Immunology and Infection

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

Published: August 14, 2018 doi: 10.3791/58074

Anthony M. Esposito^1,2, Alexandra Y. Soare¹, Foramben Patel¹, Namita Satija¹, Benjamin K. Chen¹, Talia H. Swartz¹

¹Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Immunology Institute, ²Department of Biology, New Jersey City University

Summary

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Abstract

Assay זו נועדה במיוחד הדו ח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. וירוס כתב בלתי HIV-1 (HIV-1 iCre-איסור פרסום) נוצר על-ידי הוספת Cre recombinase לתוך הגנום HIV-1 בין המטריקס את החלבונים capsid של polyprotein איסור הפרסום. זה תוצאות באריזה Cre recombinase לתוך חלקיקי וירוס, אשר לאחר מכן שוחרר לתוך תא היעד קו stably לבטא Cre מופעל recombinase אדום פלואורסצנטי חלבון (RFP) בקלטות מתג ה-GFP. במצב הבזליים, הקלטת הזאת מבטאת רק RFP. בעקבות מסירת Cre recombinase לתוך תא היעד, RFP, ולצדו באתרים loxP, excises, והתוצאה היא ביטוי GFP. Assay זה יכול לשמש כדי לבדוק כל מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא, נעשה שימוש כדי לזהות מחלקה של היריבים קולטן purinergic מעכבי הרומן של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1.

Introduction

הצורך טיפולים חדשניים תרופתי יש בקשה הפיתוח של תריסים מעכבי של HIV-1 ערך תפוקה גבוהה. איסור פרסום-iCre כתב וזמינותו מפותחת לזהות מעכבי כניסה ויראלי בשלב פיוז'ן במערכת-לתא זיהום על ידי מדידת במיוחד ממברנה ויראלי פיוז'ן עם קרום התא המארח¹. Assay פותחה עבור מעכבי הרומן כי פעלו במיוחד בשלבים מוקדמים של זיהום ב- HIV-1 עד לנקודה של קרום ויראלי היתוך מסך. אתגר אחד כדי מדידה תא-תא זיהום הוא inoculum הראשוני מכיל תאים נגועים התורם ותאי המטרה ininfected, ולכן מדידת זיהום חדש קשה להפלות את התאים קלט. המערכת אידיאלית מערבת סמן גנטי heterologous זה יכול להיגרם על ידי אתחול של זיהום תא היעד ואינו נוכח בתא התורם. מסגרת תוכן ויראלי פופולרי ערבוב assay מבוסס על שילוב חלבון נגיפי-אנזים, בלאם-Vpr, יכול להיות יעיל, אבל יש מגבלות עבור תפוקה גבוהה, תא-תא ההקרנה². Assay הזה כרוך גן כתב בטא לקטמאז (בום) כי דבוקה Vpr HIV-1, הארוזים לתוך virions, מועברת לתוך תאי היעד על קרום ויראלי פיוז'ן. המצע CCF2-אם הוא טעון לתוך הציטופלסמה של התאים היעד, עובר פלורסצנטיות משמרת על המחשוף. המצע CCF2-אם הוא יקר וניתן אוסרני עבור מסכי תפוקה גבוהה. על מנת להבחין בין תאי התורם ואת המטרה, יש צורך לצבוע תווית קהלי היעד. לבסוף, הפרוטוקול מחייב מספר שלבים רוחצים את הדגירה אשר יכול להיות מעיק ויקרות בעת בדיקת מספר רב של תרכובות.

וזמינותו איסור פרסום-iCre פותחה כפתרון לסוגיות הללו, לפתח הקרנת עבור מעכבי של פיוז'ן-לתא בשידור של תפוקה גבוהה. מערכת זו אינה דורשת מצע שיש לטעון לתוך התאים. וזמינותו יכול לשמש גם ללימודים ללא תאים, ניתנת להתאמה מחקרים אחרים פיוז'ן ויראלי באמצעות חלקיקי וירוס HIV-1 איסור פרסום-iCre מדומים מוקלד. HIV Env מתווכת תא-cell fusion מבחני יכול למדוד וירוס Env בתיווך חלבון תאי היתוך, אולם אלה אין להשתמש חלקיקי וירוס בפועל כמו וזמינותו HIV-1 איסור פרסום-iCre³^,⁴^,⁵. Assay הזה ניתן לקרוא עם מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה שימש בהצלחה למסך את ספריית ה-FDA, כמו גם ספרייה קטנה של purinergic מעכבי¹^,⁶. חוקרים אחרים זיהו גם מעכבי purinergic ב- HIV-1 היתוך באמצעות וזמינותו של פיוז'ן תפוקה גבוהה המותאמים וממוטב מדווח על העברת וירוס-אנקפסולציה בטא לקטמאז לתוך הציטופלסמה⁷^,⁸ .

הווירוס איסור פרסום-iCre תוכנן עם גישה דומה לנגיף איסור פרסום-iGFP, החדרת Cre recombinase בין מטריקס capsid, ולצדו אתרי פרוטאז HIV-1⁹. האנזים Cre עשוי כמבשר מוכנס בתוך polyprotein איסור פרסום זה מבשיל פרוטאז HIV-1 מופעל בתוך החלקיק וירוס המתהווה. המשלוח Cre הוא, לפיכך, תלויה מסירת התכנים של חלקיק מופעל פרוטאז HIV-1 לתוך היעד התא באמצעות תהליך היתוך ממברנה ויראלי. שתי גרסאות של הפרוטוקול ניתנים כאן. הראשון משתמש אוכלוסיה נגוע ב- HIV-1 כדי להדביק את התאים היעד, ללמוד שידור ישיר-לתא של HIV. הגירסה השנייה משתמש וירוס ללא תא ללמוד זיהום ויראלי נטול תאים. וזמינותו שידור לתא מקבל 7 ימים להשלמת מהיום שהתאים הם הקרת, או 5 ימים אם התאים נמצאים כבר הקרת, passaged. וזמינותו תא ללא זיהום יכול להתבצע ב 5 ימים אם התאים צריכים להיות הקרת ו- 3 ימים, אם התאים נמצאים הקרת, passaged. ההוראות ניתנות גם לייצר קו של תא המטרה (אדום-כדי-ירוק) RG סוג התא הרצוי (אם אינו נמצא בשימוש קו תא היעד שישנו RG) באמצעות פלסמיד נוצר על ידי המעבדה Clevers¹⁰. מומלץ כי אמצעי אבטחה המתאים נלקחים עם הוירוס ולא התאים לבטא וירוס זה וזמינותו. אנו מבצעים של חלק זה וזמינותו במתקן תרביות רקמה BSL2 + זיהומיות. לאחר התאים קבועים, ניתן לנתח הם ב cytometry זרימה רגילה ומתקני מיקרוסקופ.

כאן נתאר את היישום של זה וזמינותו למסך עבור הרומן תרכובות זה לעכב פיוז'ן ממברנה נגיפי HIV-1 (איור 1). קולטנים Purinergic הם מתווכים פרו-דלקתיים. המעבדה שלנו הוכיחה כי מעכבי לא בררניים של קולטני purinergic לפעול כמו מעכבי של פיוז'ן ממברנה נגיפי HIV-1⁶. . מדווחים כי הניצול של זה וזמינותו של תפוקה גבוהה יכול לזהות הרומן מעכבי פיוז'ן של קרום נגיפי HIV-1. נדגים כי מעכב של המחלקה purinergic של קולטני מייצג מחלקה הרומן של מעכבי פיוז'ן ממברנה נגיפי HIV-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. דור של שורות תאים היעד

הערה: שלב זה הוא אופציונלי; אם באמצעות קו תא היעד הקיים RG, להתחיל בשלב 2.

Cotransfect צלחת confluent 10 ס מ 70% של 293T תאים¹¹ [10 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS)] עם pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE¹⁰ ו- pCL-10A1¹² (אריזה פלסמיד) ב יחס 1:1 (סה כ 20 µg) באמצעות תקנים מבוססי סידן¹³.
הקציר 10 מ"ל של תרביות תאים פוסט ויראלי h 48 supernatant pipetting התקשורת מהצלחת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, צריך שתוציאו את הצינור ב x 3000 g למשך 5 דקות ב 23 ° C כדי הצניפה כל שאריות תאים.
לצרף מסנן מיקרומטר 0.45 מזרק 10 מ"ל. לאחר צנטריפוגה, לקחת את כל supernatant, לטעון את המזרק. תריצי את הדגימה דרך לתוך צינור נקי 15 מ"ל.
Aliquot תגובת שיקוע ויראלי שסוננו לתוך בגדלים המתאימים (בדרך כלל, 0.5-1 מ ל aliquots). אלה יכולים לשמש מיד בשלב הבא או יכול להיות קפוא ב-80 מעלות צלזיוס, מאוחסנים.
השתמש 50 – 100 µL של תגובת שיקוע ויראלית כדי להדביק את קו תא לפי בחירה, צלחת 96-ובכן. התרבות התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂. האות RFP אמור להופיע ברגע 24 שעות תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (40 X הגדלה, 532 ננומטר עירור, 588 פליטה ננומטר) אך עשויה להימשך עד 72 שעות.
הערה: בניסויים אלה, תאים Jurkat שימשו, אך סוגים אחרים עשוי לשמש גם כן.
בחר תאים transduced עם puromycin על-ידי הגדרת סדרה של 10 בארות, הוספת puromycin לכל אחד, משאיר לפחות 1 טוב לא מטופל כפקד (שימוש מגוון של ריכוזים של 0.5 µg/mL עד 5 µg/mL; מאי להשתנות לפי סוג התא). הצג הכדאיות תא (פירוק התא תתרחש בתאים ללא התנגדות puromycin) במשך מספר ימים לעומת שליטה שאינו מטופל ולהשתמש ריכוז של puromycin שבו תאים RFP-לבטא רק לשרוד.
הערה: בחר את הריכוז איפה untransfected תאים נהרגים בעוד תאים transfected לשרוד.
באמצעות מיון cytometry זרימה בתא יחיד או לדילול המגביל (ראה שלבים 1.8-1.10), לגדול תרבויות שמקורם תאים בודדים¹ לפתח קו תא המשובטים (הדבר עלול להימשך מספר שבועות לגדול).
אם שימוש בשיטת דילול, לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולא לדלל את הדגימה עד כ 500 תאים/מ"ל.
בצלחת 96-ובכן, פיפטה µL 50 של דילול תאים לתוך 50 µL מדיה [מכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) בינוני עם 10% FBS ו- 2% פניצילין-סטרפטומיצין, אם באמצעות תאים Jurkat] ולבצע דילולים טורי 1:1 לתוך 11 בארות המכיל 50 µL של התקשורת. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לבצע לפחות 10 משכפל.
נטר את צמיחת תאים באמצעות מיקרוסקופ (40 X) של הצלחת של תרביות רקמה חממה (37 ° C עם 5% CO₂) או כ- 4 שבועות. בחר ' תרבויות הריכוז הנמוך ביותר puromycin עם צמיחה (כמו לראות דרך מיקרוסקופ, 40 X) עבור התרבויות המשובטים.
להקפיא את aliquots צריך שתוציאו 20 מ"ל של התרבות (500,000 תאים למ"ל, החשבת של hemocytometer) ב x 800 גרם במשך 5 דקות ב 23 ° C, resuspending אותו ב- µL 500 של FBS עם דימתיל סולפוקסיד 10%. למקם אותו ב-80 מעלות צלזיוס באמצעות מיכל קירור תא ולאחר מכן אחסן אותו בחנקן נוזלי.

2.--לתא וירוס שידור

הכנת התאים היעד
1. הפשרה אחת 500 µL בקבוקון Jurkat RG תאים כתב על-ידי הצבתו לתוך אמבט מים 37 º C. Pipette את התאים המבחנה לתוך 10 מ"ל של מדיום מלאה RPMI, ואז centrifuge את התערובת ב x 800 גרם במשך 5 דקות ב 23 ° C. Resuspend בגדר ב 20 מיליליטר במדיום בקבוקון T-75 מלאה RPMI. דגירה הבקבוק בן לילה (37 ° C ו- 5% CO₂).
  הערה: בינוני מלא RPMI מכיל RPMI 1640, 10% FBS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין יחידות/mL 100 ו- 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין.
2. למחרת, להוסיף 0.5 µg/mL של puromycin (1 µL של מניה 2 מ"ג/מ"ל לכל 8 מ של מדיה). התרבות התאים, שמירה על צפיפות של 200,000 – 800,000 תאים למ"ל (שנספרת via hemocytometer).
3. היום לפני הגדרת העברה וזמינותו, לפצל את התאים עד 200,000 – 400,000 תאים למ"ל טרי בינוני RPMI המכילה 0.5 µg/mL של puromycin.
הכנה של תאי התורם
1. הפשרת untransduced תאים Jurkat ותרבות להשלים אותם בבקבוקון T-75 עם 20 מ של RPMI בינוני (כפי שמתואר בשלב 2.1), שמירה על צפיפות של 200,000 – 800,000 תאים למ"ל.
2. צנטריפוגה 7,500,000 תאים (800 x g למשך 5 דקות), resuspend אותם ב- 120 µL של פתרון nucleofection V עם תוספת (ראה טבלה של חומרים). להעביר את התאים cuvette אלקטרופורציה ולהוסיף µg 4.5 של איסור פרסום-iCre¹ DNA. Transfect התאים (דרך גישה מבוססת-אלקטרופורציה, ראה את הטבלה של חומרים) באמצעות התוכנית המתאימה (לדוגמה, S-18) ולאחר מכן להעביר אותם מיד עד 3 מ"ל של מדיום RPMI (עם 10% FBS).
3. לאפשר את התאים כדי לשחזר על-ידי המקננת אותם בן לילה ב 37 ° C עם 5% CO₂.
4. למחרת בבוקר, centrifuge את התאים ב x 800 גרם במשך 5 דקות ב 23 ° C, resuspend אותם ב- 3 מ"ל של מדיום מלאה RPMI, ומאפשר להם 2 h להתאושש ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO₂) לפני שתמשיך הסידור וזמינותו.
תרבות משותפת
1. לספור את התאים באמצעות שכר hemocytometer אזי ספין למטה 50,000 תאים (800 x g למשך 5 דקות ב 23 ° C) לכל טוב כדי להיות לבדיקה (תאי התורם והן היעד). Resuspending עונה 1 פרק 10⁶ תאים למ"ל בשנת RPMI שלם בלי puromycin.
2. בצלחת אחת, להוסיף 25 µL של השעיה תא תורם כל טוב; בצלחת אחרת, להוסיף 25 µL של תאי היעד.
3. כדי כל טוב, להוסיף 25 µL של המבחן מורכבות מדולל במדיום מלאה RPMI על הריכוז המתאים. דגירה תאי התורם ואת המטרה עם המתחם למשך 30 דקות.
  הערה: הריכוז משתנה לכל הסמים. אם זה ידוע IC₅₀, השתמש באפשרות זו כנקודת התחלה, titrating מעל ומתחת. אם ה IC₅₀ אינו ידוע, להכין מלאי מיקרומטר 200 ריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
4. לאחר רעלני, לשלב תאי התורם עם תאי היעד על-ידי pipetting התוכן של לוח אחד לתוך השני, דגירה את התאים עבור 40 ש ח בחודש חממה תרביות רקמה ב 37 ° C עם 5% CO₂.
Cytometry זרימה
1. להוסיף paraformaldehyde (PFA) כל טוב ריכוז סופי של 2%.
  הערה: עבור פתרון מניות 16%, זו µL 14 לכל 100 µL טוב.
2. התראה: PFA מזיק על עור חשוף והעיניים. ללבוש חלוק מעבדה, כפפות, משקפי בטיחות, להתמודד עם הפתרון מניות בשכונה בטיחות.
3. קרא את התאים על cytometer זרימה עם mCherry וערוצי FITC.
  הערה: זה ניתן לראות 5 – 20% של תאים המבטאים GFP מעל הרקע תאים נגועים לעומת. תאים נגוע.
4. דמיינו את האות ה-GFP באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (40 X) בערוצים GFP ספציפי (עם מסנן עירור של 400 nm ו מסנן פליטה של 508 ננומטר).

3. חלופה פרוטוקול בווירוס ללא תא

הכנת התאים היעד
1. הפשרה אחת 500 µL בקבוקון Jurkat RG תאים כתב על-ידי הצבת לתוך אמבט מים 37 º C. Pipette את התאים המבחנה לתוך 10 מ"ל של מדיום מלאה RPMI, ואז centrifuge המדיום מלאה RPMI ב x 800 גרם במשך 5 דקות ב 23 ° C. Resuspend בגדר ב 20 מיליליטר במדיום בקבוקון T-75 מלאה RPMI. דגירה הבקבוק בן לילה (37 ° C ו- 5% CO₂).
2. למחרת, להוסיף 0.5 µg/mL של puromycin (1 µL של מניה 2 מ"ג/מ"ל לכל 8 מ של מדיה). התרבות התאים, שמירה על צפיפות של 200,000 – 800,000 תאים למ"ל (שנספרת via hemocytometer).
3. היום לפני הגדרת העברה וזמינותו, לפצל את התאים עד 200,000 – 400,000 תאים למ"ל טרי בינוני RPMI המכילה 0.5 µg/mL של puromycin.
הייצור של וירוס ללא תא
1. Transfect צלחת confluent 10 ס מ 70% של תאים 293T¹¹ (ב- 10 מ"ל של DMEM עם 10% FBS) עם 5 µg של איסור פרסום-iCre¹ פלסמיד באמצעות תקנים מבוססי סידן¹³.
  הערה: בסולם זה יהיה לייצר 10 מ"ל של וירוס, אשר מספיק כ שניים עד ארבעה 96-ובכן, לוחיות בהתאם היעילות של תרביות תאים.
2. לקצור את תגובת שיקוע ויראלי כולו ב 48 שעות על-ידי pipetting התקשורת מהצלחת לתוך צינור חרוטי 15 mL צריך שתוציאו את הצינור ב x 3000 g עבור 5 דקות כדי הצניפה כל תא פסולת.
3. לצרף מסנן מיקרומטר 0.45 מזרק 10 מ"ל. לאחר צנטריפוגה, לקחת את כל supernatant, לטעון את המזרק. תריצי את הדגימה דרך לתוך צינור נקי 15 מ"ל.
4. השתמש הווירוס להדביק את התאים היעד באופן מיידי (שלב 3.3) או להקפיא ולאחסן את הוירוס ב-80 מעלות צלזיוס (הפשרה המדגם כנדרש לפני השימוש).
זיהום
1. ספור תאי היעד RG Jurkat (מתוך שלב 3.1.3) באמצעות hemocytometer ספין למטה 50,000 תאים היעד לכל טוב ב x 800 גרם במשך 5 דקות, resuspending את התאים-עונה 1 פרק 10⁶ תאים למ"ל בשנת RPMI להשלים בינונית ללא puromycin.
2. בצלחת אחת, להוסיף 25 µL של התאים היעד RG Jurkat כל טוב; בצלחת נפרדת, להוסיף 25 µL (2 ng) וירוס מכל קידוח.
3. כדי כל טוב, להוסיף 25 µL של הבדיקה במתחם, מדולל בתקשורת על הריכוז המתאים. דגירה התאים ווירוסים עם המתחם למשך 30 דקות.
  הערה: ריכוז הבדיקה משתנה לכל הסמים. אם זה ידוע IC₅₀, השתמש באפשרות זו כנקודת התחלה, titrating מעל ומתחת. אם לא ידוע, להכין מדיום 200 מניות מיקרומטר ריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
4. לאחר רעלני, להוסיף את התוכן כולו (50 µL) של המיקס וירוס/מתחם מן הבארות לתאי המטרה, דגירה הכל 40 ש ח בחודש חממה תרביות רקמה ב 37 ° C עם 5% CO₂.
Cytometry זרימה
1. להוסיף מחברים כל טוב ריכוז סופי של 2%.
  הערה: עבור פתרון מניות 16%, זו µL 14 לכל 100 µL טוב.
2. קרא את התאים על cytometer זרימה עם mCherry וערוצי FITC. האות ה-GFP ניתן גם מטמיעים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות בערוצים GFP.
  הערה: פעם תוכלו לראות 5 – 20% של תאים המבטאים GFP מעל הרקע תאים נגועים לעומת. התאים נגוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נגוע RG Jurkat תאים להפגין רמה נמוכה של אות ה-GFP רקע (0.3%) עם אות RFP חזק מאד (איור 2 א, טור נגוע). הזיהום עם איסור פרסום-iCre גורמת לעלייה GFP אות (24.9%), תוך הנוכחות של החומר המדכא פיוז'ן של HIV-1 AMD3100 (20 מיקרומטר) מעכב ההתפתחות של האות הזה, ל רקע נגוע רמות (0.34%). כאשר מעכב של אירוע פוסט-פיוז'ן כגון המדכא שעתוק במהופך AZT (2 מיקרומטר) משמש, האות לא מושפע באופן משמעותי (23.5%), המציין כי האות GFP המיוצר על ידי וזמינותו היא ספציפית ל- HIV-1 היתוך. איור 2B מציין עיכוב למינון של איסור פרסום-iCre פיוז'ן עם PPADS (100 מיקרומטר), מעכב purinergic לא בררניים.

איור 3 מציין השוואה של התא ללא HIV-1 קרום ויראלי היתוך באמצעות וזמינותו איסור פרסום-iCre (איור 3A) ואת וזמינותו הכנסים בלאם-Vpr (איור 3B). טיטור של איסור פרסום-iCre ובום-Vpr וירוסים שימש spinoculate — זמן 1,200 x 2 h g ספין צלחת 96-ובכן זיהום עם תחילת הזיהום כדי להגביר את היעילות שלה — RG Jurkat תאים עם תאים איסור פרסום-iCre ו- Jurkat עם הווירוס בלאם-Vpr כפי שתואר קודם לכן². 3 ng של הנגיף, בשני מבחני הציע אות חזקים של 64.7% (איסור פרסום-iCre) ל- 47.2% (בלאם-Vpr) של התאים היו התמזגו. ב- 0.3 ng של הווירוס, האותות היו 1.18% (איסור פרסום-iCre) ו- 2% (בלאם-Vpr). נתונים אלו מראים כי איסור פרסום-iCre יכולים להציע אות דומה פיוזן ויראלית כדי וזמינותו בלאם-Vpr ומבוססת במגוון של ריכוזים וירוס.

איור 1: סקירה assay איסור פרסום-iCre. RG Jurkat תאים מודגרת במשותף עם התורם Jurkat תאים transfected עם HIV איסור פרסום-iCre. על הממברנה ויראלי היתוך, Cre שוחרר לתוך תאי היעד, אשר יכול לבקע את הגן dsRed באתרים loxP כדי לאפשר ביטוי EGFP, וכתוצאה מכך התאים ואזוריט ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: נציג נובעת של התא וללא זיהום איסור פרסום-iCre--לתא. (א) תא ללא איסור פרסום-iCre פיוז'ן מעוכבת על ידי החומר המדכא פיוז'ן AMD3100, אבל לא על ידי שעתוק במהופך המדכא AZT. לוחות אלה להציג תאים RG Jurkat נגוע, RG Jurkat לא מטופל תאים 48 שעות לאחר הזיהום ותאים RG Jurkat 48 שעות לאחר ההדבקה אך שטופלו AMD3100 או AZT, כמצוין. הלוחות העליון מייצג micrographs פלורסנט בערוץ ה-GFP, הלוחות האמצעי מייצגים micrographs פלורסנט בערוץ RFP, ואילו הלוחות התחתון מייצגים תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון נתונים (FACS) עבור דגימות מציג GFP חיובית של אחוז מצביע על פיוז'ן. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לוח זה שונתה באישור אספוסיטו. et al. ¹. היתוך ממברנה ויראלי (B) ה HIV-1 בעקבות זיהום לתא מעוכבת על ידי PPADS. RG Jurkat התאים מעורבבים עם תאים Jurkat transfected עם איסור פרסום HIV-1-iCre, מעכבי AMD3100 ו- PPADS נבדקו ביכולתם לחסום פיוז'ן ממברנה ויראלי-100 מיקרומטר, כפי שמוצג תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית נציג סדרן חלקות. דמות זו שונתה מ. שוורץ ואח ⁶. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: HIV איסור פרסום-iCre כתב אות משולה בלאם-Vpr. חלוניות אלה מציגים את התוצאות של בדיקת FACS של (A) RG spinoculated תאים עם וירוס איסור פרסום-iCre ו- Jurkat (B) תאים spinoculated עם NL43 בלאם-Vpr, h 16 לאחר זיהום 6-אייץ '-ריכוז המצוין של הנגיף. לוח זה שונתה באישור אספוסיטו. et al. ¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

איסור פרסום-iCre וזמינותו הוכיחה להיות מאוד שימושי עבור מיון מועמדים סמים אשר עלול לעכב את שלב פיוז ' ן של שכפול ויראלי. בעת ביצוע וזמינותו הזה, הצעדים החשובים ביותר להשיג קליטה טובה דומים מבחני זיהום ויראלי ביותר. השלב הקריטי הראשון מפיק titers גבוהה של וירוס באיכות טובה. שלב זה דורש כי התאים 293T נמצאים passaged בתדירות גבוהה (לפחות 1 x כל 48 שעות) אז הם לא יהפכו overconfluent, להתאחד. בנוסף, זה עשוי להיות שווה ניסויים בשיטות תקנים שונים, כמו כמה חוקרים למצוא שתקנים סידן-פוספט הזה נותן תוצאות טובות יותר, בעוד אחרים טובה ריאגנטים מבוססי השומנים. בדומה, השלב הקריטי אחרים בפרוטוקול הזה הוא לא לתת את היעד תאים והדבר אלא לשמור בשלב הגידול האקספוננציאלי לפני הזיהום, כמו השלב נייח מפחיתה את היכולת שלהם להיות נגוע.

בהשוואה ומבוססת בלאם-Vpr assay², וזמינותו איסור פרסום-iCre מציע וזמינותו נטולת המצע ללא צורך תווית היעד תאים. זה עושה את זה גם מתאים עבור תפוקה גבוהה יישומים מסוימים¹. בנוסף, וזמינותו מספק סמן קבוע עבור ערך ויראלי גם אם התא הופך החבויים, המציע פוטנציאל ללמוד חבויה. מחקרים עתידיים עבור השהיה עשויים לנצל את המערכת הזו בעכברים איפה RG תאים אשר הוחלפו ירוק עקב חשיפה איסור פרסום-iCre, אך עדיין לא באופן פרודוקטיבי נגוע, יכול להיות מבודד ללמוד האוכלוסיות תאים רדומים בווירוס או זיהום חולבות. בנוסף השהיה, וזמינותו יש יישומים פוטנציאליים אחרים. זה יש בהצלחה נעזרו פסאודו-הקלדת עם חלבונים מעטפת נגיפית אחרים כגון אבולה VSV (נתונים שלא פורסמו), פותח את הפוטנציאל הזה assay לזהות פיוז'ן מעכבי למגוון רחב של וירוסים באופן בטוח יותר מאשר עבודה עם חי וירוס.

מגבלה אחת פוטנציאלי של איסור פרסום-iCre וזמינותו היא כי זה לקחת יום נוסף לאות לפתח, בהשוואה לבלאם-Vpr. בנוסף, הנגיף איסור פרסום-iCre במצבו הנוכחי משכפל רק עבור מחזור יחיד, אשר עובד עבור והתרופות הקרנה תחת התנאים אנחנו תיארו אבל לא יהיה מתאים מחקרים ארוכי טווח או עקומות גדילה. בעתיד, גרסאות חדשות של וזמינותו ייעשה עם אותות כתב שונים, כגון לוציפראז, המאפשר מגוון רחב יותר של שימושים. עוד, ההקרנה של ספריות מתחם גדול יותר יהיה סביר התשואה מעכבי הרומן ספציפית לשלב פיוז'ן של שכפול ויראלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH/NIAID AI112423 ו- NIH/NIGMS GM113885 כדי בנימין ק' חן ו- NIH/NIAID K08-AI120806 כדי טליה ה שוורץ. ברצוננו להודות על Icahn בית הספר לרפואה באוניברסיטת הר סיני של דין לזרום Cytometry הליבה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).