En hög genomströmning Cre-Lox aktiveras Viral membran Fusion analys för att identifiera hämmare av HIV-1 Viral membran Fusion

Summary

Vi beskriver en cell-baserad analys för att rapportera på HIV-1 fusion via uttrycket av grönt fluorescerande protein kan upptäckas av flöde flödescytometri eller fluorescence mikroskopi. Det kan användas för att testa hämmare av viral inträde (särskilt vid fusion steg) i cell-fri och cell-till-cell infektion system.

Abstract

Denna analys är designad att särskilt rapportera om HIV-1 fusion via uttrycket av grönt fluorescerande protein (GFP) upptäckas av flöde flödescytometri eller fluorescence mikroskopi. En HIV-1-reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) genereras genom att infoga Cre recombinase i HIV-1 genomet mellan matris och kapsid proteiner av den Gag polyprotein. Detta resulterar i en förpackning av Cre recombinase in viruspartiklar, som släpps sedan ut i en målcell linje stabilt uttrycker en Cre recombinase-aktiverat röd fluorescerande protein (RFP) till GFP switch kassett. I den basala staten uttrycker denna kassett RFP endast. Efter leverans av Cre recombinase in i målcellen, på RFP, flankerad av loxP platser, punktskatter, vilket resulterar i GFP uttryck. Denna analys kan användas för att testa någon hämmare av viral inträde (särskilt vid fusion steg) i cell-fri och cell-till-cell infektion system och har använts för att identifiera en klass purinergic-receptorantagonister som roman hämmare av HIV-1 viral membran fusion.

Introduction

Behovet av nya antiretrovirala behandlingar har lett utvecklingen av hög genomströmning skärmar för hämmare av HIV-1 inträde. Gag-iCre reporter analysen är utvecklat för att identifiera hämmare av viral inträde vid fusion steg i en cell till cell infektion system genom att specifikt mäta viral membran fusion med värd cellmembranet¹. Ett test utvecklades till skärmen för roman hämmare som agerat särskilt på de tidiga stadierna av HIV-1 infektion upp till punkten av viral membran fusion. En utmaning att mäta cell-cell infektion är att det inledande inokulatet innehåller infekterade givare celler och ininfected målceller, så mäta ny infektion är svårt att diskriminera från indatacellerna. Det idealiska systemet skulle omfatta ett heterologt genen markör som kan induceras av inledandet av ett mål cell infektion och är inte närvarande i cellen givare. En populär viral innehållet blanda assay baserat på en viral protein-enzym fusion, BlaM-Vpr, kan vara effektivt, men har begränsningar för hög genomströmning, cell-cell screening². Denna analys innebär en beta-laktamas (BlaM) reporter gen som är fixerade till HIV-1 Vpr, förpackade i virioner och levereras till målceller vid viral membran fusion. Substratet CCF2-AM är laddad i cytoplasman i målceller och genomgår en fluorescens Skift vid klyvning. CCF2-AM substrat är dyrt och kan vara oöverkomliga för hög genomströmning skärmar. För att särskilja cellerna givare och mål, är det nödvändigt att färgämnet-etikett målgrupperna. Slutligen kräver protokollet flera wash och inkubation steg som kan vara betungande och dyrt när man testar ett stort antal föreningar.

Gag-iCre analysen utvecklades som en lösning på dessa frågor, att utveckla en high-throughput screening för hämmare av fusion i cell-till-cell överföring. Detta system kräver inte substrat som ska läsas in celler. Analysen kan också användas för cellfria studier och är anpassningsbar till andra virala fusion studier använder pseudo maskinskriven HIV-1 Gag-iCre viruspartiklar. HIV Env medierad cell cell fusion analyser kan mäta virus Env protein-medierad Cellfusion, men dessa inte använder riktiga viruspartiklar som HIV-1 Gag-iCre analysen gör^3,4,5. Denna analys kan läsas med flöde flödescytometri eller fluorescence mikroskopi. Det har använts framgångsrikt till skärmen FDA biblioteket samt ett litet bibliotek av purinergic-hämmare^1,6. Andra utredare har också identifierat purinergic-hämmare i HIV-1 fusion med hjälp av en anpassad och optimerad hög genomströmning fusion analysmetod som rapporterar överföring av virus-inkapslat beta-laktamas till cytoplasman^7,8 .

Gag-iCre viruset har utformats med ett liknande förhållningssätt till Gag-iGFP virus, infoga Cre recombinase mellan matris och kapsid, flankerad av HIV-1 proteas platser⁹. Enzymet Cre görs som en föregångare som infogats i det Gag polyprotein som mognar när HIV-1 proteas aktiveras inom den begynnande virus partikeln. Cre leveransen är således beroende av distribution av innehållet i en proteas-aktiverat HIV-1 partikel i en målet cellen via en viral membran fusionsprocessen. Här finns två versioner av protokollet. Först använder en HIV-1 infekterade befolkning för att infektera målceller, för att studera direkt cell till cell överföring av HIV. Den andra versionen använder ett cell-fri virus för att studera en cellfria virusinfektion. Cell till cell överföring analysen tar 7 dagar att slutföra från dagen cellerna är tinade eller 5 dagar om cellerna redan tinats och anpassade. Cellfria infektion analysen kan utföras i 5 dagar om cellerna behöver tinas upp och 3 dagar om cellerna tinats och anpassade. Instruktioner ges också att generera en RG (röd-till-grön) målet cellen fodrar i den önska celltypen (om en redan existerande RG mål cell fodrar inte används) med hjälp av en plasmid skapad av Clevers Lab¹⁰. Det rekommenderas att lämpliga biosäkerhet försiktighetsåtgärder vidtas med virus och virus-uttryckande cellerna i denna analys. Vi bedriver smittsamma portion av denna analys i en BSL2 + vävnadsodling anläggning. När cellerna är fasta, kan de analyseras i standard flöde flödescytometri och mikroskopi.

Här beskriver vi tillämpningen av denna analys på skärmen för romanen ämnen som hämmar HIV-1 viral membran fusion (figur 1). Purinergic receptorer är pro-inflammatoriska mediatorer. Vårt laboratorium har visat att icke-selektiva hämmare av purinergic receptorer fungerar som hämmare av HIV-1 viral membran fusion⁶. Vi rapporterar att utnyttjandet av denna analys i hög genomströmning kan identifiera nya HIV-1 viral membran fusion-hämmare. Vi visar att en hämmare av klassen purinergic av receptorer representerar en ny klass av HIV-1 viral membran fusion-hämmare.

Protocol

1. generering av Target cellinjer

Obs: Detta steg är valfritt. Om du använder en befintlig RG mål cell linje, börja på steg 2.

1. Cotransfect 70% konfluenta 10 cm tallrik 293T celler¹¹ [i 10 mL Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS)] med pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE¹⁰ och pCL-10A1¹² (förpackning plasmid) i en 1:1 ratio (20 µg totalt) använda Kalciumbaserat transfection¹³.
2. Skörda 10 mL av viral supernatant 48 h efter transfection genom pipettering media från plattan i en 15 mL koniska rör och centrifugering röret vid 3 000 x g i 5 min vid 23 ° C till pellet cell skräp.
3. Bifoga ett 0,45 µm filter till en 10 mL-spruta. Efter centrifugering, ta hela supernatanten och ladda sprutan. Kör provet genom i en ren 15 mL tub.
4. Alikvot filtrerade viral supernatanten i lämpliga storlekar (vanligtvis 0,5-1 mL portioner). Dessa kan användas omedelbart i nästa steg eller kan frysas vid-80 ° C och lagras.
5. Använd 50 – 100 µL av viral supernatanten för att infektera en cell fodrar av val i en plattan med 96 brunnar. Odla cellerna vid 37 ° C med 5% CO₂. RFP signalen ska visas i snart 24 h i fluorescens Mikroskop (40 X förstoring, 532 nm excitation, 588 nm utsläpp) men kan ta upp till 72 h.
   Obs: I dessa experiment, Jurkat celler användes, men andra typer kan användas också.
6. Välj sensorik celler med puromycin genom att inrätta en rad 10 brunnar och lägga till puromycin till varje, lämnar minst 1 väl obehandlade som en kontroll (Använd en serie koncentrationer från 0,5 µg/mL till 5 µg/mL; detta kan variera per celltyp). Övervaka cellviabiliteten (cellys kommer att uppstå i celler utan puromycin motstånd) under loppet av flera dagar jämfört med obehandlad kontroll och användning en koncentration av puromycin där endast RFP-uttryckande celler överleva.
   Obs: Välj den koncentration där untransfected celler dödas medan transfekterade celler överleva.
7. Använda antingen encellig flöde flödescytometri sortering eller en begränsande utspädning (se steg 1,8 – 1.10), odla kulturer härstammar från enstaka celler¹ utveckla en klonal cellinje (detta kan ta flera veckor att växa).
8. Om utspädning metoden, räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och späd provet till ca 500 celler/mL.
9. I en plattan med 96 brunnar, pipett 50 μl av cell utspädning till 50 µL av media [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 10% FBS och 2% penicillin-streptomycin, om med Jurkat celler] och utföra seriespädningar 1:1 i 11 brunnar innehållande 50 µL av media. För bästa resultat bör utföra minst 10 replikat.
10. Övervaka celltillväxt via mikroskopi (X 40) plattan i en vävnadskultur inkubator (37 ° C med 5% CO₂) eller cirka 4 veckor. Välj kulturer från den lägsta puromycin koncentrationen med tillväxt (som ses via Mikroskop, 40 X) för de klonala kulturerna.
11. Frysa alikvoter av centrifugering 20 mL av kulturen (500 000 celler/mL, räknade med en hemocytometer) vid 800 x g i 5 min vid 23 ° C och omblandning det i 500 µL av FBS med 10% DMSO. Placera den vid-80 ° C med en cell-frysning behållare och sedan lagra den i flytande kväve.

2. cell-till-cell Virus överföring

1. Beredning av målceller
   1. Tina en 500 µL injektionsflaska med Jurkat RG reporter cellerna genom att placera det i 37 ° C vattenbad. Pipettera cellerna från injektionsflaskan i 10 mL RPMI komplett medium och sedan Centrifugera blandningen vid 800 x g i 5 min vid 23 ° C. Återsuspendera pelleten i 20 mL RPMI komplett medium i en T-75 kolv. Inkubera kolven över natten (37 ° C och 5% CO₂).
      Obs: RPMI komplett medium innehåller RPMI 1640, 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 enheter/mL penicillin och 100 mg/mL streptomycin.
   2. Nästa dag, lägga till 0,5 µg/mL av puromycin (1 µL av ett 2 mg/mL bestånd per 8 mL av media). Odla cellerna, upprätthålla en densitet på 200 000 – 800 000 celler/mL (räknas via hemocytometer).
   3. Dagen innan du konfigurerar överföring analysen, dela upp cellerna ner till 200 000 – 400 000 celler/mL i färska RPMI medium innehållande 0,5 µg/mL puromycin.
2. Beredning av donatorcellerna
   1. Tina untransduced Jurkat celler och kultur dem i en T-75 kolv med 20 mL RPMI slutföra medium (enligt beskrivningen i steg 2.1), att hålla en densitet på 200 000 – 800 000 celler/mL.
   2. Centrifugera 7,500,000 celler (800 x g för 5 min) och återsuspendera dem i 120 µL nucleofection lösning V med tillägg (se Tabell för material). Överför cellerna till en elektroporation kyvetten och tillsätt 4,5 µg Gag-iCre¹ DNA. Transfect cellerna (via ett elektroporation synsätt, se Tabell för material) med ett lämpligt program (t.ex., S-18) och sedan omedelbart överföra dem till 3 mL RPMI medium (med 10% FBS).
   3. Låta cellerna återhämta genom inkubering över natten vid 37 ° C med 5% CO₂.
   4. Nästa morgon, Centrifugera cellerna vid 800 x g i 5 min vid 23 ° C och resuspendera dem 3 ml RPMI komplett medium, ger dem 2 h att återställa vid 37 ° C (5% CO₂) innan du fortsätter med assay set-up.
3. Samtidig kultur
   1. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och sedan snurra ner 50.000 celler (800 x g för 5 min vid 23 ° C) per brunn att analyseras (av både givare och målet celler). Omblandning 1 x 10⁶ cell/mL i RPMI komplett utan puromycin.
   2. I en tallrik, Lägg till 25 µL donator cellsuspension till varje brunn; i en annan tallrik, tillsätt 25 µL av målceller.
   3. I varje brunn, tillsätt 25 µL av testet sammansatta utspädd i RPMI komplett medium i lämplig koncentration. Inkubera givare och målet cellerna med föreningen för 30 min.
      Obs: Koncentrationen kommer att variera per drog. Om det har en känd IC₅₀, använda detta som utgångspunkt, titrering ovan och nedan. Om den IC₅₀ är okänd, förbereda en 200 µM-lager för en slutlig koncentration på 10 µM.
   4. Efter förbehandling, kombinera donatorcellerna med målceller av pipett innehållet i ena plattan till den andra och inkubera cellerna för 40 h i en vävnadskultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO₂.
4. Flödescytometri
   1. Tillsätt PARAFORMALDEHYD (PFA) till varje brunn till en slutlig koncentration på 2%.
      Obs: För 16% stamlösning är 14 µL per 100 µL väl.
   2. FÖRSIKTIGHET: PFA är skadligt för exponerad hud och ögon. Bära en labbrock, handskar och skyddsglasögon, och hantera stamlösning i säkerhet huva.
   3. Läs cellerna på en flödescytometer med mCherry och FITC-kanaler.
      Obs: Det är möjligt att se 5 – 20% av de celler som uttrycker GFP ovan bakgrund i infekterade celler vs. icke-infekterade celler.
   4. Visualisera GFP signalen via fluorescensmikroskopi (X 40) på GFP-specifika kanaler (med en excitationsfilter 400 nm och ett utsläpp filter av 508 nm).

3. alternativa protokoll för en Cell-fri virusinfektion

1. Beredning av målceller
   1. Tina en 500 µL injektionsflaska med Jurkat RG reporter cellerna genom att placera i 37 ° C vattenbad. Pipettera cellerna från injektionsflaskan i 10 mL RPMI komplett medium och sedan Centrifugera RPMI komplett mediet vid 800 x g för 5 min vid 23 ° C. Återsuspendera pelleten i 20 mL RPMI komplett medium i en T-75 kolv. Inkubera kolven över natten (37 ° C och 5% CO₂).
   2. Nästa dag, lägga till 0,5 µg/mL av puromycin (1 µL av ett 2 mg/mL bestånd per 8 mL av media). Odla cellerna, upprätthålla en densitet på 200 000 – 800 000 celler/mL (räknas via hemocytometer).
   3. Dagen innan du konfigurerar överföring analysen, dela upp cellerna ner till 200 000 – 400 000 celler/mL i färska RPMI medium innehållande 0,5 µg/mL puromycin.
2. Produktionen av en cell-gratis virus
   1. Transfect 70% konfluenta 10 cm tallrik 293T celler¹¹ (i 10 mL DMEM med 10% FBS) med 5 µg av Gag-iCre¹ plasmid med Kalciumbaserat transfection¹³.
      Obs: Denna skala kommer att producera 10 mL av viruset, vilket räcker till ungefär två till fyra 96 brunnar plattor, beroende på effektiviteten i transfection.
   2. Skörda hela viral supernatanten vid 48 h genom pipettering media från plattan i en 15 mL koniska rör och centrifugering röret vid 3 000 x g i 5 min till pellet alla cellfragment.
   3. Bifoga ett 0,45 µm filter till en 10 mL-spruta. Efter centrifugering, ta hela supernatanten och ladda sprutan. Kör provet genom i en ren 15 mL tub.
   4. Använda viruset att infektera målceller omedelbart (steg 3.3) eller frysa och lagra viruset vid-80 ° C (Tina provet som behövs före användning).
3. Infektion
   1. Räkna RG Jurkat målcellerna (från steg 3.1.3) använder en hemocytometer och snurra ner 50.000 målceller per brunn vid 800 x g i 5 min, omblandning cellerna på 1 x 10⁶ celler/mL i RPMI slutföra medium utan puromycin.
   2. I en tallrik, tillsätt 25 µL RG Jurkat målceller i varje brunn; i en separat plåt, tillsätt 25 µL (2 ng) virus till varje brunn.
   3. I varje brunn, tillsätt 25 µL av testet förening, utspädd i media i lämplig koncentration. Inkubera cellerna och viruset med föreningen för 30 min.
      Obs: Testkoncentrationen kommer att variera per drog. Om det har en känd IC₅₀, använda detta som utgångspunkt, titrering ovan och nedan. Om okänd, förbereda ett 200 µM lager medium för en slutlig koncentration på 10 µM.
   4. Efter förbehandling, tillsätt hela innehållet (50 µL) av virus/förening mixen från brunnarna till målceller och inkubera allt för 40 h i en vävnadskultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO₂.
4. Flödescytometri
   1. Tillsätt PFA till varje brunn till en slutlig koncentration på 2%.
      Obs: För 16% stamlösning är 14 µL per 100 µL väl.
   2. Läs cellerna på en flödescytometer med mCherry och FITC-kanaler. GFP signalen kan också visualiseras via fluorescensmikroskopi på GFP kanaler.
      Obs: En gång kan förvänta dig att se 5 – 20% av de celler som uttrycker GFP ovan bakgrund i infekterade celler vs. de icke-infekterade cellerna.

Representative Results

Oinfekterade RG Jurkat celler uppvisar en låg nivå av bakgrund GFP signal (0,3%) med en mycket stark RFP-signal (figur 2A, oinfekterade kolumn). Infektion med Gag-iCre orsakar en ökning av GFP signal (24,9%) medan förekomsten av HIV-1 fusion-hämmaren AMD3100 (20 µM) hämmar utvecklingen av denna signal, föra den ner till oinfekterade bakgrundsnivåerna (0,34%). När en hämmare av en efter fusion händelse såsom den omvända transkription-hämmaren AZT (2 µM) används, signalen påverkas inte signifikant (23,5%), vilket indikerar att GFP signalen produceras av analysen är specifik för HIV-1 fusion. Figur 2B tyder på en dosberoende hämning av Gag-iCre fusion med PPADS (100 µM), en icke-selektiv purinergic-hämmare.

Figur 3 visar en jämförelse av cellfria HIV-1 viral membran fusion med hjälp av Gag-iCre analysen (figur 3A) och konventionen BlaM-Vpr analysen (figur 3B). En titrering av Gag-iCre och BlaM-Vpr virus användes till spinoculate — en 2 h lång 1200 x g spin Skyltens 96 brunnar infektion i början av infektionen till öka dess effektivitet — RG Jurkat celler med Gag-iCre och Jurkat celler med BlaM-Vpr virus som tidigare beskrivits². På 3 ng av viruset, båda analyser erbjuds en robust signal 64,7% (Gag-iCre) och 47,2% (BlaM-Vpr) celler fixerades. På 0,3 ng av viruset, signalerna var 1,18% (Gag-iCre) och 2% (BlaM-Vpr). Dessa data tyder på att Gag-iCre kan erbjuda en jämförbar signal för viral fusion till väletablerade BlaM-Vpr analysen på en rad virus koncentrationer.

Figur 1: Gag-iCre assay översikt. RG Jurkat cellerna inkuberas tillsammans med Jurkat donatorcellerna transfekterade med HIV Gag-iCre. Vid viral membran fusion släpps Cre till målcellerna, som kan klyva den dsRed genen på loxP platser tillåter andra uttryck, vilket resulterar i de celler som fluorescerar i grönt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: representativa resultat från en cell-fri och en cell till cell Gag-iCre infektion. (A) Cell-free Gag-iCre fusion hämmas av den fusion-hämmaren AMD3100, men inte av den omvända transkription-hämmaren AZT. Dessa paneler visar oinfekterade RG Jurkat celler, obehandlade RG Jurkat celler 48 h efter infektionen och RG Jurkat celler 48 h efter infektionen men behandlas med AMD3100 eller AZT, som anges. Panelerna övre representerar fluorescerande micrographs på kanalen GFP, mellersta panelerna representerar fluorescerande micrographs på RFP kanal, medan lägre paneler representerar fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) data för prover visar god Jordbrukarsed positivt av en procentandelen vägledande av fusion. Skalstapeln = 100 µm. Denna panel har modifierats med tillstånd från Esposito et al. ¹. (B) för HIV-1 viral membran fusion efter cell till cell infektion hämmas av PPADS. RG Jurkat celler blandades med Jurkat celler transfekterade med HIV-1 Gag-iCre, och hämmare AMD3100 och PPADS testades för sin förmåga att blockera viral membran fusion vid 100 µM, som visas i representativa fluorescens-aktiverad cell sorterare tomter. Denna siffra har ändrats från Swartz m.fl. ⁶. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 3: HIV Gag-iCre reporter signal är jämförbar med BlaM-Vpr. Dessa paneler visar resultaten av en FACS analys av (A) RG celler spinoculated med en Gag-iCre virus och (B) Jurkat celler spinoculated med NL43 BlaM-Vpr, 16 h efter ett 6 h infektion vid den avlästa koncentrationen av viruset. Denna panel har modifierats med tillstånd från Esposito et al. ¹. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Gag-iCre analysen har visat sig vara mycket användbar för screening läkemedelskandidater som kan hämma steget fusion av virusreplikation. När du utför denna analys, liknar viktigaste stegen för att få en bra signal mest viral infektion analyser. Ett första viktigt steg producerar höga titrar av god kvalitet-virus. Detta steg kräver att 293T cellerna är överförda ofta (minst 1 x varje 48 h) så de inte bli overconfluent och klumpar ihop. Dessutom kan det vara värt att experimentera med olika transfection metoder, som vissa forskare tycker att kalcium-fosfat transfection ger bättre resultat, medan andra föredrar lipid-baserade reagenser. Likaså är det andra avgörande steget i detta protokoll att inte låta målet cellerna växa över men att hålla dem i exponentiella tillväxtfasen just innan infektion, eftersom den stationära fasen minskar deras förmåga att vara smittad.

Jämfört med den väletablerade BlaM-Vpr assay², erbjuder Gag-iCre analysen en substrat-gratis test behöver inte etiketten målceller. Detta gör den väl lämpad för vissa hög genomströmning program¹. Dessutom ger analysen en permanent spritpenna för viral posten även om cellen blir latent, erbjuder vissa möjligheter att studera latent infektion. Framtida studier för latens kan utnyttja detta system i möss där RG celler som har bytt till green på grund av Gag-iCre exponering men är inte produktivt infekterade, kan vara isolerad för att studera cellpopulationer med ett latent virus eller nonproductive infektion. Förutom latens har analysen andra potentiella tillämpningar. Det har använts framgångsrikt för pseudo-typing med andra virala kuvert proteiner såsom Ebola och VSV (opublicerade data), öppna upp potentialen för denna analys att identifiera fusion-hämmare för en mängd olika virus på ett säkrare sätt än att arbeta med en levande virus.

En potentiell begränsning av Gag-iCre analysen är att det tar en extra dag för signalen att utveckla, jämfört med BlaM-Vpr. Dessutom, replikerar Gag-iCre viruset i dess nuvarande skick endast för en enda cykel, som arbetar för drogkontroll enligt de villkor som vi har beskrivit men skulle inte vara lämplig för långsiktiga studier eller tillväxtkurvor. I framtiden kommer nya versioner av analysen göras med olika reporter signaler, såsom luciferas, vilket möjliggör ett bredare utbud av användningsområden. Screening av större sammansatta bibliotek kommer dessutom sannolikt avkastning roman hämmare specifika till fusion steg av virusreplikation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).