Summary
يصف لنا تحليل يستند إلى الخلية تقرير بشأن فيروس نقص المناعة البشرية-1 الانصهار عبر التعبير عن البروتين الفلورية الخضراء القابلة للكشف المجهري التدفق الخلوي أو الأسفار. ويمكن استخدامه لاختبار مثبطات دخول الفيروسية (على وجه التحديد في الخطوة الانصهار) في نظم خالية من خلية وخلية إلى الإصابة.
Abstract
هذا التحليل يهدف إلى تحديداً تقرير بشأن فيروس نقص المناعة البشرية-1 الانصهار عبر التعبير عن البروتين الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) يمكن كشفها بالفحص المجهري التدفق الخلوي أو الأسفار. فيروس نقص المناعة البشرية-1 مراسل فيروس (فيروس نقص المناعة البشرية-1 هفوة-الجماعات) تم إنشاؤه بواسطة إدراج recombinase لجنة المساواة العرقية في جينوم فيروس نقص المناعة البشرية-1 بين المصفوفة وبروتينات قفيصه من بوليبروتين اسكت. هذه النتائج في عبوة من ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية إلى جزيئات الفيروس، الذي صدر بعد ذلك في خلية مستهدفة خط ثابت معربا عن لجنة المساواة العرقية تنشيط recombinase أحمر نيون بروتين (RFP) إلى كاسيت التبديل بروتينات فلورية خضراء. في الدولة القاعدية، ويعرب هذا الكاسيت عن طلب تقديم العروض فقط. عقب تسليم recombinase لجنة المساواة العرقية إلى الخلية الهدف، طلب تقديم العروض، يحف به مواقع لوكسب، المكوس، أسفر عن تعبير بروتينات فلورية خضراء. هذا التحليل يمكن استخدامها لاختبار أي مثبطات دخول الفيروسية (على وجه التحديد في الخطوة الانصهار) في نظم خالية من خلية وخلية إلى الإصابة، وقد استخدمت لتحديد فئة من الخصوم مستقبلات بورينيرجيك كمثبطات جديدة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 الغشاء الفيروسي الانصهار.
Introduction
ودفعت الحاجة إلى العلاج المضاد للفيروسات الرجعية رواية تطوير شاشات الفائق لمثبطات دخول فيروس نقص المناعة البشرية-1. هو وضع مقايسة مراسل هفوة-الجماعات تحديد مثبطات دخول الفيروسية في الخطوة الانصهار في نظام خلية إلى إصابة بقياس الانصهار الغشاء الفيروسي مع غشاء الخلية المضيفة1على وجه التحديد. تم وضع فحص على الشاشة لمثبطات الرواية التي تصرف على وجه التحديد في المراحل المبكرة من الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 حتى نقطة الانصهار الغشاء الفيروسي. تحدي واحد لقياس عدوى خلية خلية أن العدوى الأولية يحتوي على خلايا المانحين المصابة والخلايا الهدف إينينفيكتيد، ذلك قياس الإصابات الجديدة من الصعب أن تميز من خلايا الإدخال. النظام المثالي ينطوي على علامة مغايرة جينات التي يمكن أن يتسبب قبل الشروع في عدوى الخلية المستهدفة وهي غير موجودة في الخلية المانحة. محتويات فيروسية شعبية خلط المقايسة استناداً إلى انصهار إنزيم بروتين فيروسي، BlaM-Vpr، يمكن أن تكون فعالة، ولكن القيود لارتفاع الإنتاجية، فحص الخلايا2. ويشمل هذا التحليل جين مراسل بيتا-lactamase (BlaM) التي تنصهر فيها فيروس نقص المناعة البشرية-1 Vpr، في فيريونس وتعبئتها، وتسليمها إلى خلايا الهدف عند الانصهار الغشاء الفيروسي. الركيزة CCF2-صباحا تم تحميله إلى السيتوبلازم للخلايا المستهدفة ويخضع لتحول الأسفار عند الانقسام. الركيزة صباحا CCF2 مكلفة ويمكن أن تكون باهظة بالنسبة للشاشات الفائق. لتمييز الخلايا المستهدفة والجهات المانحة، من الضروري أن صبغ-تسمية السكان المستهدفين. وأخيراً، البروتوكول يتطلب العديد من الخطوات الغسيل والحضانة التي يمكن أن تكون مرهقة ومكلفة عند اختبار عدد كبير من المركبات.
وقد وضعت المقايسة هفوة-الجماعات كحل لهذه المسائل، لتطوير الفائق الفرز لمثبطات للانصهار في خلية إلى انتقال. لا يتطلب هذا النظام الركازة تحميلها إلى الخلايا. يمكن أن تستخدم أيضا لدراسات الخلية الحرة المقايسة وقابل للتكيف إلى دراسات أخرى الانصهار الفيروسية باستخدام جزيئات الفيروس فيروس نقص المناعة البشرية-1 هفوة-الجماعات شبه مكتوب. يمكن قياس فيروس نقص المناعة البشرية الحياة الفطرية بوساطة خلية خلية الانصهار فحوصات فيروس الحياة الفطرية الخلية البروتين بوساطة الانصهار، بيد أن هذه لا تستخدم جزيئات الفيروس الفعلية كما يفعل فحص فيروس نقص المناعة البشرية-1 هفوة-الجماعات3،،من45. ويمكن قراءة هذا التحليل مع التدفق الخلوي أو الأسفار مجهرية. قد تم استخدمت بنجاح شاشة المكتبة إدارة الأغذية والعقاقير، فضلا عن مكتبة صغيرة بورينيرجيك مثبطات1،6. غيرها من المحققين قد حددت أيضا مثبطات بورينيرجيك في الانصهار فيروس نقص المناعة البشرية-1 استخدام مقايسة انصهار الفائق تكييف والأمثل أن التقارير عن نقل الفيروس مغلفة بيتا-lactamase إلى7،السيتوبلازم8 .
وقد صمم الفيروس هفوة-الجماعات مع نهج مماثل للفيروس هفوة-إيجفب، وإدراج recombinase لجنة المساواة العرقية بين المصفوفة وقفيصه، الذي كان واقفاً إلى جانب فيروس نقص المناعة البشرية-1 مبطلات مواقع9. يرصد الإنزيم لجنة المساواة العرقية كسلائف إدراجها ضمن بوليبروتين هفوة أن ينضج عندما يتم تنشيط فيروس نقص المناعة البشرية-1 مبطلات داخل جسيمات الفيروس الوليدة. وهكذا، تسليم لجنة المساواة العرقية تعتمد على إيصال محتويات الجسيمات فيروس نقص المناعة البشرية-1 المنشط في حوزتي في هدف خلية عن طريق عملية انصهار غشاء فيروسي. وترد هنا إصدارين من البروتوكول. يستخدم الأول سكان المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1 لتصيب الخلايا الهدف، لدراسة انتقال الفيروس مباشرة من خلية إلى خلية. يستخدم الإصدار الثاني فيروس الخلية الحرة لدراسة التهاب فيروسي خالية من الخلية. والرزن نقل خلية إلى خلية يأخذ 7 أيام كاملة من اليوم الذي يتم إذابة الخلايا، أو 5 أيام إذا كان الفعل إذابة الخلايا وباساجيد. يمكن إجراء فحص الإصابة بالخلية الحرة في 5 أيام إذا كانت الخلايا بحاجة إلى أن يكون مذاب و 3 أيام إذا إذابة الخلايا وباساجيد. كما تعطي تعليمات لإنشاء خط خلية مستهدفة (من الأحمر إلى الأخضر) النمو الحقيقي في نوع الخلايا المطلوب (إذا لم يتم استخدام خط خلية هدف الحقيقي الموجودة مسبقاً) باستخدام بلازميد تم إنشاؤها بواسطة مختبر كليفيرس10. من المستحسن اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة مع الفيروس والخلايا معربا عن الفيروس في هذا التحليل. نقوم بإجراء الجزء المعدية لهذا الفحص في منشأة لزراعة الأنسجة BSL2 +. بعد أن يتم إصلاح الخلايا، يمكن أن تحلل في المرافق القياسية التدفق الخلوي والفحص المجهري.
هنا يصف لنا تطبيق هذا التحليل على الشاشة لرواية المركبات التي تثبط فيروس نقص المناعة البشرية-1 الغشاء الفيروسي الانصهار (الشكل 1). مستقبلات بورينيرجيك من الوسطاء المحترفين التحريضية. لدينا مختبر أظهرت أن مثبطات غير انتقائي لمستقبلات بورينيرجيك تعمل كمثبطات لفيروس نقص المناعة البشرية-1 الغشاء الفيروسي الانصهار6. ونحن التقرير أن الاستفادة من هذا التحليل في إنتاجية عالية يمكن التعرف على رواية مثبطات الانصهار في الغشاء الفيروسي فيروس نقص المناعة البشرية-1. علينا أن نظهر أن المانع الفئة بورينيرجيك مستقبلات يمثل فئة جديدة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 الغشاء الفيروسي الانصهار مثبطات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-جيل خطوط الخلايا المستهدفة
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية؛ في حالة استخدام خط خلية هدف الحقيقي موجود، ابدأ في الخطوة 2.
- كوترانسفيكت لوحة المتلاقية 10 سم 70% من الخلايا 293T11 ] في 10 مل من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)] مع بمسكفلوكسبدسريدلوكسبيجفببورووبري10 و pCL-10A112 (التغليف بلازميد) في باستخدام نسبة 1:1 (مجموع 20 ميكروغرام) المستندة إلى الكالسيوم تعداء13.
- حصاد 10 مل تعداء الفيروسية طافية 48 ساعة بعد بيبيتينج وسائل الإعلام من اللوحة في أنبوب مخروطي 15 مل وسينتريفوجينج الأنبوبة في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية بيليه أي حطام الخلايا.
- إرفاق عامل تصفية 0.45 ميكرومتر حقنه 10 مل. بعد الطرد المركزي، اتخاذ الكامل طافية وتحميل المحاقن. تشغيل العينة من خلال في أنبوب نظيف 15 مل.
- قاسمة المادة طافية الفيروسية التي تمت تصفيتها إلى أحجام مناسبة (عادة 0.5-1 مل مختبرين). وهذه يمكن استخدامها مباشرة في الخطوة التالية أو يمكن المجمدة في-80 درجة مئوية وتخزينها.
- استخدام 50 – 100 ميليلتر من المادة طافية الفيروسية لتصيب خط خلية المختارة في لوحة 96-جيدا. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. إشارة طلب تقديم العروض يجب أن تظهر في أقرب وقت ممكن 24 ساعة تحت مجهر فلورية (40 X التكبير، 532 nm الإثارة، 588 نانومتر الانبعاثات) ولكن قد يستغرق مدة تصل إلى 72 ح.
ملاحظة: في هذه التجارب، جوركات تم استخدام الخلايا، ولكن يمكن استخدام الأنواع الأخرى كذلك. - حدد الخلايا ترانسدوسيد مع بوروميسين بإعداد سلسلة من 10 آبار وإضافة بوروميسين إلى كل منها، تاركاً على الأقل 1 جيدا دون علاج كعنصر تحكم (استخدام مجموعة واسعة من تركيزات من 0.5 ميكروغرام/مل إلى 5 ميكروغرام/مل؛ وهذا قد تختلف حسب نوع الخلية). مراقبة صلاحية خلية (سوف يحدث تحلل الخلية في الخلايا دون المقاومة بوروميسين) على مدى عدة أيام مقارنة بمراقبة غير المعالجة واستخدام تركيز بوروميسين حيث البقاء فقط الخلايا الإعراب عن طلب تقديم العروض.
ملاحظة: تحديد تركيز حيث يتم قتل الخلايا أونترانسفيكتيد بينما transfected الخلايا البقاء على قيد الحياة. - باستخدام أما من خلية واحدة التدفق الخلوي الفرز أو إضعاف الحد (انظر الخطوات 1.8 – 1.10)، تنمو الثقافات المستمدة من الخلايا المفردة1 لتطوير خط خلية الاستنساخ (قد يستغرق هذا عدة أسابيع لتنمو).
- في حالة استخدام أسلوب تمييع، عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتمييع عينة لحوالي 500 مل/الخلايا.
- في صفيحة 96، حسنا، "الماصة؛" 50 ميليلتر لتمييع الخلية إلى 50 ميليلتر لوسائل الإعلام [المتوسطة معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) مع 10% FBS و 2% البنسلين-ستربتوميسين، إذا كان استخدام الخلايا جوركات] والقيام بتخفيف المسلسل 1:1 إلى 11 بئرا يحتوي على 50 ميليلتر من وسائل الإعلام. للحصول على أفضل النتائج، أداء replicates 10 على الأقل.
- رصد نمو الخلية عن طريق الفحص المجهري (40 X) لوحة حاضنة استنبات الأنسجة (37 درجة مئوية، مع 5% CO2) أو 4 أسابيع تقريبا. اختر الثقافات من أدنى تركيز بوروميسين مع النمو (كما ينظر إليها عبر المجهر، 40 س) للثقافات الاستنساخ.
- تجميد في مختبرين سينتريفوجينج 20 مل الثقافة (500,000 خلايا/مل، عد مع هيموسيتوميتير) في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية وريسوسبيندينج أنه في 500 ميليلتر من FBS مع [دمس] 10%. ووضعه في-80 درجة مئوية باستخدام حاوية تجميد الخلايا وثم تخزينها في نيتروجين سائل.
2-انتقال الفيروس خلية إلى خلية
-
إعداد الخلايا الهدف
- ذوبان الجليد واحد 500 ميليلتر قنينة من خلايا مراسل جوركات النمو الحقيقي بوضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية. "الماصة؛" الخلايا من القنينة في 10 مل من ربمي المتوسطة كاملة وثم الطرد المركزي المخلوط في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية. ريسوسبيند بيليه في 20 مل متوسطة ربمي كاملة في قارورة T-75. احتضان قارورة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2).
ملاحظة: يتضمن ربمي المتوسطة كاملة RPMI 1640 10% FBS، 2 مم الجلوتامين L، 100 وحدة/مل البنسلين وستربتوميسين 100 ملغ/مل. - وفي اليوم التالي إضافة 0.5 ميكروغرام/مل من بوروميسين (ميكروليتر 1 من الأسهم 2 مغ/مل كل 8 مل من وسائل الإعلام). ثقافة الخلايا، والحفاظ على كثافة خلايا/مل 200,000 – 800,000 (تحسب عن طريق هيموسيتوميتير).
- في اليوم قبل إعداد المقايسة نقل، تقسيم الخلايا وصولاً إلى 200,000 – 400,000 خلايا/مل في المتوسط ربمي الطازجة التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام/مل من بوروميسين.
- ذوبان الجليد واحد 500 ميليلتر قنينة من خلايا مراسل جوركات النمو الحقيقي بوضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية. "الماصة؛" الخلايا من القنينة في 10 مل من ربمي المتوسطة كاملة وثم الطرد المركزي المخلوط في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية. ريسوسبيند بيليه في 20 مل متوسطة ربمي كاملة في قارورة T-75. احتضان قارورة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2).
-
إعداد الخلايا المانحة
- ذوبان الجليد أونترانسدوسيد الخلايا جوركات والثقافة لهم في قارورة T-75 مع 20 مل ربمي إكمال المتوسطة (كما هو موضح في الخطوة 2، 1)، الحفاظ على كثافة خلايا/مل 200,000 – 800,000.
- الطرد المركزي خلايا 7,500,000 (800 x ز لمدة 5 دقائق) وريسوسبيند لهم في 120 ميليلتر لحل نوكليوفيكشن الخامس مع الملحق (انظر الجدول للمواد). نقل الخلايا إلى ومبومو انهانسر وإضافة 4.5 ميكروغرام من الجماعات هفوة1 الحمض النووي. ترانسفيكت الخلايا (عن طريق نهج المستندة إلى انهانسر، انظر الجدول للمواد) استخدام برنامج مناسب (مثلاً، S-18) وبعد ذلك فورا نقلها إلى 3 مل متوسطة ربمي (مع 10% FBS).
- السماح باسترداد التي تفرخ منها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5% CO2في الخلايا.
- في صباح اليوم التالي، الطرد المركزي الخلايا في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية وريسوسبيند لهم في 3 مل من ربمي المتوسطة كاملة، مما يتيح لهم ح 2 لاسترداد عند 37 درجة مئوية (5% CO2) قبل المتابعة مع إعداد المقايسة.
-
ثقافة المشارك
- عد الخلايا باستخدام حد هيموسيتوميتير ثم تدور أسفل الخلايا 50,000 (800 x ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية) الواحدة وكذلك تكون جزيئي (من خلايا كل من المانحين والهدف). ريسوسبيندينج 1 × 106 خلية/مل في ربمي كاملة بدون بوروميسين.
- في لوحة واحدة، وإضافة 25 ميليلتر من تعليق الخلية المانحة لكل بئر؛ في لوحة أخرى، وإضافة 25 ميليلتر من الخلايا المستهدفة.
- لكل بئر، إضافة 25 ميليلتر اختبار مجمع المخفف في المتوسط ربمي كاملة بتركيز مناسب. احتضان الخلايا المستهدفة والجهات المانحة مع المجمع لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: يختلف التركيز كل المخدرات. إذا كان IC معروفة50، استخدم هذا كنقطة انطلاق، المعايرة أعلاه وأدناه. إذا كان IC50 غير معروف، إعداد مخزون 200 ميكرومتر لتركيز نهائي من 10 ميكرون. - بعد المعالجة المسبقة، بدمج الخلايا المانحة مع الخلايا المستهدفة بيبيتينج محتويات لوح واحد إلى الآخر واحتضان الخلايا ح 40 في حاضنة استنبات الأنسجة في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
-
التدفق الخلوي
- إضافة بارافورمالدهيد (PFA) لكل بئر بتركيز نهائي 2%.
ملاحظة: لحل أسهم 16%، هذا هو ميليلتر 14 الواحد 100 ميليلتر جيدا. - تنبيه: منهاج عمل بيجين مضر للجلد والعيون. ارتداء معطف مختبر، والقفازات، ونظارات واقية، والتعامل مع الحل الأسهم في غطاء سلامة.
- قراءة الخلايا على سيتوميتير تدفق مشري وقنوات فيتك.
ملاحظة: من الممكن أن نرى 5 – 20% الخلايا معربا عن التجارة والنقل فوق الخلفية في الخلايا المصابة مقابل. خلايا غير مصاب. - تصور إشارة التجارة والنقل عبر الأسفار مجهرية (40 X) على القنوات الخاصة بالتجارة والنقل (باستخدام عامل تصفية إثارة من 400 نانومتر وعامل تصفية انبعاثات من 508 nm).
- إضافة بارافورمالدهيد (PFA) لكل بئر بتركيز نهائي 2%.
3-البديل البروتوكول للإصابة بعدوى فيروس الخلية الحرة
-
إعداد الخلايا الهدف
- ذوبان الجليد واحد 500 ميليلتر قنينة من النمو الحقيقي جوركات مراسل الخلايا عن طريق وضع في حمام مائي 37 درجة مئوية. "الماصة؛" الخلايا من القنينة في 10 مل من ربمي المتوسطة كاملة وثم الطرد المركزي المتوسطة كاملة ربمي في 800 x ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية. ريسوسبيند بيليه في 20 مل متوسطة ربمي كاملة في قارورة T-75. احتضان قارورة بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2).
- وفي اليوم التالي إضافة 0.5 ميكروغرام/مل من بوروميسين (ميكروليتر 1 من الأسهم 2 مغ/مل كل 8 مل من وسائل الإعلام). ثقافة الخلايا، والحفاظ على كثافة خلايا/مل 200,000 – 800,000 (تحسب عن طريق هيموسيتوميتير).
- في اليوم قبل إعداد المقايسة نقل، تقسيم الخلايا وصولاً إلى 200,000 – 400,000 خلايا/مل في المتوسط ربمي الطازجة التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام/مل من بوروميسين.
-
إنتاج فيروس الخلية الحرة
- ترانسفيكت لوحة المتلاقية 10 سم 70% من الخلايا 293T11 (في 10 مل دميم مع 10% FBS) مع 5 ميكروغرام من الجماعات هفوة بلازميد1 استخدام المستندة إلى الكالسيوم تعداء13.
ملاحظة: هذا الجدول سوف تنتج 10 مل فيروس، وما يكفي لحوالي اثنين إلى أربعة لوحات 96-جيدا، تبعاً لكفاءة تعداء. - حصاد كامل المادة الفيروسية طافية في ح 48 بيبيتينج وسائل الإعلام من اللوحة في أنبوب مخروطي 15 مل وسينتريفوجينج الأنبوبة في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق كل خلية الحطام بيليه.
- إرفاق عامل تصفية 0.45 ميكرومتر حقنه 10 مل. بعد الطرد المركزي، اتخاذ الكامل طافية وتحميل المحاقن. تشغيل العينة من خلال في أنبوب نظيف 15 مل.
- استخدام الفيروس لتصيب الخلايا الهدف فورا (الخطوة 3.3) أو تجميد وتخزين الفيروس-80 درجة مئوية (ذوبان العينة حسب الحاجة قبل الاستخدام).
- ترانسفيكت لوحة المتلاقية 10 سم 70% من الخلايا 293T11 (في 10 مل دميم مع 10% FBS) مع 5 ميكروغرام من الجماعات هفوة بلازميد1 استخدام المستندة إلى الكالسيوم تعداء13.
-
العدوى
- عد الخلايا الهدف "الحقيقي جوركات" (من الخطوة 3.1.3) باستخدام هيموسيتوميتير وتدور أسفل الخلايا الهدف 50,000 كل بئر في 800 x ز لمدة 5 دقائق، ريسوسبيندينج الخلايا في 1 × 106 خلايا/مل في ربمي إكمال المتوسطة دون بوروميسين.
- في لوحة واحدة، وإضافة 25 ميليلتر من الخلايا الهدف "الحقيقي جوركات" لكل بئر؛ في لوح منفصل، قم بإضافة 25 ميليلتر (2 نانوغرام) الفيروس لكل بئر.
- لكل بئر، إضافة 25 ميليلتر اختبار المركب، تضعف في وسائل الإعلام بتركيز مناسب. احتضان الخلايا والفيروسات مع المجمع لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: تتنوع تركيز اختبار كل المخدرات. إذا كان IC معروفة50، استخدم هذا كنقطة انطلاق، المعايرة أعلاه وأدناه. إذا كان غير معروف، تعد 200 ميكرومتر أسهم متوسطة لتركيز نهائي من 10 ميكرون. - بعد المعالجة، إضافة المحتوى بالكامل (50 ميليلتر) من مزيج الفيروس/مجمع من الآبار على الخلايا المستهدفة واحتضان كل شيء من أجل ح 40 في حاضنة استنبات الأنسجة في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
-
التدفق الخلوي
- إضافة منهاج العمل لكل بئر بتركيز نهائي 2%.
ملاحظة: لحل أسهم 16%، هذا هو ميليلتر 14 الواحد 100 ميليلتر جيدا. - قراءة الخلايا على سيتوميتير تدفق مشري وقنوات فيتك. بروتينات فلورية خضراء إشارة يمكن أيضا تصور عن طريق الفحص المجهري fluorescence في قنوات التجارة والنقل.
ملاحظة: مرة واحدة يمكن أن نتوقع أن نرى 5 – 20% الخلايا معربا عن التجارة والنقل فوق الخلفية في مقابلالخلايا المصابة. الخلايا غير مصاب.
- إضافة منهاج العمل لكل بئر بتركيز نهائي 2%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
معرض RG مصابة "جوركات الخلايا" على مستوى منخفض من خلفية بروتينات فلورية خضراء إشارة (0.3 في المائة) مع إشارة قوية جداً طلب تقديم العروض (الشكل 2A، العمود غير مصاب). العدوى مع الجماعات هفوة يسبب زيادة في التجارة والنقل إشارة (24.9%)، مع وجود المانع الانصهار فيروس نقص المناعة البشرية-1 AMD3100 (20 ميكرومتر) يحول دون تطوير هذه الإشارات، جعلها وصولاً إلى مستويات الخلفية غير مصاب (0.34%). عند المانع حدث بعد الانصهار مثل مثبط النسخ العكسي AZT يستخدم (2 ميكرومتر)، والإشارات لا يتأثر إلى حد كبير (23.5%)، مما يشير إلى أن الإشارات التجارة والنقل التي تنتجها المقايسة الخاصة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 الانصهار. يشير الشكل 2B تثبيط الجرعة تعتمد على الانصهار هفوة-الجماعات مع بادس (100 ميكرومتر)، مثبط بورينيرجيك غير انتقائية.
يشير الرقم 3 إلى مقارنة بين الخلية الحرة الانصهار الغشاء الفيروسي فيروس نقص المناعة البشرية-1 باستخدام مقايسة هفوة-الجماعات (الشكل 3A) وتحليل الاتفاقية BlaM-Vpr (الشكل 3B). استخدمت ايرة فيروسات هفوة-الجماعات و BlaM Vpr سبينوكولاتي – تدور ز ح 2 x طويلة 1,200 بليت العدوى 96-جيدا في بداية العدوى إلى زيادة كفاءتها – الخلايا "جوركات النمو الحقيقي" مع خلايا الجماعات هفوة وجوركات مع الفيروس BlaM Vpr ك ووصف سابقا2. 3 نانوغرام الفيروس، عرضت كلا فحوصات كانت تنصهر فيها إشارة قوية 64.7% (هفوة-الجماعات) و 47.2 في المائة (BlaM-Vpr) من الخلايا. في 0.3 نانوغرام من الفيروس، وكانت الإشارات 1.18% (هفوة-الجماعات) و 2% (BlaM-Vpr). تشير هذه البيانات إلى أن الجماعات هفوة يمكن أن توفر إشارة مماثلة للانصهار الفيروسية للمقايسة BlaM Vpr راسخة في طائفة من تركيزات الفيروسات.
رقم 1: نظرة عامة على مقايسة هفوة-الجماعات- هي المحتضنة الخلايا "جوركات النمو الحقيقي" المشترك مع المانحين جوركات الخلايا transfected مع فيروس نقص المناعة البشرية هفوة-الجماعات. عند الانصهار الغشاء الفيروسي، أصدرت لجنة المساواة العرقية إلى الخلايا المستهدفة، التي يمكن أن تهزم هذا الجين دسريد في مواقع لوكسب للسماح بالتعبير اجفب، أسفر عن الخلايا الاستشعاع الأخضر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الممثل النتائج من خلية خالية وعدوى خلية إلى هفوة-الجماعات- (أ) الخلية الحرة تحول دون اندماج الجماعات هفوة المانع الانصهار AMD3100، بل عدم المانع النسخ العكسي AZT. هذه اللوحات تظهر مصابة RG جوركات الخلايا وخلايا "جوركات النمو الحقيقي" غير المعالجة 48 ساعة بعد الإصابة والخلايا جوركات RG ح 48 بعد الإصابة ولكن تعامل مع AMD3100 أو عقار AZT، كما هو مبين. لوحات العلوي تمثل ميكروجرافس نيون على قناة بروتينات فلورية خضراء، لوحات الأوسط تمثل ميكروجرافس نيون على القناة طلب تقديم العروض، بينما تمثل أفرقة أقل الأسفار تنشيط الخلية فرز البيانات (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لعينات عرض التجارة والنقل الإيجابي من النسبة المئوية الإرشادية للانصهار. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الفريق بإذن من إسبوزيتو et al. 1-تحول دون الانصهار الغشاء الفيروسي (ب) فيروس نقص المناعة البشرية-1 عقب الإصابة بخلية إلى جانب بادس. الخلايا جوركات RG مختلطة مع الخلايا جوركات transfected مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 هفوة-الجماعات، وتم اختبار مثبطات AMD3100 وبادس لقدرتها على كتلة الغشاء الفيروسي الانصهار في 100 ميكرومتر، كما هو مبين في مؤامرات أرز الممثل خلية تنشيط الأسفار. وقد تم تعديل هذا الرقم من شوارتز et al. 6- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: فيروس نقص المناعة البشرية هفوة-الجماعات مراسل إشارة قابل للمقارنة إلى BlaM-Vpr. هذه اللوحات إظهار نتائج تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية للنمو الحقيقي (أ) خلايا سبينوكولاتيد بفيروس هفوة-الجماعات وجوركات (ب) خلايا سبينوكولاتيد مع NL43 BlaM-Vpr، ح 16 بعد إصابة ح 6 في تركيز الفيروس المشار إليه. وقد تم تعديل هذا الفريق بإذن من إسبوزيتو et al. 1- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والرزن هفوة-الجماعات ثبت أن تكون مفيدة جداً لفحص المرشحين المخدرات التي قد تعوق الخطوة الانصهار للنسخ المتماثل الفيروسية. عند إجراء هذا الفحص، تتشابه الخطوات الأكثر أهمية للحصول على إشارة جيدة لفحوصات العدوى الفيروسية أكثر. أن الخطوة الحاسمة الأولى إنتاج التتر عالية من الفيروسات ذات النوعية الجيدة. تتطلب هذه الخطوة أن الخلايا 293T باساجيد كثيرا (على الأقل 1 × كل 48 ساعة) حتى لا تصبح أوفيركونفلوينت وتتجمع معا. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون من المفيد تجريب أساليب مختلفة تعداء، كما يجد بعض الباحثين أن تعداء فوسفات الكالسيوم يعطي نتائج أفضل، بينما آخرون يفضلون الكواشف المستندة إلى المادة الدهنية. وبالمثل، هو الخطوة الحاسمة الأخرى في هذا البروتوكول أن لا تدع الهدف كسا الخلايا ولكن للاحتفاظ بها في مرحلة النمو الأسى الحق قبل الإصابة، كما مرحلة ثابتة يقلل من قدرتها على أن تكون مصابة.
بالمقارنة مع الإنزيم BlaM Vpr راسخة2، يقدم المقايسة هفوة-الجماعات فحص خالية من الركازة مع عدم وجود حاجة إلى تسمية الخلايا الهدف. وهذا يجعلها مناسبة تماما لبعض التطبيقات الفائق1. بالإضافة إلى ذلك، يوفر الفحص علامة دائمة لدخول الفيروسية حتى إذا كانت الخلية يصبح كامنا، تقدم بعض الإمكانات لدراسة العدوى الكامنة. قد تستخدم الدراسات المستقبلية لزمن هذا النظام في الفئران حيث الخلايا النمو الحقيقي التي تحولت إلى اللون الأخضر نتيجة للتعرض هفوة-الجماعات، لكنها ليست منتجة المصابة، يمكن أن تكون معزولة لدراسة السكان خلية مع الفيروسات الكامنة أو الإصابة غير منتجة. وبالإضافة إلى الكمون، قد المقايسة التطبيقات المحتملة الأخرى. قد استخدمت بنجاح لكتابة الزائفة مع غيرها من البروتينات الفيروسية المغلف مثل فيروس إيبولا ومنظمة (بيانات غير منشورة)، فتح إمكانيات هذا الفحص تحديد مثبطات الانصهار لمجموعة متنوعة من الفيروسات بطريقة أكثر أماناً من العمل مع حية فيروس.
واحد القيد المقايسة هفوة-الجماعات المحتملة أن يستغرق يوما إضافيا للإشارة تطوير، بالمقارنة إلى BlaM Vpr. وباﻹضافة إلى ذلك، يعيد الفيروس الجماعات هفوة في حالته الحالية فقط لدورة واحدة، التي تعمل من أجل فحص المخدرات ظروف قد وصف لكننا لن يكون مناسباً للدراسات الطويلة الأجل أو منحنيات النمو. في المستقبل، سيجري الإصدارات الجديدة من المقايسة مع إشارات مراسل مختلفة، مثل لوسيفراس، مما يسمح لمجموعة متنوعة من الأغراض. علاوة على ذلك، سيتم فرز أكبر مجمع مكتبات العائد المرجح رواية مثبطات محددة إلى الخطوة الانصهار للنسخ المتماثل الفيروسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث منح المعاهد الوطنية للصحة/نييد AI112423 والمعاهد الوطنية للصحة/نيجمس GM113885 لبنيامين ك. تشن والمعاهد الوطنية للصحة/نييد K08-AI120806 إلى شوارتز H. تاليا. نود أن نشكر "كلية الطب آيكان" في جبل سيناء عميد التدفق "الخلوي الأساسية".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D5546 | Media for 293 Cells |
| RPMI-1640 | Sigma Aldrich | R0883 | Media for Jurkats |
| Fetal Bovine Serum Albumin | Gibco | 16140-071 | Serum for 293 Cells |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.03 | Serum for Jurkat Cells |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | Penn/Strep used in both media |
| T75 Flasks | Corning | 3073 | Used for Culture of Jurkat Cells |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Corning | 430167 | Used for Culture of 293 Cells |
| 96 Well Plates (tissue culture Treated) | Corning | 3595 | Used for fusion assay |
| Polyjet Transfection Reagent | Signagen | SL100688 | Used to transfect 293 Cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-100ML | Used in wash steps |
| Hyclone Trypsin Protease | GE Healthcare Life sciences | SH30042.01 | For Trypsinization of 293 cells |
| Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | For Nucleofection of Jurkats |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare Life sciences | 17144002 | For Nucleofection of Jurkats |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | For all tissue culture |
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | For all tissue culture and liquid handling steps |
| Millex Syringe Filter (0.45 μm) | Millipore | SLHA033 | For filtration of virus |
| BD Slip Tip Sterile syringes | BD Diagnostics | 309656 | For filtration of virus |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | 2b | for Nucleofection of Jurkats (various models available) |
| BD Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | for flow cytometry analyss of samples | |
| Tissue Culture Hood | Various models | Fortessa 2 | |
| pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE | Addgene | 32702 | Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011). |
| pCL10a1 | Novus Bio | NBP2-29542 | Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996) |
| Gag-iCre | Benjamin Chen Lab | Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016). |
References
- Esposito, A. M., et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology. 490, 6-16 (2016).
- Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes. Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).
- Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay. Cytometry. 47, 100-106 (2002).
- Sakamoto, T., et al. Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene. Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).
- Herschhorn, A., et al. An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors. PLoS One. 6, e26731 (2011).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).
- Marin, M., et al. High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).
- Giroud, C., et al. Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).
- Hubner, W., et al. Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1. Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, 81-83 (2011).
- Pear, W. S., et al. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).
- Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium Phosphate Transfection. Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).
