directrices.

1. fabrication du tube PGA-C

  1. Pour fabriquer le conduit artificiel nerf au moyen d’un tube de (PGA) acid polyglycolique absorbable, utiliser une machine à tresser tubulaire équipée de 48 piles et cinq fibres PGA, composés de faisceaux de 26 filaments (Figure 1)18.
  2. Pour rendre la surface des tubes PGA hydrophile, l’exposer à une décharge de plasma.
  3. Utilisez 1 % v/w atélocollagène chlorhydrate solution7.
    Remarque : Atélocollagène est extrait de peau de porcine par traitement enzymatique et soumis à un contrôle de virus. Principalement, il se compose de type I (70 – 80 %) et7du collagène III, le rapport dont est décrit en détail ailleurs type. Préparer la solution de collagène en dissolvant collagène 1 g dans 100 mL de solution de chlorhydrate (pH = 3.0). Puisque la densité de la solution de chlorhydrate est environ 1.0, la concentration de collagène w/w est près de 1 %.
  4. Enduire le tube avec les couches de collagène en plongeant à plusieurs reprises dans la solution de chlorhydrate de collagène 1 % pendant 5 s chaque fois.
    1. Après trempage, sécher le tube sur un banc propre à température ambiante. Effectuer la prochaine immersion après s’être assuré que le tube est complètement sec (environ 6 h pour le séchage à l’air).
    2. Répétez le procédé de revêtement 10 fois.
  5. Sous réserve du tube de la PGA-C jusqu'à 140 ° C pendant 24 h sous vide (traitement de la dehydrothermal), afin de contrôler les bio-absorption et réticulation des molécules de collagène. Effectuer l’ensemble du processus dans des conditions aseptiques.
    Remarque : Cette procédure génère un tube de 50 μm d’épaisseur, diamètre intérieur de 3 mm et 14 mm longueur finale.

2. opération chirurgicale mise en place

  1. Utilisez des beagles mâles adultes pesant 9.0 à 13,0 kg.
    1. Abriter les animaux dans des cages séparées, dans des conditions contrôlées de chenil (cycle de lumière et l’obscurité de 12 h).
    2. Fournir de la nourriture solide et eau ad libitum.
  2. Peser les beagles.
  3. Stériliser tous les instruments chirurgicaux.
  4. Enfilez les gants stérilisés et désinfecter toutes les surfaces de la mise en fonctionnement avec une solution d’éthanol à 80 %. Jeter les gants utilisés.
  5. Effectuer le lavage chirurgical.
  6. Mettre sur un masque frais, blouse et des gants stériles.

3. l’anesthésie et préparation de la peau

  1. Anesthésier le chien avec un mélange de chlorhydrate de kétamine 5 mg/kg et de xylazine 1 mg/kg par injection intramusculaire.
  2. Intuber le malade par un tube trachéal de 7,5 mm de diamètre et 25 cm de longueur.
  3. Placez le chien sur le poste de latéral droit. Maintenir une anesthésie générale avec le sévoflurane 3,2 % avec de l’oxygène (1,0 L/min).
  4. Utiliser un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 ° C.
  5. Appliquer un gel ophtalmique sur la surface antérieure des yeux pour éviter l’abrasion cornéenne.
  6. Soigneusement raser le champ chirurgical (région de la poitrine côté gauche) à l’aide de tondeuses chirurgicales. Pulvériser une quantité substantielle de solution alcoolique sur le site opératoire. Attendez au moins 15 secondes Répétez l’application 3 fois.
  7. Enregistrer le rythme cardiaque et la saturation en oxygène au cours de la chirurgie.

4. inférieur alvéolaire nerf Reconstruction utilisant PGA-C tube : élaboration d’un modèle Reconstruction uniquement

  1. Injecter 3 mL de lidocaïne à 1 % à l’aide d’une aiguille de 27 G à la gencive mandibulaire gauche comme un anesthésique local et analgésique.
  2. Effectuer une incision transversale de 5 cm avec une lame de bistouri Swann-Morton numéro 15 dans la gencive mandibulaire gauche, d’exposer les mandibules de l’animal.
  3. Utiliser des vibrations ultrasoniques piézoélectriques pour broyer l’aspect proximal de la mandibule en un rectangle de 8 mm × 3 cm à travers le trou mentonnier postérieure.
    Remarque : La fréquence de vibration a été \u2012 28 32 kHz.
  4. Retirer la partie frontale de la plaque de l’os mandibulaire (dimensions, 3 cm x 8 mm) pour exposer la gauche IAN (Figure 2 a)18.
    Nota : Le site de reconstruction correspond à l’apex de la racine de la première molaire
  5. Transect le NIO avec un scalpel pour enlever un segment de 10 mm.
  6. Insérez les souches proximales et distales du nerf sectionné dans le tube de nerf à une profondeur de 2 mm.
  7. Utiliser des sutures en nylon de 8-0 et un microscope chirurgical à un grossissement de 8 X à suturer le tube au nerf proximal et distal termine (Figure 2 b)18.
  8. Retourner la plaque osseuse à son emplacement d’origine dans la mandibule.
  9. Refermer la plaie avec des sutures en nylon 4-0.
  10. Un jour après la chirurgie, confirment que la plaque de l’os mandibulaire est à sa place.
    1. 4.10.1 effectuer d’imagerie de la tomodensitométrie (TDM) de l’os du visage sous anesthésie. Définissez les paramètres CT comme suit : 120 kVp, 200 mAs, 0,5 mm/s, épaisseur de la tranche de 0,5 mm.
      1. Administrer l’anesthésie à l’aide d’un mélange de 5 mg/kg la kétamine chlorhydrate et 1 mg/kg xylazine (Figure 3).
  11. Administrer l’ampicilline (100 mg/jour) comme un antibiotique et de l’acétaminophène (100 mg/jour) comme analgésique pendant une semaine après la chirurgie.

5. induite par l’éthanol CSGB : développement de la Reconstruction + modèle CSGB

  1. Effectuer la reconstruction IAN tel que décrit à l’article 4 et prévoir une semaine pour la récupération.
  2. Anesthésier l’animal avec le sévoflurane 1,5 % dans l’air (6 L/min) et oxygène (4 L/min). Se raser et nettoyer le champ opératoire prévu, tel que décrit à l’article 3.
  3. Marquer la ligne d’incision avec un marqueur de peau chirurgical en traçant une ligne sur la poitrine du côté gauche (Figure 4, la ligne d’incision est 20 cm de longueur).
  4. Injecter 5 mL de lidocaïne à 1 % à l’aide d’une aiguille de 21 G à la poitrine du côté gauche comme un anesthésique local et analgésique.
  5. Inciser la peau côté gauche de la poitrine avec une lame de bistouri Swann-Morton numéro 10.
  6. Inciser la couche de graisse avec un bistouri électrique pour exposer l’aponévrose musculaire.
  7. Exposer le serratus ventralis muscle et le muscle scalenus.
  8. Soulever le serratus ventralis muscle et le muscle scalenus de ventral à dorsal pour exposer les deuxième et troisième côtes (Figure 5).
  9. Réaliser une thoracotomie latérale gauche à la deuxième et troisième espace intercostal pour exposer le ganglion sympathique cervical gauche (Figure 6).
  10. Injecter 0,2 mL de 99,5 % d’éthanol dans le ganglion sympathique cervical, à l’aide d’une aiguille de 30 G par visualisation directe (Figure 7).
  11. Fermer l’espace intercostal avec points de suture résorbable interrompu 1-0.
  12. Fermer la peau avec des mailles de nylon 3-0 interrompu.
  13. Administrer l’ampicilline (100 mg/jour) comme un antibiotique et de l’acétaminophène (100 mg/jour) comme analgésique pendant une semaine après la chirurgie.
  14. Après 1 semaine après CSGB, mesurer la température de la peau du visage avec la thermographie infrarouge pour confirmer l’ONGC.

6. les enregistrements électrophysiologiques

  1. Pour mesurer le potentiel d’action nerveux sensoriels (SNAP) et la vitesse de conduction de nerf sensitif (SCV) de l’IAN, trois mois après la reconstruction, anesthésier les animaux tel que décrit à l’article 3.
    NOTE : Accrochage / SCV doivent être mesurée sur les deux côtés de contrôle expérimental et normale pour chaque chien dans les deux groupes de traitement.
  2. Faites une incision dans la gencive mandibulaire gauche avec une lame de bistouri Swann-Morton numéro 10.
  3. Retirer délicatement la plaque osseuse mandibulaire pour éviter d’endommager physiquement le nerf régénéré.
  4. Stimuler l’IAN à l’aide d’une paire d’électrodes de l’aiguille, pour enregistrer le composant logiciel enfichable et SCV.
    1. Placer les électrodes dans la partie proximale de la gaine de nerf.
    2. Appliquer 10 kHz stimulus électrique 20 fois.
  5. Analyser les résultats.
    1. Déterminer SNAP en calculant l’amplitude de la réponse moyenne à la stimulation électrique.
    2. Mesurer la latence PIC et l’amplitude de crête de l’enregistrement graphique.
    3. Calculer l’indice de récupération avec l’équation suivante : amplitude de crête de la gauche IAN de la reconstruction seule ou reconstruction + CSGB group / pic amplitude du contrôle normal (segment central de l’IAN droit dans le groupe reconstruction uniquement)19 ,,20.

7. histologique analyse

  1. Section Préparation
    1. Trois mois après la reconstruction, récolter le IAN gauche, y compris à 1 cm du nerf de chaque côté du site reconstruit.
    2. Récolter le NIO bon au niveau correspondant au site de récolte sur le côté gauche.
    3. Faire précéder les nerfs récoltés par immersion dans le glutaraldéhyde à 2,5 % dans une solution de tampon de cacodylate de 0,1 M (pH 7,4, 48 ° C, 24h).
    4. Postfix avec solution à 2 % le tétroxyde d’osmium (48 ° C, 4 h) et ferrocyanure de potassium en solution de tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4, 2 h).
    5. Déshydrater les nerfs avec une série de solutions éthanoliques graduées.
    6. Incorporer en résine époxy (paraffine).
    7. La section les spécimens sur une épaisseur de 0,5 \u2012 1,0 μm.
  2. Bleu de toluidine coloration et morphologique
    1. Tacher les sections avec solution de bleu de toluidine.
    2. Obtenir des images de microscopie à l’aide d’un microscope optique, à un grossissement de X 400 dans les régions suivantes sur les échantillons : gauche IAN, le centre du segment régénérée et de 2 mm dans la partie distale de la souche ; IAN de droit, le centre du segment IAN correspondant au site de récolte sur le côté gauche.
    3. Sélectionnez des images de toutes les régions avec des fibres nerveuses régénérées.
      1. Au hasard de certaines zones de \u2012 10 8 μm 100 × 100 μm contenant du régénéré des fibres nerveuses.
      2. Effectuer des analyses morphologiques à l’aide d’un logiciel approprié pour mesurer les paramètres suivants : diamètre des fibres nerveuses myélinisées (μm) et la densité (nombre/zone), nerveuse pourcentage de tissu et G-ratio (axones myélinisés diamètre/myélinisées fibre nerveuse diamètre ).
  3. Immunomarquage
    1. Suivent des protocoles standards pour la coloration de la section de paraffine.
    2. Incubez avec des anticorps primaires pendant 30 min à 25 ° C.
    3. Laver avec une solution saline tamponnée au phosphate 3 fois à 25 ° C.
    4. Incuber les anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort pendant 30 min à 25 ° C.
    5. Obtenir des images à l’aide d’un microscope optique.
  4. Microscopie électronique à transmission (TEM)
    1. Préparer les nerfs comme indiqué au point 7.1.
    2. Nerfs de section sur une épaisseur de 70 \u2012 90 μm à l’aide d’un ultramicrotome.
    3. Tacher les sections avec de Reynold citrate de plomb et d’uranyle.
    4. Examiner et image par microscopie électronique à transmission.

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Representative Results

Nous avons observé une augmentation de la température de la peau du visage du côté bloqué 1 semaine après le CSGB gauche (Figure 8).

Reconstruction après 3 mois, le tube de la PGA-C à la zone de reconstruction a été absorbé et la régénération du nerf alvéolaire inférieur a été observée dans la reconstruction seule et reconstruction + CSGB groupes (Fig. 9 a, B)18.

SNAP est mesurable dans les deux côtés de la reconstruction du reconstruction + CSGB et reconstruction uniquement des groupes. Les résultats de l’évaluation électrophysiologique sont résumées dans le tableau 118. L’indice du recouvrement et SCV étaient significativement plus élevés dans la reconstruction + CSGB que dans le groupe reconstruction seule.

Nous avons observé des fibres nerveuses myélinisées dans les sections du centre et distales de l’IAN régénérée dans la reconstruction seule et reconstruction + CSGB groupes (Figure 10 a, B)18. La reconstruction seule et reconstruction + groupes CSGB ont montré moins régénéré diamètres nerveuses myélinisées par rapport au groupe contrôle normal (segment central de l’IAN droit dans le groupe de reconstruction, Figure 10). Des fibres nerveuses myélinisées immatures ont aussi été observés.

Examen de la reconstruction seule, reconstruction + groupes CSGB à l’aide de TEM a montré des fibres nerveuses myélinisées régénérées et Schwann cellules (Figure 10, E As EventArgs). Figure 10F montre ces résultats de TEM pour le groupe de contrôle normal (segment central de l’IAN droit dans le groupe de reconstruction).

La présence d’axones régénérés et les cellules de Schwann a été confirmée dans les sections du centre et distales de la reconstruction seule et reconstruction + CSGB regroupe, par coloration avec des neurofilaments (NF) et les anticorps anti-S100, respectivement (Figure 11 )18.

Résultats de l’évaluation morphologique sont résumées dans le tableau 218. Le diamètre des fibres nerveuses myélinisées au centre du segment IAN gauche régénéré était 4,27 ± 1,5 µm dans le groupe de reconstruction et 5.11 ± 1,98 µm dans le groupe de l’ONGC, tandis que dans le segment distal de la régénérée gauche IAN le diamètre était 3.47 µm ± 1.21 dans la reconstruc Groupe de tion et 4,53 µm ± 1.36 dans le groupe de l’ONGC. Dans les deux cas, le diamètre était significativement plus importante dans le groupe CSGB, qui a également démontré significativement plus élevée des fibres nerveuses myélinisées densité et du système nerveux tissu pourcentage dans le centre et le segment distal de l’IAN gauche régénéré. Le rapport / G au centre de l’IAN régénéré de gauche était de 0,75 ± 0,04 dans le groupe de reconstruction et 0,68 ± 0.05 dans le groupe de l’ONGC, lors de la partie distale 0,74 ± 0,04 dans le groupe de reconstruction et 0,69 ± 0,04 dans le groupe de l’ONGC. Ainsi, dans les deux cas, le G-ratio était significativement plus faible dans le groupe CSGB.

L’échantillon des tailles pour la reconstruction seule et reconstruction + groupes CSGB étaient n = 7. Les analyses statistiques pour le diamètre des fibres nerveuses myélinisées et densité, G-ratio et SCV ont été effectuées à l’aide du test de Dunnett. Analyse de l’indice de récupération a été effectuée à l’aide d' d’un étudiant non apparié t-test. Le niveau de signification statistique a été fixé à 5 % (p < 0,05).

Figure 1
Figure 1 : tube acide polyglycolique rempli avec éponge de collagène. Image brute A) du tube. Les dimensions finales de la gaine de nerf ont été 50 µm d’épaisseur, diamètre intérieur de 3 mm et une longueur de 14 mm. B) microscope électronique du tube. Ce chiffre a été précédemment publié par Shionoya et al. 18 et est reproduit avec la permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : nerf alvéolaire inférieur (NIO) a laissé pré- et post-reconstruction. A) image de reconstruction avant de l’IAN gauche après avoir été exposés par l’enlèvement de l’OS. Image de post-reconstruction B) de la gauche IAN reconstitué à l’aide d’un tube de collagène-acide polyglycolique. Ce chiffre a été précédemment publié par Shionoya et al. 18 et est reproduit avec la permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : calculé imagerie par tomographie de l’os du visage après reconstruction du nerf alvéolaire inférieur. L’image montre que la plaque de l’os mandibulaire est dans la bonne position. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : marquage préopératoire de peau sur la région de la poitrine côté gauche avant la chirurgie. Photographie montrant les marques de la peau avant d’exécuter le bloc du ganglion sympathique cervical. La ligne d’incision est de 20 cm de longueur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : vue du bloc du ganglion sympathique cervical de fonctionnement : pré thoracotomie. Image montre les côtes de deuxième et troisième après avoir soulevé le serratus ventralis et scalenus les muscles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : vue du bloc du ganglion sympathique cervical de fonctionnement : après thoracotomie. Image montre le ganglion sympathique cervical gauche après thoracotomie latérale à la deuxième et troisième espace intercostal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : injection pré- et post-éthanol du ganglion sympathique Cervical, à l’aide d’une aiguille de 30 G. A) Image d’éthanol avant injection du ganglion sympathique cervical gauche. B) image d’éthanol post injection du ganglion sympathique cervical gauche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : thermogramme après bloc du ganglion sympathique cervical gauche (CSGB). Le thermogramme fut acquise une semaine après l’ONGC par injection d’éthanol. Notez que la température de la peau du visage sur le côté gauche est plus élevée que sur le côté controlatéral. La barre de couleur indique la température en ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : régénérer le nerf alvéolaire inférieur (IAN). Un) Image de l’IAN dans le groupe reconstruction seule. Image B) de l’IAN dans la reconstruction + groupe ONGC (bloc du ganglion sympathique cervical). Régénération nerveuse (région entre pointes de flèche blanches) est observée chez les deux groupes. Ce chiffre a été précédemment publié par Shionoya et al. 18 et est reproduit avec la permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : analyse du Toluidine bleu et la transmission de la microscopie électronique du nerf alvéolaire inférieur régénéré (IAN). Un - C) semi minces des sections transversales de l’IAN à la reconstruction après 3 mois tachée de toluidine bleues. Les images montrent les segments distaux de l’IAN gauche régénéré dans chaque groupe, comme indiqué. D - F) images de microscopie électronique de Transmission des sections minces semi montrant des fibres nerveuses myélinisées et non myélinisées (noir et blanc des pointes de flèches, respectivement). Barres d’échelle représentent 50 µm (a) - (C) et 5 µm (D) - (F). Contrôle normal : segment central de l’IAN droit dans le groupe reconstruction seule. Ce chiffre a été précédemment publié par Shionoya et al. 18 et est reproduit avec la permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11 : analyse immunohistochimique des segments distaux du nerf alvéolaire inférieur gauche régénéré (IAN). A, B) Sections de l’IAN régénérée à la reconstruction après 3 mois colorées avec un anticorps anti-neurofilaments (NF) pour le groupe reconstruction seule (A) et la reconstruction + le bloc du ganglion sympathique cervical (CSGB ; B) groupes. Les flèches noires indiquent des axones régénérés. C, D) Sections de l’IAN régénérée à la reconstruction après 3 mois colorées avec un anticorps anti-S-100 pour le groupe reconstruction seule (C) et la reconstruction + le groupe CSGB (D). Les flèches blanches indiquent les cellules de Schwann. Barreaux d’échelle, 50 µm. Ce chiffre a été précédemment publié par Shionoya et al. 18 et est reproduit avec la permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Conduction de nerf sensitif (m/s) Indice de récupération
Commande normale 48,5 ± 2,8 -
Groupe de reconstruction uniquement 2.9* ± 36,8 0.22 ± 0,04
Groupe de reconstruction + CSGB 2.4* 42,0 ±# 0,35 ± 0,06#

Tableau 1 : résultats électrophysiologiques dans le nerf alvéolaire inférieur (IAN) à 3 mois après la chirurgie. Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type (n = 7). Comparaisons ont été faites à l’aide d' d’un étudiant non apparié t-test. IAN, nerf alvéolaire inférieur ; CSGB, bloc de ganglion sympathique cervical. *, p < 0,05 en comparaison avec le groupe de contrôle normal ; #, p < 0,05 en comparaison avec le groupe reconstruction seule. Contrôle normal : segment central de l’IAN droit dans le groupe reconstruction seule ; Indice de récupération : rapport entre l’amplitude de crête de la gauche IAN de la reconstruction seule ou reconstruction + groupe CSGB à l’amplitude de crête du contrôle normal. Ce tableau a été précédemment publié par Shionoya et al. 18 et est reproduit avec la permission.

Diamètre des fibres nerveuses myélinisées (μm) Densité des fibres nerveuses myélinisées (nombre/100 μm2) Proportion de tissu nerveux (%) Ratio de G
Commande normale Centre 8,83 ± 3.11 103 ± 8 41,3 ± 3,9 0,62 ± 0,03
Groupe de reconstruction uniquement Centre 4.27 ± 1.5* 126 ± 20 * 2,1 ± 11,6 0.04* ± 0,75
Distale 1.21* ± 3,47 109 ± 17 * 7,3 ± 2.0* 0,74 ± 0.04*
Groupe de reconstruction + CSGB Centre 5.11 ± 1.98*# 140 ± 22 *# 15,9 ± 3,0# 0,68 ± 0,05#
Distale 4.53 ± 1.36*$ 123 ± 15 *$ 12,5 ± 2,1$ 0,69 ± 0.04*$

Tableau 2 : résultats morphologiques dans le nerf alvéolaire inférieur (IAN) à 3 mois après la chirurgie. Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type (n = 7). Des comparaisons ont été faites en utilisant le test de Dunnett. IAN, nerf alvéolaire inférieur ; CSGB, bloc de ganglion sympathique cervical. *, p < 0,05 en comparaison avec le groupe de contrôle normal ; * #, p < 0,05 en comparaison avec le segment central de l’IAN gauche dans le groupe reconstruction seule ; * $,p < 0,05 par rapport à l’extrémité distale de l’IAN gauche dans le groupe reconstruction seule. Contrôle normal : segment central de l’IAN droit dans le groupe reconstruction seule ; G ratio est le rapport entre le diamètre des axones myélinisés au diamètre des fibres myélinisées total. Ce tableau a été précédemment publié par Shionoya et al. 18 et est reproduit avec la permission.

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Discussion

Nous présentons une méthode efficace pour la régénération de IAN en utilisant un tube de nerf biorésorbable en combinaison avec l’ONGC induite par l’éthanol. Pour cette étude nous avons utilisé les chiens, depuis d’autres modèles animaux, comme des souris, des rats et des lapins ont une courte espérance de vie et de la petite taille du corps et par conséquent ne peuvent servir à effectuer les interventions chirurgicales précises. Comme l’IAN se situe dans le canal mandibulaire entouré d’os, une technique chirurgicale est nécessaire pour éviter d’endommager les nerfs et les vaisseaux sanguins lors de l’exécution de reconstruction du. Un Conseil technique important pour la procédure consiste à retirer délicatement la plaque osseuse mandibulaire afin de minimiser le risque de lésions nerveuses et de navire. Fraises traditionnelles et scies micro ne peut pas distinguer les tissus durs et mous,21. En outre, ces outils ont tendance à glisser provoquant endommager les tissus adjacents, en particulier le NIO, par contact accidentel22. Nous avons donc utilisé des outils chirurgicaux piézoélectriques pour l’OS, étapes de traitement. Il s’agit d’une technique de chirurgie osseuse nouvelles et innovatrices qui utilise les ultrasons microvibrations de scalpels spécialisés. Par conséquent, les tissus mous ne sont pas endommagés même lors du contact accidentel avec la coupe conseils23,24. Microvibrations de 60 à 200 µm/s à 24-29 kHz sont optimales pour la découpe des tissus minéralisés élastique tout en épargnant les tissus mous élastique ; ce n’est pas possible aux fréquences supérieures à 50 kHz,25. En outre, rotationnels fraises ou une scie oscillante à nécessitent une force pour contrer la rotation ou vibration de l’instrument. Par rapport à ces instruments, instruments chirurgicaux piézoélectriques n’est pas nécessaire une force supplémentaire et traitement d’os tellement sûre et précise est possible26. Ceci est particulièrement important dans les mains d’un nouvel utilisateur.

Un autre aspect important dans notre méthode est que la plaque osseuse n’était pas fixée à l’aide de plaques métalliques, mais a été placée dans sa position originale dans la mandibule après le placement du tube PGA-C. La raison en était d’éviter le risque d’exposition de la plaque de nécrose muqueuse buccale, qui se pose lors de l’utilisation de plaques métalliques pour la fixation. Toutefois, dans certains cas la plaque osseuse dévié du site original. Par conséquent, il est crucial d’effectuer un balayage de CT de l’os du visage pour confirmer que la plaque de l’os mandibulaire est en bonne position après la chirurgie. Lorsque vous utilisez une plaque métallique pour fixation, suture étanche doit être évitée car elle peut causer la nécrose muqueuse orale en raison des perturbations du débit sanguin.

CSGB est un traitement efficace pour les affections vasculaires périphériques et les syndromes de la douleur de la face et du cou13,14,15. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ses effets thérapeutiques demeurent incertains. Une des raisons de l’absence d’études sur les effets thérapeutiques du CSGB sont la difficulté d’obtenir un effet adrénolytique constant et uniform. Par exemple, la propagation du blocage sympathique après CSGB percutanée n’est pas uniforme27,28. Mullenheim et al. 29 implanté des chiens avec un cathéter de polyéthylène, après thoracotomie, sous le fascia et aux côtés de la chaîne sympathique supérieure et interprété CSGB par injection de lidocaïne via le cathéter. Bien que cette approche peut se propager de blocage sympathique dans les zones ciblées, il comporte des risques d’occlusion du cathéter ou luxation, ainsi que l’infection, en particulier dans les expériences à long terme. Dans notre modèle canin d’ONGC, l’injection directe de 99,5 % d’éthanol produit des augmentations à long terme dans le flux sanguin vers la région ipsilatérale oro-faciale. Dans notre approche, bloc injection a été administrée sous visualisation directe, donc CSGB pourrait être réalisée avec précision. Par conséquent, notre approche réduit le risque de propagation inégale de l’effet adrénolytique et du blocus sympathique. Cela est considéré comme avantageux, en particulier dans les expériences à long terme. Par ailleurs, nous avons utilisé la thermographie pour confirmer le succès de l’ONGC, depuis les hausses de température de la peau du visage sur le côté du bloc à succès CSGB. Dans ce cas, la thermographie est utile, car il est simple et non invasif. Ce qui est important, du nez et pas la température de la peau du visage doivent être mesurées, car il n’est pas affecté par les poils du chien. Notre modèle pourrait contribuer à poursuivre les recherches sur les effets thérapeutiques de l’ONGC. Dans notre étude précédente, la circulation sanguine dans la sphère orofaciale a augmenté de 6 à 11 semaines après ganglionectomy sympathique cervical. Les chercheurs peuvent choisir cette méthode alternative30 si vous le souhaitez.

La limite de cette étude est que CSGB induite par l’éthanol pose le risque d’apparition syndrome (ptosis et myosis)31 de Horner permanente. Autres méthodes, y compris l’ablation par radiofréquence, phénol et sympathique ganglionectomy ont été utilisés pour effectuer des sympathectomies ; Cependant, spécifiquement pour une sympathectomie du ganglion sympathique cervical, seulement l’ablation par radiofréquence a été utilisée dans la pratique clinique32,33,34,35. Par conséquent, l’ablation par radiofréquence et des anesthésiques locaux peut considérer comme une méthode alternative pour CSGB induite par l’éthanol. Futures études seraient nécessaires pour valider comment régénération nerveuse médiée par un tube de nerf biorésorbable peut être améliorée par CSGB avec un anesthésique local ou l’ablation par radiofréquence.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le ministère des organes bioartificiel à Kyoto University Institute for Frontier Science médicale. Nous tenons à remercier le personnel vétérinaire, de l’Institute for Frontier Science médicale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NMP Collagen PS Nippon Meatpackers 301-84621 Atelocollagen extracted from young porcine skin by enzyme treatment
Surgical clippers Roboz Surgical Instrument Company RC-5903
Disposable scalpel (No.15) Kai medical 219ABBZX00073000
VarioSurg3 Nakanishi VS3-LED-HPSC, E1133 Piezoelectric surgery for bone processing
4-0 nylon sutures Ethicon 8881H
8-0 nylon sutures Ethicon 2775G
Isepamicin sulfate Nichi-Iko 620005641
Disposable scalpel (No.10) Kai medical 219ABBZX00073000
30-gauge needle Nipro 1134
1-0 absorbable stitches Ethicon J347H
3-0 Nylon stitches Ethicon 8872H
Neo Thermo NEC Avio TVS-700 Infrared thermography 
Neuropack Σ NIHON KOHDEN MEB-5504 Orthodromic recorder for electrophysiological recording
Toluidine Blue Sigma-Aldrich T3260-5G
Light microscope Keyence BZ-9000
Mouse anti-human neurofilament protein monoclonal antibody DAKO N1591
Polyclonal rabbit anti-S100 antibody DAKO Z0311
Transmission electron microscopy Hitachi High Technologies Hitachi H-7000
Dynamic cell count Keyence BZ-H1C Software for morphological evaluation

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References

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Neurosciences numéro 141 neuroscience in situ l’ingénierie tissulaire conduit artificiel nerf tube de collagène-acide polyglycolique bloc de ganglion sympathique cervical modèle canin
Applications de blocs induite par l’éthanol du Ganglion sympathique Cervical pour promouvoir la régénération Canine nerf alvéolaire inférieur à l’aide d’un nerf artificiel
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Shionoya, Y., Sunada, K., Tsujimoto, G., Shigeno, K., Nakamura, T. Ethanol-Induced Cervical Sympathetic Ganglion Block Applications for Promoting Canine Inferior Alveolar Nerve Regeneration Using an Artificial Nerve. J. Vis. Exp. (141), e58039, doi:10.3791/58039 (2018).

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