Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

Summary

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Abstract

Deze bepaling beoogt te specifiek verslag over HIV-1 fusion via de uitdrukking van de groen fluorescente proteïne (GFP) aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Een HIV-1 verslaggever virus (HIV-1 Gag-iCre) wordt gegenereerd door het invoegen van Cre recombinase in het genoom van het HIV-1 tussen de matrix en de Eiwitmantel eiwitten van de Gag-polyprotein. Dit resulteert in een verpakking van Cre recombinase in virusdeeltjes, die vervolgens wordt vrijgegeven in een doelcel lijn stabiel uiting van een Cre recombinase-geactiveerde rode fluorescente proteïne (RFP) op GFP schakelaar cassette. In de basale staat drukt deze cassette RFP alleen. Na de levering van Cre recombinase in de doelcel, de RFP, geflankeerd door loxP sites, accijnzen, resulterend in GFP expressie. Deze test kan worden gebruikt om te testen alle remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen en een klasse te identificeren van de purinergic receptorantagonisten als roman remmers van HIV-1 virale membraan fusie is gebruikt.

Introduction

De behoefte aan nieuwe antiretrovirale therapieën heeft geleid tot de ontwikkeling van high-throughput schermen voor remmers van HIV-1 entry. De bepaling van de verslaggever Gag-iCre is ontwikkeld om het identificeren van remmers van het virale vermelding bij de fusie stap in een cel-naar-cel infectie systeem door het specifiek meten van virale membraan fusion met de host celmembraan¹. Een test werd ontwikkeld aan het scherm voor roman remmers die specifiek in de vroege stadia van HIV-1 infectie tot aan het punt van virale membraan fusie gehandeld. Een uitdaging tot het meten van cel infectie is dat het eerste entmateriaal geïnfecteerde donor cellen en ininfected doelcellen, bevat dus nieuwe infectie meten moeilijk is te onderscheiden van de invoercellen. Het ideale systeem zou leiden tot een heteroloog gen-markering die kan worden opgewekt door de opening van een target cel infectie en is niet aanwezig in de cel van de donor. Een populaire virale inhoud mengen assay gebaseerd op een virale eiwitten-enzym fusion, BlaM-Vpr, kunnen effectief zijn, maar heeft ook beperkingen voor hoge doorvoer, cel-cel screening². Deze bepaling impliceert een beta-lactamase (BlaM) verslaggever gen dat is gesmolten tot HIV-1 Vpr, verpakt in virionen en geleverd in de doelcellen op virale membraan fusion. Het substraat CCF2-AM is geladen in het cytoplasma van doelcellen en ondergaat een verschuiving van de fluorescentie op decollete. De CCF2-AM substraat is duur en onbetaalbaar voor high-throughput schermen kan worden. Om te onderscheiden van donor- en het doeldomein cellen, is het nodig om kleurstof-label de doelpopulaties. Tot slot, het protocol vereist verschillende incubatie en wassen stappen die belastend en duur zijn kan bij het testen van grote aantallen van verbindingen.

De bepaling van de Gag-iCre werd ontwikkeld als een oplossing voor deze problemen, om een high-throughput screening voor remmers van fusie in cel-naar-cel transmissie. Dit systeem vereist geen substraat worden geladen in cellen. De bepaling kan ook worden gebruikt voor cel-vrije studies en is aan te passen aan andere studies van de virale fusie met pseudo-getypte HIV-1 Gag-iCre virusdeeltjes. HIV Env gemedieerde cel fusion testen kunnen meten virus Env eiwit-gemedieerde celfusie, maar dit gebruik geen werkelijke virusdeeltjes evenals de bepaling van de HIV-1 Gag-iCre^3,4,5. Deze bepaling kan worden gelezen met stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het is met succes gebruikt om het scherm van de FDA-bibliotheek, alsmede een kleine bibliotheek met purinergic remmers^1,6. Andere onderzoekers hebben ook vastgesteld purinergic remmers in HIV-1 fusie met behulp van een aangepast en geoptimaliseerd high-throughput fusion-bepaling die de overdracht van bèta-lactamase virus-ingekapseld in het cytoplasma^7,8 rapporteert .

De Gag-iCre virus is ontworpen met een vergelijkbare benadering van de Gag-iGFP virus, invoegen van Cre recombinase tussen matrix en Eiwitmantel, geflankeerd door HIV-1 protease sites⁹. Het enzym Cre is gemaakt als een voorloper binnen de Gag polyprotein die rijpt wanneer HIV-1 protease wordt geactiveerd binnen het ontluikende virus deeltje ingevoegd. De levering van Cre is dus afhankelijk van de levering van de inhoud van een HIV-1 protease-geactiveerde deeltje in een target cel via een virale membraan fusion proces. Twee versies van het protocol vindt u hier. De eerste maakt gebruik van een HIV-1 besmette bevolking te infecteren van doelcellen, om te bestuderen van rechtstreekse toezending van cel naar cel van HIV. De tweede versie maakt gebruik van een cel-vrij virus te bestuderen van een cel-gratis virale infectie. De cel-naar-cel transmissie test duurt 7 dagen om te voltooien vanaf de dag dat de cellen worden ontdooid, of 5 dagen als de cellen zijn al ontdooid en gepasseerd. De bepaling van de cel-vrije infectie kan worden uitgevoerd in 5 dagen als de cellen moeten worden ontdooid en 3 dagen, als de cellen worden ontdooid en gepasseerd. Instructies krijgen ook voor het genereren van een cellijn van RG (rood-met-groen) doel in de gewenste celtype (indien een bestaande RG doel cellenvariëteit niet gebruikt wordt) met behulp van een plasmide gemaakt door de Clevers Lab¹⁰. Het wordt aanbevolen dat passende bioveiligheid voorzorgsmaatregelen worden genomen met het virus en het uiten van virus cellen in deze test. Wij voeren het besmettelijke gedeelte van deze test in een BSL2 + weefselkweek faciliteit. Nadat de cellen zijn verholpen, kunnen zij worden geanalyseerd in standaard stroom cytometry en microscopie faciliteiten.

Hier beschrijven we de toepassing van deze bepaling op scherm over roman die verbindingen remmen van HIV-1 virale membraan fusion (Figuur 1). Purinergic-receptoren zijn pro-inflammatoire mediatoren. Ons laboratorium heeft aangetoond dat de niet-selectieve remmers van purinergic receptoren als remmers van HIV-1 virale membraan fusion^{6 fungeren}. Wij melden dat het gebruik van deze test in hoge-doorvoer roman HIV-1 virale membraan fusion-remmers kan identificeren. We laten zien dat een inhibitor van de omwenteling van de purinergic klasse van receptoren een nieuwe klasse van HIV-1 virale membraan fusion remmers vertegenwoordigt.

Protocol

1. generatie van Target cellijnen

Opmerking: Deze stap is optioneel; Als het gebruikmaakt van een bestaande RG target cellijn, begin dan bij stap 2.

1. Cotransfect van een 70% confluente 10 cm plaat van 293T cellen¹¹ [in 10 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS)] met pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE¹⁰ en pCL-10A1¹² (verpakking plasmide) in een 1:1 verhouding (20 µg totaal) met behulp van calcium gebaseerde transfectie¹³.
2. 10 mL van virale supernatant 48u na transfectie oogsten door de media van de plaat in een conische tube van 15 mL pipetteren en centrifugeren van de buis bij 3000 x g gedurende 5 min bij 23 ° C tot elke cel puin pellet.
3. Een 0,45 µm filter koppelen aan een 10 mL spuit. Na het centrifugeren, nemen de gehele supernatant en laden van de spuit. Het monster doorlopen in een schone 15 mL-buis.
4. Aliquot het gefilterde virale supernatant in passende maten (meestal 0,5 – 1 mL aliquots). Deze kunnen onmiddellijk worden gebruikt in de volgende stap of kunnen worden bevroren bij-80 ° C en opgeslagen.
5. Het gebruik van 50-100 µL van virale supernatans te infecteren een cellijn van keuze in een 96-wells-plaat. Cultuur van de cellen bij 37 ° C met 5% CO₂. Het RFP signaal moet worden weergegeven in zo snel als 24 uur onder een fluorescentie Microscoop (40 X vergroting, 532 nm excitatie, 588 nm emissie) maar kan maximaal 72 uur duren.
   Opmerking: Deze experimenten, Jurkat cellen werden gebruikt, maar andere typen kunnen ook worden gebruikt.
6. Selecteer de getransduceerde cellen met puromycin door de oprichting van een reeks van 10 putten en puromycin van de toe te voegen aan elk, ten minste 1 goed verlaten onbehandeld als een besturingselement (gebruik een aantal uiteenlopende concentraties van 0,5 µg/mL tot 5 µg/mL; dit kan verschillen per celtype). Monitor de levensvatbaarheid van de cellen (lysis van de cel zal voorkomen in cellen zonder puromycin weerstand) in de loop van verscheidene dagen ten opzichte van de onbehandelde en gebruik een concentratie van puromycin waar alleen uiting van RFP cellen overleven.
   Opmerking: Selecteer de concentratie waar untransfected cellen zijn gedood terwijl transfected cellen overleven.
7. Met behulp van eencellige stroom cytometry sorteren of een beperkende verdunning (Zie stappen 1.8-1.10), groeien culturen afgeleid van afzonderlijke cellen¹ tot het ontwikkelen van een klonale cellijn (dit duurt enkele weken om te groeien).
8. Als met de verdunning methode, met behulp van een hemocytometer cellen tellen en het monster, tot ongeveer 500 cellen/mL verdund.
9. In een 96-wells-plaat, Pipetteer 50 µL van de verdunning van de cel in 50 µL van media [Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) medium met 10% FBS en 2% penicilline-streptomycine, als Jurkat cuvetten] en het uitvoeren van 1:1 seriële verdunningen in 11 wells met 50 µL van media. Voor de beste resultaten, verrichten ten minste 10 wordt gerepliceerd.
10. Toezicht op de celgroei via microscopie (40 X) van de plaat in een weefselkweek incubator (37 ° C met 5% CO₂) of ongeveer 4 weken. Culturen kiezen in de laagste concentratie van de puromycin met groei (zoals gezien via Microscoop, 40 X) voor de klonale culturen.
11. Blokkeer de aliquots door centrifugeren van 20 mL van de cultuur (500.000 cellen/mL, gerekend met een hemocytometer) bij 800 x g gedurende 5 min bij 23 ° C en het resuspending in 500 µL van FBS met 10% DMSO. Plaats deze op-80 ° C, met behulp van een cel-bevriezing container en sla het in vloeibare stikstof.

2. aan-cel virusverspreiding

1. Voorbereiding van doelcellen
   1. Dooi één 500 µL Injectieflacon van Jurkat RG verslaggever cellen door deze te plaatsen in een waterbad 37 ° C. Pipetteer van de cellen van de flacon in 10 mL van RPMI compleet medium samen en centrifugeer dan het mengsel bij 800 x g gedurende 5 min bij 23 ° C. Resuspendeer de pellet in 20 mL van de volledige medium RPMI in een maatkolf van T-75. Incubeer de kolf 's nachts (37 ° C en 5% CO₂).
      Opmerking: RPMI compleet medium bevat RPMI 1640 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine.
   2. De volgende dag, voeg toe 0,5 µg/mL puromycin (1 µL van een voorraad van 2 mg/mL / 8 mL van de media). Cultuur van de cellen, behoud van een bevolkingsdichtheid van 200.000 – 800.000 cellen/mL (geteld via hemocytometer).
   3. De dag vóór de oprichting van de overdracht assay, splits de cellen tot 200.000-400.000 cellen/mL in verse RPMI medium met 0,5 µg/mL puromycin.
2. Voorbereiding van donor cellen
   1. Ontdooi untransduced Jurkat cellen en cultuur die hen in een T-75 kolf met 20 mL RPMI voltooien medium (zoals beschreven in stap 2.1), houden een bevolkingsdichtheid van 200.000 – 800.000 cellen/mL.
   2. Centrifugeer 7,500,000 cellen (800 x g gedurende 5 minuten) en resuspendeer hen in 120 µL van nucleofection oplossing V met supplement (Zie Tabel van materialen). De cellen overbrengen in een cuvet electroporation en 4.5 µg voor Gag-iCre¹ DNA toevoegen. Transfect van de cellen (via een electroporation gebaseerde aanpak, zie de Tabel van materialen) met behulp van een geschikt programma (bijvoorbeeldS-18) en vervolgens onmiddellijk overbrengen naar 3 mL RPMI voedingsbodem (met 10% FBS).
   3. De cellen te herstellen door ze 's nachts incuberen bij 37 ° C met 5% CO₂toestaan.
   4. De volgende ochtend, centrifugeer de cellen bij 800 x g gedurende 5 min bij 23 ° C en resuspendeer hen in 3 mL RPMI volledige voedingsbodem, waardoor ze 2 h te herstellen bij 37 ° C (5% CO₂) voordat u verdergaat met de opzet van de test.
3. Co cultuur
   1. Met behulp van een hemocytometer dan een spin omlaag 50.000 cellen (800 x g gedurende 5 minuten bij 23 ° C) cellen tellen per putje te worden bepaald (van zowel de donor als de target cellen). Resuspending 1 x 10⁶ cellen/mL in RPMI compleet zonder puromycin.
   2. In één plaat, 25 µL celsuspensie donor toevoegen aan elk putje; Voeg in een andere plaat, 25 µL van doelcellen.
   3. Voeg aan elk putje, 25 µL van de teststof in de volledige middellange RPMI met de geschikte concentratie verdund. Incubeer de cellen van het donor- en het doeldomein met de compound voor 30 min.
      Opmerking: De concentratie zal verschillen per drug. Als er een bekende IC₅₀, kunt u dit gebruiken als een beginpunt, titrating boven en onder. Als de IC₅₀ onbekend is, voorbereiden op een 200 µM voorraad een eindconcentratie van 10 µM.
   4. Na de voorbehandeling, de donor cellen met de doelcellen combineren door de inhoud van een plaat in de andere pipetteren en Incubeer de cellen gedurende 40 uur in een incubator weefselkweek bij 37 ° C met 5% CO₂.
4. Stroom cytometry
   1. Paraformaldehyde (PFA) toevoegen aan elk putje aan een definitieve concentratie van 2%.
      Opmerking: Voor een stamoplossing van 16%, dit is 14 µL per 100 µL goed.
   2. Let op: PFA is schadelijk voor de blootgestelde huid en ogen. Draag een laboratoriumjas, handschoenen en veiligheidsbril, en verwerken van de stockoplossing in de kap van een veiligheid.
   3. De cellen in een flow-cytometer met mCherry en FITC-kanalen te lezen.
      Opmerking: Het is mogelijk om te zien van 5 tot 20% van de cellen uiten GFP boven achtergrond in de geïnfecteerde cellen vs. niet-geïnfecteerde cellen.
   4. Visualiseren van het GFP-signaal via de fluorescentie microscopie (40 X) op GFP-specifieke kanalen (met een filter van de excitatie van 400 nm en een filter van de emissie van 508 nm).

3. alternatieve Protocol voor een cel-vrij virusinfectie

1. Voorbereiding van doelcellen
   1. Dooi één 500 µL Injectieflacon van Jurkat RG verslaggever cellen door in een waterbad 37 ° C te plaatsen. Pipetteer van de cellen van de flacon in 10 mL van RPMI compleet medium samen en centrifugeer dan het RPMI compleet medium bij 800 x g gedurende 5 min bij 23 ° C. Resuspendeer de pellet in 20 mL van de volledige medium RPMI in een maatkolf van T-75. Incubeer de kolf 's nachts (37 ° C en 5% CO₂).
   2. De volgende dag, voeg toe 0,5 µg/mL puromycin (1 µL van een voorraad van 2 mg/mL / 8 mL van de media). Cultuur van de cellen, behoud van een bevolkingsdichtheid van 200.000 – 800.000 cellen/mL (geteld via hemocytometer).
   3. De dag vóór de oprichting van de overdracht assay, splits de cellen tot 200.000-400.000 cellen/mL in verse RPMI medium met 0,5 µg/mL puromycin.
2. Productie van een cel-vrij virus
   1. Transfect van een 70% confluente 10 cm plaat van 293T cellen¹¹ (in 10 mL DMEM met 10% FBS) met 5 µg Gag-iCre¹ plasmide met behulp van calcium gebaseerde transfectie¹³.
      Opmerking: Deze schaal zal 10 mL van virus, dat genoeg voor ongeveer twee tot vier 96-wells-platen, afhankelijk van de efficiëntie van de transfectie is produceren.
   2. Oogst de hele virale supernatant bij 48u door de media van de plaat in een conische tube van 15 mL pipetteren en centrifugeren van de buis bij 3000 x g gedurende 5 min naar pellet alle cel puin.
   3. Een 0,45 µm filter koppelen aan een 10 mL spuit. Na het centrifugeren, nemen de gehele supernatant en laden van de spuit. Het monster doorlopen in een schone 15 mL-buis.
   4. Gebruik het virus besmetten doelcellen onmiddellijk (stap 3.3) of bevriezen en opslaan van het virus bij-80 ° C (dooi het monster zo nodig vóór gebruik).
3. Infectie
   1. Tellen de doelcellen RG Jurkat (uit stap 3.1.3) met behulp van een hemocytometer en spin down 50.000 doelcellen per putje bij 800 x g gedurende 5 minuten, resuspending van de cellen bij 1 x 10⁶ cellen/mL in RPMI voltooien medium zonder puromycin.
   2. In één plaat, voeg 25 µL van RG Jurkat doelcellen aan elk putje; Voeg in een afzonderlijke plaat, 25 µL (2 ng) virus aan elk putje.
   3. Voeg aan elk putje, 25 µL van de teststof, in de media met de geschikte concentratie verdund. Incubeer de cellen en het virus met de compound voor 30 min.
      Opmerking: De testconcentratie zal verschillen per drug. Als er een bekende IC₅₀, kunt u dit gebruiken als een beginpunt, titrating boven en onder. Indien onbekend, voorbereiden op een 200 µM voorraad medium een eindconcentratie van 10 µM.
   4. Na de voorbehandeling, de volledige inhoud (50 µL) van de virus/samengestelde mix uit de putten toevoegen aan de doelcellen en alles voor 40 h in een incubator weefselkweek bij 37 ° C met 5% CO₂uit te broeden.
4. Stroom cytometry
   1. PFA toevoegen aan elk putje aan een definitieve concentratie van 2%.
      Opmerking: Voor een stamoplossing van 16%, dit is 14 µL per 100 µL goed.
   2. De cellen in een flow-cytometer met mCherry en FITC-kanalen te lezen. Ook kan het GFP-signaal gevisualiseerde via fluorescentie microscopie op GFP kanalen.
      Opmerking: Eenmaal kunnen verwachten om te zien van 5 tot 20% van de cellen uiten GFP boven achtergrond in de geïnfecteerde cellen vs. de niet-geïnfecteerde cellen.

Representative Results

Niet-geïnfecteerde RG Jurkat cellen vertonen een lage niveau van achtergrond GFP signaal (0,3%) met een zeer sterk signaal van de RFP (figuur 2A, niet geïnfecteerde kolom). De infectie met Gag-iCre veroorzaakt een toename van GFP signaal (24,9%), terwijl de aanwezigheid van de HIV-1 fusion remmer AMD3100 (20 µM) remt de ontwikkeling van dit signaal, waardoor het tot niet-geïnfecteerde achtergrondniveaus (0.34%). Wanneer een inhibitor van de omwenteling van een post fusie gebeurtenis zoals de omgekeerde transcriptie remmer AZT (2 µM) wordt gebruikt, wordt niet beïnvloed als het signaal aanzienlijk (23,5%), die aangeeft dat het GFP-signaal geproduceerd door de bepaling is specifiek voor HIV-1 fusion. Figuur 2B geeft een dosis-afhankelijke remming van Gag-iCre fusion met PPADS (100 µM), een niet-selectieve purinergic-remmer.

Figuur 3 geeft een vergelijking van de cel-gratis HIV-1 virale membraan fusie met behulp van de Gag-iCre assay (Figuur 3 bis) en de Conventie BlaM-Vpr assay (figuur 3B). Een titratie van Gag-iCre en BlaM-Vpr virussen gewend was spinoculate — een 2U lang 1.200 x g spin van de infectie van de 96-wells-plaat aan het begin van de infectie te verhogen van de efficiëntie — RG Jurkat cellen met Gag-iCre en Jurkat cellen met het virus BlaM-Vpr als eerder beschreven². Op 3 ng van het virus, beide tests aangeboden een krachtig signaal van 64,7% (Gag-iCre) en 47.2% (BlaM-Vpr) van de cellen waren gesmolten. Op 0,3 ng van het virus, de signalen waren 1.18 (Gag-iCre) en 2% (BlaM-Vpr). Deze gegevens duiden erop dat Gag-iCre een vergelijkbare signaal voor virale fusion aan de gevestigde BlaM-Vpr bepaling in een aantal uiteenlopende concentraties van het virus kan bieden.

Figuur 1: overzicht van Gag-iCre assay. RG Jurkat cellen worden mede geïncubeerd met donor Jurkat cellen transfected met HIV Gag-iCre. Op virale membraan fusion, wordt de Cre gestort op de doelcellen, die het dsRed-gen op de loxP sites expressie van EGFP mogelijk te klieven kunnen, resulterend in de groene fluorescerende cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: vertegenwoordiger voortvloeit uit een cel-vrij en een infectie van cel naar cel Gag-iCre. (A) cel-gratis Gag-iCre fusion wordt geremd door de fusie-remmer AMD3100, maar niet door de omgekeerde transcriptie remmer AZT. Deze panelen tonen van niet geïnfecteerde RG Jurkat cellen, cellen van onbehandelde RG Jurkat 48 h na de infectie en RG Jurkat cellen 48 h na de infectie maar behandeld met AMD3100 of AZT, zoals aangegeven. De bovenste panelen vertegenwoordigen fluorescerende microfoto op het GFP-kanaal, de middelste panelen vertegenwoordigen fluorescerende microfoto op de RFP-kanaal, terwijl de lagere panelen vertegenwoordigen fluorescentie-activated cell sorting (FACS) gegevens van steekproeven tonen GFP positieve van een percentage indicatieve van kernfusie. Schaal bar = 100 µm. Dit paneel is gewijzigd met toestemming van Esposito et al. ¹. (B) de HIV-1 virale membraan fusion na infectie van de cel-naar-cel wordt geremd door PPADS. RG Jurkat cellen werden gemengd met Jurkat cellen transfected met HIV-1 Gag-iCre, en de remmers AMD3100 en PPADS werden getest op hun vermogen om blok virale membraan fusie op 100 µM, zoals op de representatieve fluorescentie-geactiveerde cel sorter percelen. Dit cijfer is gewijzigd van Swartz et al. ⁶. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: HIV Gag-iCre verslaggever signaal is vergelijkbaar met BlaM-Vpr. Deze panelen tonen de resultaten van een analyse van de FACS van (A) RG cellen spinoculated met een Gag-iCre-virus en (B) Jurkat cellen spinoculated met NL43 BlaM-Vpr, 16 h na een infectie van de 6 h op de aangegeven concentratie van het virus. Dit paneel is gewijzigd met toestemming van Esposito et al. ¹. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De bepaling van de Gag-iCre heeft bewezen zeer nuttig voor het screenen van drugkandidaten die de stap van de fusie van virale replicatie kunnen remmen. Bij het uitvoeren van deze test, zijn de belangrijkste stappen om een goed signaal vergelijkbaar met de meeste virale infectie testen. De eerste kritieke stap is het produceren van hoge titers van kwalitatief goede virus. Deze stap is vereist dat de 293T cellen zijn gepasseerd regelmatig (ten minste 1 x elke 48 uur), zodat ze niet overconfluent worden en klomp samen. Bovendien kan het moeite waard experimenteren met verschillende transfectie methoden, zoals sommige onderzoekers dat transfectie van het calciumfosfaat geeft betere resultaten vinden, terwijl anderen lipide gebaseerde reagentia gunst. Ook is de andere kritieke stap in dit protocol het doel cellen overwoekeren niet te laten, maar om ze te houden in de fase van de exponentiële groei vlak voor de infectie, zoals de stationaire fase vermindert hun vermogen om te worden besmet.

Ten opzichte van de gevestigde BlaM-Vpr assay², biedt de bepaling van de Gag-iCre een substraat-gratis test zonder dat hoeft te label doelcellen. Dit maakt het geschikt voor bepaalde toepassingen van de high-throughput¹. Daarnaast biedt de bepaling een permanent marker voor virale invoer, zelfs als de cel latent wordt, het aanbieden van aantal mogelijkheden om te studeren van latente infectie. Toekomstige studies voor latency kunnen gebruik maken van dit systeem in muizen waar RG cellen die zijn al overgestapt op groene als gevolg van blootstelling van de Gag-iCre, maar niet productief besmet, kunnen worden geïsoleerd om te bestuderen van de populaties van de cel met een latent virus of productieve infectie. Naast latentie, de bepaling over andere mogelijke toepassingen. Het is met succes gebruikt voor pseudo-typing met andere virale envelop eiwitten zoals Ebola en VSV (niet-gepubliceerde gegevens), openstelling van de mogelijkheden voor deze bepaling te identificeren fusion remmers voor een verscheidenheid van virussen op een veiliger manier dan het werken met een live virus.

Een mogelijke beperking van de Gag-iCre bepaling is dat het duurt een extra dag voor het signaal te ontwikkelen, in vergelijking met BlaM-Vpr. Daarnaast wordt de Gag-iCre virus in zijn huidige staat alleen voor een single-cyclus, die werkt voor drug screening onder de voorwaarden die wij hebben beschreven, maar zou niet geschikt voor lange termijn studies of groeikrommes gerepliceerd. Nieuwe versies van de test zal in de toekomst worden gemaakt met verschillende verslaggever signalen, zoals luciferase, waardoor een breder scala aan toepassingen. Verder, de screening van grotere samengestelde bibliotheken zal waarschijnlijk opbrengst roman remmers specifiek zijn voor de stap van de fusie van virale replicatie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).