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Immunology and Infection

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

doi: 10.3791/58061 Published: July 29, 2018

Summary

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Abstract

Myeloische Vorläuferzellen, die Neutrophilen, Monozyten und dendritischen Zellen (DCs) ergeben können identifiziert und isoliert aus dem Knochenmark von Mäusen für hämatologischen und immunologischen Analysen. Beispielsweise können Studien über die zellulären und molekularen Eigenschaften der myeloischen Vorläuferzellen Bevölkerung enthüllen Mechanismen leukämischen Transformation oder zeigen, wie das Immunsystem reagiert auf Erreger Exposition. Zuvor beschriebenen Flow Cytometry Strategien zur myeloischen Vorläuferzellen Identifikation konnten erhebliche Fortschritte in vielen Bereichen, aber die Fraktionen, die sie identifizieren sind sehr heterogen. Die am häufigsten verwendeten gating Strategien definieren Knochenmark Brüche, die sind für die gewünschte Bevölkerung bereichert, sondern auch zahlreicher "verunreinigen" Vorfahren enthalten. Unsere jüngsten Studien haben viel von dieser Heterogenität gelöst und das Protokoll präsentieren wir hier erlaubt die Isolation der 6 Subpopulationen von Oligopotent und Lineage-committed myeloische Vorläuferzellen von 2 oben beschrieben Knochenmark Brüche. Das Protokoll beschreibt 3 Phasen: (1) Isolierung von Knochenmark Zellen, (2) Bereicherung für hämatopoetische Vorläuferzellen von magnetisch aktivierte Zellsortierung (Linie Abbau von MACS) und (3) Identifikation der myeloischen Vorläuferzellen Teilmengen von Durchflusszytometrie (einschließlich Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren, FACS, falls gewünscht). Dieser Ansatz ermöglicht Stammvater Quantifizierung und für eine Vielzahl von in Vitro und in Vivo Anwendungen isoliert und hat bereits neue Einblick in die Wege und Mechanismen der Neutrophilen, Monocyte und DC Differenzierung geführt.

Introduction

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Monozyten, Neutrophilen und dendritischen Zellen (DCs) sind myeloische Zellen, die aus hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmark, in erster Linie durch einen Prozess namens Myelopoiesis entstehen. Gemeinsamen myeloische Vorläuferzellen (CMPs) haben das Potenzial, myeloische Zellen, als auch Megakaryozyten und Erythrozyten, aber nicht lymphoiden Zellen zu produzieren. Granulozyten-Monocyte Stammväter (GVP), die von CMPs abgeleitet sind, Granulozyten und Monozyten zu produzieren, aber Megakaryocyte und Erythrozyten mögliche verloren haben. Monozyten und klassische und plasmazytoide DCs (cDCs/pDCs) sind auch gedacht, um ergeben sich aus gemeinsamen Vorfahren bekannt als Monocyte-DC Stammväter (MDPs), die entstehen durch CMPs. schrittweise Einschränkung der Linie Potenzial letztlich zu Lineage-committed führt Vorfahren: Granulozyt Stammväter, Monocyte Stammväter und dendritischen Zellen Stammväter (Abbildung 1).

Weissman und Kollegen berichteten, dass CMPs im Lin c-Kit+ Sca-1 (LKS) CD34 gefunden werden+ FcγRlo Bruchteil der Maus Knochenmark, während GVP in der LKS CD34 enthalten sind+ FcγR Hallo Bruchteil1. Jedoch sind diese "CMP" und "GMP" Fraktionen sehr heterogen. Beispielsweise enthält der "GMP" Bruch auch Lineage-committed Granulozyten Stammväter und Monocyte Stammväter1,2. MDPs wurden separat berichtet, dass CX3CR1+ Flt3+ CD115+ Vorfahren, die auch CD34 und FcγR3,4Ausdrücken. MDPs geben Anlass zu cDC/pDC-Herstellung von gemeinsamen DC Stammväter (CDPs), die untere Ebenen des c-Kit (CD117) Ausdrücken gemeldet wurden und sind nicht in den LKS Teil5enthalten.

Zuvor war davon auszugehen, dass Monozyten über einen einzigen Weg (CMP-GMP-MDP-Monocyte) entstehen. Einklang mit diesem Modell, Monocyte begangen Stammväter, produziert von GVP (benannt Monocyte Stammväter, m/s)2 und MDPs (benannt gemeinsame Monocyte Vorfahren, cMoPs)6 scheinen die gleichen Zellen auf der Grundlage der gemeinsamen Oberfläche Marker Ausdruck . Aber wir vor kurzem gezeigt, dass Monozyten unabhängig von GVP und MDPs produziert werden, und konnten durch einzellige RNA Sequenzierung7m/s und cMoPs unterscheiden.

Wir vor kurzem verändert die Weissman "CMP" und "GMP" gating Strategie um 6 Unterfraktionen C57BL/6J Maus Knochenmark mit verschiedenen Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen Teilmengen zu identifizieren. Wir zunächst berichtet, dass für Ly6C und CD115 Färbung die Isolation der Oligopotent GVP und Granulozyten Stammväter (GPs) sowie Monocyte Stammväter (m/s und cMoPs, die wir derzeit nicht in der Lage erlaubt, zu trennen sind) aus dem "GMP" Teil2 (LKS - CD34+ FcγRHallo Tor; ( Abbildung 1). Wir später gezeigt, dass MDPs überwiegend in der "CMP" Fraktion gefunden werden (CD34 LKS + FcγRlo Tor), die enthält auch Flt3+ CD115lo und Flt3 Teilmengen7 (Abbildung 1 ). Die CMP-Flt3+ CD115lo Bruchteil ergibt GVP und MDPs Adoptiv Übergabe. Die CMP-Flt3 Teilmenge enthält Stammväter, die Vermittler zwischen CMP-Flt3+ CD115lo Zellen und GVP zu sein scheinen. Im Gegensatz zu MDPs besitzen die CMP-Flt3+ CD115lo und CMP-Flt3 Fraktionen auch Megakaryocyte und potenzielle Erythrozyten.

Es ist wichtig, Beachten jedoch, dass es derzeit unklar ist, ob die "CMP" Fraktionen Vorfahren enthalten, die sind wirklich Oligopotent (z. B. einzelne Zellen innerhalb der CMP-Flt3+ CD115lo Bruch, die Neutrophilen, besitzen Monocyte, DC Megakaryocyte und potenzielle Erythrozyten), oder alternativ eine Mischung aus Vorfahren mit engeren Linie Potenzial umfassen. Koloniebildenden Assays (Methylcellulose Kulturen) offenbart Zellen mit Granulozyten (Neutrophilen), Erythrozyten, Monocyte und potenzielle Megakaryocyte (GEMM Zellen) in der "CMP" CMP-Flt3+ CD115lo und CMP-Flt3 Fraktionen1 ,7, aber nicht zulassen, dass die Bewertung des DC-Potentials. Im Gegensatz dazu koloniebildenden Assays zeigte die Existenz von Oligopotent GVP (Stammväter mit Neutrophilen und potenzielle Monocyte) im "GMP" Bruchteil1,2, und dies wird unterstützt durch den letzten einzellige transkriptomischen Analyse8. Es ist nicht aktuell, aber bekannt, ob diese Oligopotent GVP auch andere Granulozyten (Eosinophile, Basophils und Mastzellen produzieren).

Basierend auf diesen Studien zeigen wir nun wie 7 Marker (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C und CD115) Oberfläche lässt sich identifizieren und isolieren diese 6 Teilmengen von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen. Das hier beschriebene Protokoll kann angewendet werden, für in-vitro- Kultur Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente bei Mäusen und molekulare Analyse (Bulk- und einzellige RNA-Sequenzierung, Western blotting, usw.).

Das Protokoll besteht aus 3 Phasen: (1) Vorbereitung einer einzelnen Zelle Suspension des Knochenmarks Zellen, (2) Bereicherung für hämatopoetische Vorläuferzellen (magnetisch aktivierte Zellsortierung), und (3) Identifizierung und Isolierung, falls gewünscht, der Stammvater Teilmengen von Flow zytometrie (mit einem Analysator oder einen Sorter je nach Bedarf). Der erste Schritt ist die Isolierung von Knochenmarkzellen aus dem Oberschenkelknochen und Schienbeine euthanasierten Mäuse und ist vergleichbar mit anderen zuvor beschriebenen Protokolle9. Als nächstes wird die Probe für die Stamm- und Vorläuferzellen Zellen mit einem Cocktail von Antikörpern gegen Zelle oberflächenmarker der Erythrozyten, Neutrophilen, Monozyten, Lymphozyten usw. , die differenzierte Zellen zum Abbau bereichert. Dies ist nicht obligatorisch, aber dringend empfohlen, Erkennung der Stammvater Teilmengen zu optimieren und reduzieren die Menge der Stammvater Identifizierung benötigten Antikörper und der Zeitaufwand für Durchflusszytometrie. Die Linie Erschöpfung Protokoll unten beschreibt Magnetic-Activated Zelle Sortieren (MACS) mit einem Maus-Linie Zelle Erschöpfung-Kit (enthält biotinylierte Antikörper gegen CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, und Ter-119, plus Anti-Biotin Microbeads) und eine automatisierte Magnetabscheider. Der letzte Schritt ist die Identifizierung (und sortieren, wenn gewünscht) der Stammvater Teilmengen von Durchflusszytometrie. Die Antikörper-Panel unten beschrieben (siehe auch Tabelle 1) wurde entwickelt, um in einem Durchflusszytometer (Analysator oder Sortierer) mit 4 Laser verwendet werden (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

Figure 1
Abbildung 1: Neutrophilen, Monocyte und DC Stammväter und Differenzierung Wege. Die kürzlich überarbeitete Modell der Myelopoiesis7 ist mit die Weissman Tore für "CMPs" (blau) und "GVP" (grün)1 überlagert dargestellt. Diese Zahl wurde von Yáñez Et Al. 20177geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Protocol

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Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Cedars-Sinai Medical Center genehmigt.

1. Isolation aus Maus Knochenmark und Vorbereitung einer einzelnen Zelle Suspension

  1. Die Maus nach institutionellen Richtlinien einschläfern.
  2. Platzieren Sie die euthanasierten Maus auf dem Rücken und Besprühen Sie sie mit 70 % igem Ethanol (EtOH). Machen Sie einen klein (3-5 mm) Schnitt in jeder Hind Gliedmaßen an den Knöchel mit einer scharfen, Spitzen Schere und hochziehen der Haut in Richtung des Körpers von den Beinen zu entfernen und setzen die Muskeln und Knochen.
  3. Entfernen Sie die Muskeln (Quadrizeps, Beinbeuger, etc.) aus den Knochen, Zuschneiden mit einer Schere, nach der Richtung des Knochens. Achten Sie darauf, nicht die Knochen beschädigt.
  4. Verrücken der Oberschenkelknochen aus den Hüftgelenken und schneiden Sie das Bindegewebe und die Muskulatur, lösen Sie die Beine, wobei Sie darauf achten, nicht in den Knochen geschnitten.
  5. Entfernen Sie die Füße von den Knöcheln aus den Gebeinen disloziert, die Knochen in einem Rohr von sterilen PBS oder Medien zu platzieren und auf Eis in der Gewebekultur Raum zu transportieren.
    Hinweis: Für einige andere Anwendungen (z. B. Makrophagen aus insgesamt Knochenmarkzellen Ableitung) ist es möglich, die Knochen auf Eis für eine Weile zu verlassen, aber für Stammvater Isolierung ist es wichtig, so schnell wie möglich zu vermeiden Downregulation der vorzugehen wichtig oberflächenmarker (vor allem CD115).
  6. Entfernen Sie in eine biologische Kabinett alle übrigen Weichteile aus den Knochen durch Reiben mit Seidenpapier.
    Hinweis: Das Protokoll sollte in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden, wenn eine sterile Probe für Zelle Kultur oder in Vivo Tests nach FACS Sortierung erforderlich ist. Wenn sterile Zellen nicht erforderlich sind, kann der gesamte Prozess auf dem Labortisch durchgeführt werden.
  7. Kurz Tauchen die Knochen in 70 % EtOH zu Ihnen, und dann in sterile PBS zu waschen desinfizieren.
  8. Trennen Sie der Oberschenkelknochen aus den Gebeinen und Fibeln durch Durchtrennung des Knies zu und entsorgen Sie die Fibeln.
  9. Kürzen Sie die Enden aus den Knochen mit einer scharfen Schere.
  10. Ernten Sie Knochenmark mit kalten sterilen PBS wie folgt, bis die Knochen weiß erscheinen:
    1. Jeder Knochen mit einer Pinzette greifen und Nadel 26G mit einer 10 mL Spritze mit kalten sterilen PBS in den knochenschaft an einem Ende verbunden.
    2. Halten Sie den Knochen über eine 50 mL Zentrifugenröhrchen und spülen Sie 2-5 mL PBS durch den Knochen, das Knochenmark zu ernten.
    3. Das Knochenmark aus allen 4 Knochen per Mausklick (2 Oberschenkelknochen und 2 Tibien) zu ernten.
  11. Pipette vorsichtig nach oben und unten mit einer 1-mL-Pipette auf das Knochenmark bilden eine Zellsuspension disaggregieren.
  12. Filtern Sie das Knochenmark Fahrwerk durch ein Stück 30 μm-Nylon-Mesh zu beseitigen Sie Knochen-Stücke und Zell-Aggregate, dadurch erzeugt eine einzelne Zellsuspension.
  13. Zentrifuge die einzigen Zellsuspension bei 280 X g für 5 min und Aufschwemmen der Zelle Pellet in sterilen Färbung Puffer (PBS + 0,5 % FBS + 2 mM EDTA), Verwendung von 5 mL Puffer pro Maus (z. B. 10 mL für Zellen, die aus dem Oberschenkelknochen und Tibien 2 Mäuse gebündelt) Färbung.
  14. 10 μL aliquoten der Probe zu nehmen, mischen Sie es mit 10 μL Trypan blau und Last 10 μL der daraus resultierenden Trypan blau-markierten Probe auf einem Hemocytometer. Zählen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop.
    Hinweis: Wenn die Zellen für die zuverlässige Zählung zu konzentrieren, verdünnen Sie die Probe vor dem Hinzufügen Trypan blau.

(2) Stammvater Bereicherung durch magnetische aktiviert Zelle Sortieren (MACS)

  1. Zentrifugieren Sie die gesamte einzelne Zellsuspension (oder so viele Zellen als sind erforderlich, um den gewünschten Ertrag zu erhalten) 280 X g für 5 min bei 4° C und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 40 μl Puffer (PBS + 0,5 % FBS + 2 mM EDTA) pro 107 Zellen Beflecken.
    Hinweis: Es ist auch möglich, MACS-Puffer von Linie Erschöpfung der Hersteller zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) als Alternative zu den befleckenden Puffer.
  2. Führen Sie die Linie Erschöpfung nach den Anweisungen, die mit der Linie Erschöpfung Kit geliefert. Die folgenden Anweisungen gelten für das Kit in der Tabelle der Materialienzu sehen. Wenn eine andere Kit verwendet wird, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und dann fahren Sie mit Schritt 2.3.
    1. Fügen Sie 10 μL Biotin-Antikörper Cocktail pro 107 Zellen hinzu, mischen Sie, indem Sie pipettieren und 10 min bei 4 ° c inkubieren
    2. Fügen Sie 30 μl Puffer/MACS Färbung Puffer pro 107 Zellen und mischen.
    3. Fügen Sie 20 μl Anti-Biotin Microbeads pro 107 Zellen. Gut mischen und eine weitere 15 min bei 4 ° c inkubieren
      Hinweis: Vortex Microbeads vor Aufnahme in die Zellen um sicherzustellen, dass sie völlig zerstreut sind.
    4. Fügen Sie 1 mL Puffer/MACS-Puffer pro 107 Zellen Beflecken, Zentrifugieren der Zellen bei 280 X g für 5 min und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 μl Färbung Puffer/MACS-Puffer für bis zu 108 Zellen. Für mehr als 108 Zellen das Volumen der Färbung Puffer/MACS-Puffer entsprechend skalieren.
    5. Bereiten Sie die automatisierte Magnetabscheider gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    6. Legen Sie die Röhrchen mit den markierten Zellen in den Separator und wählen Sie das negative Auslese-Programm.
    7. Sammeln Sie die negativen Fraktion, die die Stammvater angereicherte Abstammung-Negative (Lin) Zellen enthält. Entsorgen Sie die positive Fraktion, die magnetisch-markierten Linie-positiven Zellen enthält.
  3. Lin Zellen bei 280 X g für 5 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL Puffer/MACS-Puffer pro Maus (z. B. 4 mL wenn Knochenmark aus 2 Mäuse gebündelt wurde) Färbung.
    Hinweis: Das Pellet sollte nun weiß statt rot, weil die Erythrozyten aufgebraucht haben.
  4. 10 μL aliquoten Lin -Zellen nehmen, mischen Sie es mit 10 μL Trypan blau und Last 10 μL der daraus resultierenden Trypan blau-markierten Probe auf einem Hemocytometer. Zählen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop.
    Hinweis: Wenn die Zellen für die zuverlässige Zählung zu konzentrieren, verdünnen Sie die Probe vor dem Hinzufügen Trypan blau.

(3) myeloischen Vorläuferzellen Identifizierung und Isolierung von Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS)

  1. Label-9 (1,5 oder 2 mL) Mikrozentrifugenröhrchen für: (1) ungefärbten Zellen, 2-8) einzelne Zellen befleckt mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern gegen FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C und CD115 für Auswahl und Farbe Spannungskompensation und 9) Sample-Zellen mit allen 7 Antikörper zum Stammvater Identifikation und Sortieren gefärbt werden.
  2. Verteilen Sie 100.000 Zellen zu jedem kontrollröhrchen (Röhren 1-8), und die verbleibenden Zellen (oder weniger wenn gewünscht) an das Probenröhrchen (Rohr 9).
    Hinweis: Wenn das Probenvolumen größer als 1,5-2 mL ist, kann es sein erforderlich, verteilen Sie die Sample-Zellen in eine 15 mL-Tube, Zentrifugieren sie Aufschwemmen Pellet (Schritt 3.3 unten) und übertragen Sie dann die Zellen zu einem Microcentrifuge Schlauch für die nachfolgenden Färbung Schritte.
  3. Die Zellen bei 1.500 x g für 5 min zentrifugieren und erneut die Kontrolle Rohr Pellets in 100 μl Puffer (PBS + 0,5 % FBS + 2 mM EDTA) und der Probe Tube Pellet in 100 μl Färbung Färbung Puffer pro 5 x 106 Zellen (z. B. 200 μL für 1 x 107 Zellen).
  4. Die FcγR einzelner Fleck und die Probenrohr 2 μg/mL Anti-CD16/CD32-APC-Cy7 hinzufügen. Wirbel sanft zu mischen und 10 min bei 4 ° c inkubieren
    Hinweis: Es ist wichtig, die Sample-Zellen mit dem FcγR (CD16/32) Antikörper vor dem Hinzufügen der anderen Antikörper um Wettbewerb aufgrund unspezifischer Fc-vermittelten Antikörperbindung zu verhindern zu beflecken. Inkubieren Sie die Zellen nicht mit einer FcγR Reagenz zu blockieren.
  5. Die entsprechenden einzelnen Fleck Röhren (1 Antikörper) und das Probenröhrchen (alle 6 Antikörper) die andere Antikörper hinzufügen: 10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3-APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 und 4 μg/mL CD115-PE. Wirbel sanft, und 15 min bei 4 ° c inkubieren
  6. Fügen Sie 900 μL Färbung Puffer um die kontrollröhrchen und Färbung Puffer 1 mL pro 107 Zellen in das Probenröhrchen. Die Zellen bei 1.500 x g für 5 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellet in der Färbung Puffer: 200 μL pro Steuerrohr und 500 μl pro 25 x 106 Zellen in das Probenröhrchen. Übertragen Sie die resuspendierte Zellen auf 5 mL FACS Rohre.
    Hinweis: Wenn das Probenvolumen größer als 1,5-2 mL ist, möglicherweise es notwendig, die Zellen auf eine 15 mL Tube für Zentrifugation zu übertragen.
  7. Bereiten Sie das Durchflusszytometer (Analysator oder Sortierer) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
  8. Führen Sie die ungefärbten und einzelne Kontrollzellen durch das Durchflusszytometer Einrichten der Spannungen und Kompensationen Farbe gefärbt.
  9. Führen Sie die Sample-Zellen, Tor der Stammvater Teilmengen wie unten beschrieben und in Abbildung 2zusammengefasst und auf Wunsch durchführen FACS sortieren, um die relevanten Stammvater Teilmengen zu isolieren.
    Hinweis: Es ist in der Regel notwendig, etwa 200.000 Zellen um mindestens 1.000 Veranstaltungen in jedem Stammvater Tor zu erhalten zu erwerben.
    1. Erstellen Sie einen Dot-Plot aller Zellen, Anzeige von FSC-A (x-Achse) und SSC-A (y-Achse), und Tor zum Ausschließen von Schmutz und abgestorbenen Zellen = > "live" Zellen.
    2. Erstellen Sie einen Dot-Plot von "lebenden" Zellen, Anzeige von FSC-H (x-Achse) und FSC-W (y-Achse), und um Dubletten auszuschließen gate = > Leben/Unterhemd (FSC) Tor.
    3. Erstellen Sie ein Dot Grundstück Leben/Singulett (FSC) Zellen, SSC-H (x-Achse) und SSC-W (y-Achse), anzeigen und Tor um Dubletten auszuschließen = > Leben/Unterhemd (FSC) / Unterhemd (SSC) Tor.
    4. Erstellen Sie einen Dot-Plot von Leben/Unterhemd (FSC) / Unterhemd (SSC) Zellen, Sca-1 (x-Achse) und c-Kit (y-Achse), anzeigen und Tor zur c-Kit+ Sca-1 Zellen auswählen = > LKS Zellen.
    5. Erstellen Sie einen Dot-Plot LKS Zellen, Anzeigen von CD34 (x-Achse) und FcγR (y-Achse) und Tor CD34 auswählen,+ FcγRlo Zellen = > "CMPs" und CD34+ FcγRHallo Zellen = > "GVP".
      Hinweis: Es ist wichtig, die "CMPs" und "GVP" so exakt wie möglich Tor. Es ist hilfreich, eine pseudofarben Dichte Handlung oder ein konturdiagramm für genaue Anspritzung verwenden.
    6. Erstellen einen Dot-Plot von "CMPs", CD115 anzeigen (x-Achse) und Flt3 (y-Achse) und Tor zum auswählen:
      Flt3+ CD115lo Zellen = > CMP-Flt3+ CD115lo Zellen,
      Flt3 CD115lo Zellen = > CMP-Flt3 Zellen,
      Flt3+ CD115Hallo Zellen = > MDPs.
    7. Erstellen einen Dot-Plot "GVP", Anzeige Ly6C (x-Achse) und FcγR (y-Achse) und Tor Ly6C auswählen,Zellen = > "GMP-Ly6C -Zellen" und Ly6C+ Zellen = > "GMP-Ly6C+ -Zellen".
    8. Erstellen einen Dot-Plot "GMP-Ly6C -Zellen", Anzeige CD115 (x-Achse) und Flt3 (y-Achse) und Tor zum auswählen:
      Flt3 CD115lo Zellen = > GVP.
    9. Erstellen einen Dot-Plot "GMP-Ly6C+ Zellen", Anzeige CD115 (x-Achse) und Flt3 (y-Achse) und Tor zum auswählen:
      Flt3 CD115lo Zellen = > GPs,
      Flt3 CD115Hallo Zellen = > m/s + cMoPs.

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Representative Results

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Mit der oben beschriebenen Protokoll, ist es möglich, 100 Millionen Zellen (einschließlich der roten Blutkörperchen oder 50 Millionen kernhaltigen Zellen) von Oberschenkelknochen und Schienbeine (2 Beine) ein C57BL/6J Maus (6-8 Wochen alt, männlich oder weiblich) zu erhalten. 1-2 Millionen Lin Zellen können per Mausklick durch MACS Depletion von Lin+ Zellen isoliert werden.

Jedes der 6 myeloischen Vorläuferzellen Teilmengen stellt ~ 1-4 % des Lin Zellen. Linie Erschöpfung ist am Abbau von differenzierter Zellen effizient und bereichernd für Vorfahren, sondern die Lin -Fraktion enthält einen Großteil der c-Kit -Zellen zusätzlich zu c-Kit+ Vorfahren (Abb. 3A). Vorläuferzellen ergibt nach FACS Sortierung, abhängig von den Sortierer Einstellungen verwendet (z. B. maximale Ausbeute im Vergleich zu optimale Reinheit variieren kann), aber im Allgemeinen es möglich ist, 10.000-40.000 Zellen pro angebrochene (Abb. 3 b) zu erhalten. Post-Art Flow Cytometry Analyse zeigen sollte > 95 % Reinheit der einzelnen Fraktionen (Abbildung 3).

Figure 2
Abbildung 2: Strategie für die Identifizierung der 6 myeloischen Vorläuferzellen Fraktionen Gating. (A) Progressive Anspritzung von der lebenden Zellen des Lin -> Unterhemden (FSC) -> Unterhemden (SSC) -> LKS Zellen-CD34 >+ FcγRlo ("CMP") und CD34+ FcγRHallo ("GMP") Brüche -> 6 myeloische Vorläuferzellen Teilmengen. (B) Zusammenfassung der Oberfläche Marker Ausdruck durch die 6 Stammvater Brüche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Stammvater Ausbeute und Reinheit. (A) repräsentative Durchflusszytometrie Grundstücke zeigen c-Kit und CD11b Ausdruck von Knochenmarkzellen vor und nach der Abstammung Erschöpfung, Bereicherung der Stammväter (c-Kit+ Zellen) demonstrieren. (B) Zelle ergibt für jede Stammvater Fraktion, dargestellt als Mittelwert + Standardabweichung von 30 Experimenten. Knochenmarkzellen von bis zu 20 Mäuse wurden für jedes Experiment zusammengefasst. (C) repräsentative Durchflusszytometrie Grundstücke aus Post-Art Analyse zeigt die Reinheit des FACS-sortiert Stammvater Brüche. Gruppe C wurde von Yáñez Et Al. 20177geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Laser Kanal Filter Spiegel
405 nm A. 670/30 635LP
B. 525/50 505LP
C. c-Kit-Pacific Blue 450/50
488 nm A. (FSC)
B. Ly6C-PerCP-Cy5.5 710/50 690LP
C. CD34-FITC 525/50 505LP
D. SSC 488/10
561 nm A. Sca-1-PE-Cy7 780/40 750LP
B. 710/50 690LP
C. 660/20 640LP
D. 610/20 600LP
E. CD115-PE 582/15
640 nm A. FcϒR-APC-Cy7 780/60 750LP
B. 730/45 690LP
C. Flt3-APC 670/30

Tabelle 1: Antikörper-Panel und Flow Cytometer Konfiguration.

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Discussion

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Die Weissman Anspritzung Strategie für Maus myeloischen Vorläuferzellen Kennung1 wurde der Goldstandard für Immunologen und Hämatologen seit fast 20 Jahren, aber es ist nun offensichtlich, dass die "CMP" und "GMP" Tore sehr heterogen und präziser sind Gating Strategien sind erforderlich. Das Protokoll, das wir hier beschrieben haben ermöglicht die Identifizierung der Oligopotent und Lineage-committed Teilmengen in den Mäusen C57BL/6J für genauere Quantifizierung der spezifischen myeloischen Vorläuferzellen und Zuordnung der Myelopoiesis Bahnen, sowie Untersuchung der Molekulare Mechanismen, die in bestimmten Phasen der myeloischen Differenzierung. Der Stammvater Teilmengen können sortiert werden, falls gewünscht, für Molekulare Analysen in Vitro und in Vivo Beurteilung der Differenzierung etc.

Das Protokoll wurde entwickelt, Jugendliche (6-8 Wochen alt) mit Mäusen C57BL/6J und eignet sich für sowohl weibliche als auch männliche Mäuse. Wir haben nicht die Vorläuferzellen Teilmengen bei älteren Mäusen charakterisiert. Wir erwarten nicht die Marker ändert sich mit zunehmendem Alter, aber die relativen Anteile der Teilmengen können variieren. Wir sind nicht der Stammvater Teilmengen in anderen Mausstämme untersucht.

Die erste Anwendung unserer modifizierten gating Strategie war es, mechanistischen Einblick in die Regulation der myeloischen Zellen Schicksal Wahl um die Transkription Faktor Interferon regulatory Faktor 8 (IRF8)2. IRF8 wurde bereits berichtet, dass durch GVP ausgedrückt werden (Weissman "GMP" Bruchteil) und für Monocyte Differenzierung durch Förderung der Monocyte Genexpression, Neutrophilen Genexpression unterdrücken und Förderung der Neutrophilen Apoptose10erforderlich. Mithilfe unserer modifizierten gating Strategie haben wir bewiesen, dass IRF8 wird nicht durch Oligopotent GVP ausgedrückt, sondern sich durch sowohl GPs und m/s + cMoPs2 drückt. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass IRF8 GP und MP + cMoP überleben und Differenzierung, sondern als Produktion der Lineage-committed Stammväter von Oligopotent GVP regelt. Ebenso wir vor kurzem unsere modifizierte gating Strategie verwendet, um das Modell des Myelopoiesis neu zu definieren, und gezeigt, dass GVP und MDPs funktionell unterschiedliche entzündliche Monozyten über 2 unabhängige Wege7produzieren.

Die Linie Erschöpfung Schritt kann durchgeführt werden, mit einer manuellen Magnetabscheider anstelle einer automatisierten Magnetabscheider und Abstammung Erschöpfung lässt sich auch durch Durchflusszytometrie mit biotinylierte Linie Marker Antikörper Cocktail und ein Fluorophor-konjugierten Anti-Biotin Antikörper, mit gating um die ungefärbten Zellen auszuwählen. Linie schließt am meisten differenzierte Zellen und bereichert für c-Kit+ Vorfahren, minimieren Sie die Zeit und Kosten im Zusammenhang mit den folgenden Schritten (d.h. reduziert Antikörper Bände für Durchflusszytometrie, Analysator/Sortierer Zeit, usw.). Ermittler sollten beziehen sich auf die Hersteller-Datenblatt zu bestimmen, ob die Linie Erschöpfung Schritt arbeitete so effizient wie erwartet für das spezifische Kit verwendet. Jedoch ist es egal, ob Linie Erschöpfung nicht 100 % effizient ist, weil (Lin+) Zellen differenziert ausdrücken nicht c-Kit, jeden differenzierten Zellen nach Abstammung Erschöpfung (wie auch andere c-Kit -Zellen) sind anschließend von Flow Cytometry Anspritzung ausgeschlossen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass GPs und MPs ausdrückliche Ly6C aber, im Gegensatz zu den Ly6C von Monozyten, der Stammvater Ly6C ausgedrückt (vermutlich ein anderes Isoform) ist von der Gr-1-Antikörper oft in Linie Erschöpfung Kits enthalten nicht erkannt und somit GPs und m/s bleiben nach Lineage Erschöpfung2.

Gute Färbung ist wichtig für die oberflächenmarker, aber für FcγR erlauben genaue Anspritzung von der FcγRlo "CMPs" und die FcγRHallo "GVP" besonders kritisch. Optimale Fluorophor Wahl und Antikörper Verdünnung sind essentiell für gute Trennung, und ein FcγR blocking Reagenz (allgemein verwendet vor dem Beflecken für Durchflusszytometrie) muss nicht verwendet werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass CD115 herunterreguliert ist, wenn die Zellen bestehen bei 4° C oder auf Eis über einen längeren Zeitraum, so ist es wichtig, schnell zu arbeiten, um gute Färbung zu erhalten. Es wird empfohlen, Verarbeitung der Zellen innerhalb von 1-2 Stunden, ihre Integrität zu bewahren. Wenn lebende Zellen nicht erforderlich sind, können gefärbte Zellen fixiert werden und innerhalb von 48 Stunden erworben werden.

Wenn die isolierten Fraktionen erhebliche Anzahl von toten Zellen enthalten, ist es möglich, einen Lebensfähigkeit Farbstoff (z. B. Propidium Jodid) um genauer lebenden Zellen Tor gehören, obwohl dies wahrscheinlich eine Veränderung in der Kombination von erfordern würde Fluorochrom-konjugierten Antikörpern. Falls gewünscht, können Zellzahlen, indem zählen Perlen auf ein bekannter Konzentration der Probe für Durchflusszytometrie berechnet werden. Zählung Perlen sind von fluoreszierenden Latex-Kügelchen, die aus den Zellen durch FSC-A und SSC-A oder durch ihre hohen Fluoreszenzintensität unterschieden werden können. Zellzahlen können mithilfe der folgenden Formel berechnet werden:

(Anzahl der Zelle Veranstaltungen / Anzahl der Wulst Ereignisse) X (Anzahl der Perlen hinzugefügt, um Probe / Probenvolumen in μL) = Konzentration der Probe als Zellen/μL

Eine Einschränkung des derzeitigen Protokolls ist, dass es nicht zulässt, dass separate Identifizierung von m/s und cMoPs, die Bewertung von diesen Vorfahren, Untersuchung ihrer Genexpression und funktionalen Eigenschaften, etc. z. B. erschwert eine beobachteten Anstieg der MP + cMoP Zahlen nicht an, ob erweiterte Monocyte-Produktion über den GMP-Weg oder der MDP Weg erfolgt. In laufenden Studien hoffen wir, oberflächenmarker zu identifizieren, die m/s und cMoPs unterscheiden. In der Zwischenzeit könnte Bewertung diese Vorfahren durch einzellige RNA Sequenzierung7 genutzt werden, um die relativen Anteile der m/s und cMoPs Profil.

Einzelne Zelle RNA Sequenzierung Studien zeigen wahrscheinlich auch zusätzliche Heterogenität innerhalb der 6 Stammvater Brüche beschrieben in diesem Protokoll, von denen einige widerspiegeln, dass unterschiedliche Reifung besagt z. B. GPs, die erst vor kurzem Monocyte verloren haben Potenzial im Vergleich zu GPs, die bereit sind, gehen in die nächste Phase der Differenzierung. "GMP" Bruchteil Teilmengen enthalten auch Vorfahren mit dem Potential zu anderen Granulozyten (Eosinophile, Basophils und Mastzellen) zu produzieren, aber wir haben dies nicht untersucht. Wie in der Einleitung erwähnt, ist es auch derzeit unklar ob der CMP-Flt3+ CD115lo, CMP-Flt3 und MDP Brüche wirklich enthalten die vorhergesagten Oligopotent Vorfahre oder alternativ bestehen aus einer Mischung von Vorfahren mit mehr begrenzte Linie potenziellen, sondern einzellige RNA Sequenzierung kann Einblick in diese wichtige Frage.

Ein neuer Ansatz ist jetzt für die Identifizierung von Teilmengen von menschlichen myeloischen Vorläuferzellen erforderlich. Weissman und Kollegen zuvor myeloische Teilmengen (einschließlich "CMPs" und "GVP") im menschlichen Knochenmark und Schnur Blut11definiert, aber sie sind ebenso heterogen. Leider, Übersetzung der Maus gating Strategien zur menschlichen Vorfahren erschwert durch bemerkenswerte Unterschiede in der Oberfläche Marker Ausdruck zwischen Mensch und Maus Vorfahren; z. B. CD34 Ausdruck ist auf Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen in der Maus beschränkt, sondern im weiteren Sinne auf menschlichen Vorfahren einschließlich Hämatopoetischen Stammzellen beobachtet. Einzellige RNA Sequenzierung Studien lassen sollte, aber auch die Identifizierung von Kandidaten Marker, die menschlichen Stammvater Teilmengen zu trennen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Dieses Protokoll wurde entwickelt mit Mittel aus dem Vorstand der Gouverneure Regenerative Medizin Institut am Cedars-Sinai Medical Center (HSG), eine Karriere in der Immunologie Gemeinschaft von der American Association Immunologen (AY und HSG) und ein Scholar Award aus die American Society of Hematology (zu AY). Wir danken den Flow Cytometry Kern am Cedars-Sinai Medical Center für Hilfe mit FACS sortieren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) The Jackson Laboratories Cat#JAX:000664
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec Cat#130-090-858
Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC BD Biosciences Cat#553733
Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 BioLegend Cat#101327
Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 BioLegend Cat#108114
Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue BioLegend Cat#105820
Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 BioLegend Cat#128012
Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE BioLegend Cat#135506
Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC BD Biosciences Cat#560718
CountBright Absolute Counting Beads Thermo Fisher Scientific Cat#C36950
AutoMACS Separator Miltenyi Biotec N/A Use the "deplete" program
BD LSRFortessa BD Biosciences N/A 5 lasers, 15 colors
BD FACS Aria III cell sorter BD Biosciences N/A 5 lasers, 13 colors
FlowJo FlowJo, LLC https://www.flowjo.com For further analysis of the .fcs files

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References

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  2. Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125, (9), 1452-1459 (2015).
  3. Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206, (3), 595-606 (2009).
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  7. Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47, (5), 890-902 (2017).
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Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark
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Yáñez, A., Goodridge, H. S. Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (137), e58061, doi:10.3791/58061 (2018).More

Yáñez, A., Goodridge, H. S. Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (137), e58061, doi:10.3791/58061 (2018).

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