Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

Summary

Se describe un ensayo basado en células para reportar VIH-1 la fusión a través de la expresión de la proteína verde fluorescente detectable por microscopía de flujo cytometry o fluorescencia. Puede ser utilizado para probar los inhibidores de entrada viral (específicamente en la etapa de fusión) en sistemas libres de células y células a la infección.

Abstract

Este ensayo está diseñado para específicamente Informe VIH-1 la fusión a través de la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) detectable por microscopia de flujo cytometry o fluorescencia. Un virus de reportero de HIV-1 (HIV-1 Gag-iCre) genera insertando recombinase de Cre en el genoma del VIH-1 entre la matriz y las proteínas de la cápside de la poliproteína Gag. Esto resulta en un envase del recombinase de Cre en las partículas del virus, que luego se lanza en una célula objetivo línea estable expresando una Cre recombinase rojo fluorescente proteína activada (RFP) en casete de interruptor GFP. En estado basal, este cassette expresa RFP sólo. Tras la entrega del recombinase de Cre en la célula diana, la RFP, flanqueado por sitios loxP, accisas, dando por resultado la expresión de GFP. Este ensayo puede usarse para probar cualquier inhibidores de entrada viral (específicamente en la etapa de fusión) en sistemas libres de células y células a la infección y se ha utilizado para identificar una clase de antagonistas de los receptores purinérgicos como nuevos inhibidores de la fusión de la membrana viral VIH-1.

Introduction

La necesidad de terapias antirretrovirales novela impulsó el desarrollo de pantallas de alto rendimiento de inhibidores de la entrada HIV-1. El ensayo de reportero de Gag-iCre está desarrollado para identificar inhibidores de entrada viral en la etapa de fusión en un sistema de infección de célula a célula por medir específicamente la fusión de la membrana viral con la membrana de la célula anfitrión del¹. Se desarrolló un ensayo para detectar nuevos inhibidores que actúan específicamente en las primeras etapas de la infección VIH-1 hasta el punto de fusión de la membrana viral. Un reto para la infección de la célula de medición es que el inóculo inicial contiene células de un donante infectado y células blanco ininfected, para que medición de nueva infección es difícil de diferenciar de las células de entrada. El sistema ideal implicaría un marcador de gen heterólogo que puede ser inducido por el inicio de una infección de la célula objetivo y no está presente en la célula donante. Un contenido viral popular mezcla ensayo basado en la fusión de la proteína-enzima viral, BlaM-Vpr, puede ser eficaz, pero tiene limitaciones para alto rendimiento, proyección de célula². Este ensayo consiste en un gen reportero de beta-lactamasa (BlaM) que está unido a los HIV-1 Vpr, empaquetado en viriones y entregado a las células diana sobre la fusión de la membrana viral. El substrato CCF2-AM se carga en el citoplasma de las células diana y somete a un cambio de fluorescencia al escote. El substrato CCF2-AM es costoso y puede ser prohibitivo para pantallas de alto rendimiento. Para distinguir las células de donante y el destino, es necesario tinte-etiqueta las poblaciones destinatarias. Finalmente, el protocolo requiere varios pasos de lavado e incubación que pueden ser gravoso y costoso cuando gran número de compuestos.

El ensayo de Gag-iCre fue desarrollado como una solución a estos problemas, para desarrollar un alto rendimiento de inhibidores de la fusión en la transmisión de célula a célula. Este sistema no requiere de sustrato en las células. El ensayo también puede utilizarse para estudios sin células y es adaptable a otros estudios de fusión viral utilizando pseudo-con las partículas del virus HIV-1 Gag-iCre. Ensayos de fusión de VIH Env mediada por célula pueden medir virus Env celular mediada por la proteína de la fusión, sin embargo estos no utilizan partículas del virus real como el análisis de HIV-1 Gag-iCre hace^3,4,5. Este ensayo se puede leer con microscopía de flujo cytometry o fluorescencia. Se ha utilizado con éxito para la biblioteca de la FDA, así como una pequeña biblioteca de purinérgicos inhibidores^1,6. Otros investigadores también han identificado inhibidores purinérgicos en la fusión del VIH-1 mediante un ensayo de fusión de alto rendimiento adaptado y optimizado que informa de la transferencia de virus encapsulado de beta-lactamasa en el citoplasma^7,8 .

El virus Gag-iCre fue diseñado con un enfoque similar al virus Gag-iGFP, insertar recombinase de Cre entre matriz y cápside, flanqueado por la proteasa de HIV-1 sitios⁹. La enzima Cre se hace como un precursor que se inserta dentro de la poliproteína Gag que madura cuando se activa la proteasa VIH-1 dentro de la partícula del virus naciente. Por lo tanto, la entrega de Cre es dependiente sobre la entrega de los contenidos de una partícula de VIH-1 proteasa activada en un destino celular mediante un proceso de fusión de la membrana viral. Se incluyen dos versiones del protocolo. La primera utiliza una población de infectados por VIH-1 para infectar a las células diana, para estudiar la transmisión directa de célula a célula del VIH. La segunda versión utiliza un virus libres de células para el estudio de una infección viral sin células. El ensayo de transmisión de célula a célula toma 7 días desde el día que las células son descongeladas, o 5 días si las células son ya descongeladas y pasadas. El análisis sin células de la infección se puede realizar en 3 días y 5 días si las células necesitan ser descongelado si las células son descongeladas y pasadas. También está indicado para generar una línea de celular de target (rojo a verde) de RG en el tipo de célula deseada (si no se utiliza una línea de celular de destino RG preexistente) usando un plásmido creado por el laboratorio de Clevers¹⁰. Se recomienda que se toman las precauciones de bioseguridad apropiado con el virus y las células virus-expresión en este ensayo. Llevamos a cabo la parte infecciosa de este ensayo en un centro de cultivo de tejidos BSL2 +. Después de que las células son fijos, pueden ser analizadas en las instalaciones de microscopia y citometría de flujo estándar.

Aquí se describe la aplicación de este ensayo a pantalla a novela compuestos que inhiben la fusión de la membrana viral de VIH-1 (figura 1). Receptores purinérgicos son mediadores pro-inflamatorios. Nuestro laboratorio ha demostrado que los inhibidores no selectivos de los receptores purinérgicos actúan como inhibidores de fusión de la membrana viral VIH-1⁶. Divulgamos que la utilización de este ensayo de alto rendimiento puede identificar nuevos inhibidores de fusión de membrana viral VIH-1. Demostramos que un inhibidor de la clase purinérgicos de receptores representa una nueva clase de inhibidores de fusión de la membrana viral de VIH-1.

Protocol

1. generación de líneas de células de la blanco

Nota: Este paso es opcional; Si utiliza una línea de celular de destino RG existente, iniciar en el paso 2.

1. Cotransfect una placa de 10 cm confluentes de 70% de células 293T¹¹ [en 10 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS)] con pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE¹⁰ y pCL-10A1¹² (plásmido de embalaje) en un relación 1:1 (total 20 μg) utilizando transfección basada en calcio¹³.
2. Recoger 10 mL de la transfección de sobrenadante viral 48 h por uso de los medios de comunicación de la placa en un tubo cónico de 15 mL y centrifugar el tubo a 3.000 x g durante 5 minutos a 23 ° C para que sedimenten los residuos celulares.
3. Acoplar un filtro de 0.45 μm a una jeringa de 10 mL. Después de la centrifugación, tomar todo el sobrenadante y cargar la jeringa. Deje la muestra en un tubo limpio de 15 mL.
4. Alícuota del sobrenadante filtrado viral en tamaños adecuados (generalmente, de 0,5 – 1 alícuotas de mL). Estos pueden utilizados inmediatamente en el siguiente paso o puede congelados a-80 ° C y almacenarse.
5. Utilizar 50-100 μl del sobrenadante viral para infectar a una línea celular de elección en una placa de 96 pocillos. Cultura de las células a 37 ° C con 5% CO₂. La señal RFP debe aparecer en tan pronto como 24 horas debajo de un microscopio de fluorescencia (40 aumentos, excitación nm 532, 588 nm emisión) pero puede tomar hasta 72 h.
   Nota: En estos experimentos, las células Jurkat fueron utilizadas, pero pueden utilizarse otros tipos así.
6. Seleccionadas células transduced con puromicina estableciendo una serie de 10 pozos y puromicina agregando a cada uno, dejando por lo menos 1 bien no se tratan como un control (uso una gama de concentraciones de 0.5 μg/mL a 5 μg/mL; esto puede variar según el tipo de la célula). Monitor de la viabilidad de las células (lisis celular ocurrirán en las células sin resistencia puromicina) a lo largo de varios días en comparación con el control sin tratar y uso una concentración de puromicina donde sobreviven sólo células expresando RFP.
   Nota: Seleccionar la concentración donde las células untransfected son asesinadas mientras que células transfected sobreviven.
7. Con clasificación de citometría de Flujo unicelular o una dilución limitante (ver pasos 1.8 – 1.10), crecen cultivos derivados de las células¹ a desarrollar una línea clonal de la célula (esto puede tomar varias semanas para crecer).
8. Si utiliza el método de dilución, contar las células usando un hemocitómetro y diluir la muestra a 500 células/mL.
9. En una placa de 96 pocillos, pipetee 50 μl de la dilución celular en 50 μl de medios [media del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% FBS y 2% penicilina-estreptomicina, si usando células Jurkat] y realizar diluciones seriadas de 1:1 en 11 pozos que contienen 50 μl de los medios de comunicación. Para mejores resultados, realizar al menos 10 repeticiones.
10. Vigilar el crecimiento de la célula mediante microscopía (40 X) de la placa en una incubadora de cultivo de tejidos (37 ° C con 5% CO₂) o aproximadamente 4 semanas. Elegir las culturas de la más baja concentración de puromicina con crecimiento (como visto a través de microscopio, 40 X) para los cultivos clonales.
11. Congelar las alícuotas por centrifugación de 20 mL del cultivo (500.000 células/mL, contó con un hemocitómetro) a 800 x g durante 5 minutos a 23 ° C y resuspender en 500 μl de FBS con 10% de DMSO. Coloque a-80 ° C utilizando un recipiente de congelación de la célula y luego almacenar en nitrógeno líquido.

2. célula a célula Virus transmisión

1. Preparación de las células diana
   1. Descongelar un 500 frasco de μl de células de Jurkat RG reportero colocando en un baño de agua de 37 ° C. Pipetear las células del frasco en 10 mL de medio completo RPMI y luego centrifugar la mezcla a 800 x g durante 5 minutos a 23 ° C. Resuspender el precipitado en 20 mL de RPMI medio completo en un frasco de T-75. Incube el frasco durante la noche (37 ° C y 5% CO₂).
      Nota: RPMI medio completo contiene RPMI 1640, 10% SFB, 2 mM L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina y estreptomicina 100 mg/mL.
   2. Al día siguiente, Añadir 0,5 μg/mL de puromicina (1 μl de un stock de 2 mg/mL por 8 mL de medio). Las células, manteniendo una densidad de 200.000-800.000 células/mL (contado mediante hemocitómetro) de la cultura.
   3. El día antes de configurar el análisis de la transferencia, dividir las celdas hasta 200.000 – 400.000 células/mL en Medio RPMI fresco que contiene 0,5 μg/mL de puromicina.
2. Preparación de células de un donante
   1. Deshielo untransduced células de Jurkat y de la cultura en un frasco de T-75 con 20 mL de RPMI completan medio (como se describe en el paso 2.1), manteniendo una densidad de 200.000-800.000 células/mL.
   2. Centrifugar las 7.500.000 células (800 x g durante 5 min) y resuspender en 120 μl de solución de nucleofection V con suplemento (véase Tabla de materiales). Transferir las células a una cubeta de electroporación y agregar 4,5 μg de Gag-iCre¹ ADN. Transfectar las células (a través de una aproximación basada en la electroporación, véase la Tabla de materiales) utilizando un programa apropiado (por ejemplo, S-18) y luego transferirlos inmediatamente a 3 mL de Medio RPMI (con 10% FBS).
   3. Permitir a las células a recuperarlos incuba durante la noche a 37 ° C con 5% CO₂.
   4. A la mañana siguiente, centrifugar las células a 800 x g durante 5 minutos a 23 ° C y resuspender en 3 mL de RPMI medio completo, permitiendo que 2 h recuperar a 37 ° C (5% CO₂) antes de proceder con la instalación de ensayo.
3. Co de la cultura
   1. Contar las células utilizando un hemocitómetro y luego giro hacia abajo (800 x g durante 5 min a 23 ° C) de 50.000 células por pocillo a ensayar (de células de donante y el destino). Resuspender 1 x 10⁶ células/mL de RPMI completo sin puromicina.
   2. En una placa, añadir 25 μl de suspensión de la célula donante a cada bien; en otro plato, añada 25 μl de las células diana.
   3. A cada pocillo, añadir 25 μl de la sustancia de ensayo diluido en el Medio RPMI completo en la concentración adecuada. Incube las células del donante y el destino con el compuesto durante 30 minutos.
      Nota: La concentración variará por drogas. Si tiene un conocido IC₅₀, utilícela como punto de partida, valorar arriba y abajo. Si el IC₅₀ se desconoce, preparar un caldo μm 200 para una concentración final de 10 μm.
   4. Tras el pretratamiento, combinan las células del donante con las células diana transfiriendo el contenido de una placa en el otro e Incube las células durante 40 horas en una incubadora a 37 ° C con 5% CO₂de cultivo de tejidos.
4. Citometría de flujo
   1. Añadir paraformaldehido (PFA) a cada pozo a una concentración final de 2%.
      Nota: Para una solución stock de 16%, esto es 14 μl 100 μl.
   2. PRECAUCIÓN: PFA es perjudicial para la piel expuesta y los ojos. Una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad y gestionar la solución en una campana de seguridad.
   3. Leer las células en un citómetro de flujo con mCherry y canales de FITC.
      Nota: Es posible ver 5 – 20% de las células que expresan GFP sobre el fondo en el de las células infectadas vs. células no infectadas.
   4. Visualizar la señal GFP mediante microscopía de fluorescencia (40 X) en canales específicos de la GFP (con un filtro de excitación de 400 nm y un filtro de emisión del 508 nm).

3. alternativa protocolo para una infección de Virus libres de células

1. Preparación de las células diana
   1. Descongelar un 500 frasco de μl de células de Jurkat RG reportero colocando en un baño de agua de 37 ° C. Pipetear las células del frasco en 10 mL de medio completo RPMI y luego centrifugar el medio completo RPMI a 800 x g durante 5 minutos a 23 ° C. Resuspender el precipitado en 20 mL de RPMI medio completo en un frasco de T-75. Incube el frasco durante la noche (37 ° C y 5% CO₂).
   2. Al día siguiente, Añadir 0,5 μg/mL de puromicina (1 μl de un stock de 2 mg/mL por 8 mL de medio). Las células, manteniendo una densidad de 200.000-800.000 células/mL (contado mediante hemocitómetro) de la cultura.
   3. El día antes de configurar el análisis de la transferencia, dividir las celdas hasta 200.000 – 400.000 células/mL en Medio RPMI fresco que contiene 0,5 μg/mL de puromicina.
2. Producción de un virus libres de células
   1. Transfectar una placa de 10 cm confluentes de 70% de células 293T¹¹ (en 10 mL de DMEM con 10% FBS) con 5 μg de plásmido de¹ Gag-iCre mediante transfección con calcio¹³.
      Nota: Esta escala producirá 10 mL de virus, que es bastante para aproximadamente dos a cuatro placas de 96 pocillos, dependiendo de la eficacia de la transfección.
   2. Recoger el sobrenadante viral completo a las 48 h por pipetear los medios de comunicación de la placa en un tubo cónico de 15 mL y centrifugar el tubo a 3.000 x g durante 5 minutos para que sedimenten los restos celulares.
   3. Acoplar un filtro de 0.45 μm a una jeringa de 10 mL. Después de la centrifugación, tomar todo el sobrenadante y cargar la jeringa. Deje la muestra en un tubo limpio de 15 mL.
   4. Usar el virus para infectar las células blanco inmediatamente (paso 3.3) o congelar y almacenar el virus a-80 ° C (deshielo de la muestra según sea necesario antes de usar).
3. Infección
   1. Contar las células de Jurkat RG blanco (del paso 3.1.3) usando un hemocitómetro y centrifugado a 50.000 células diana por bien a 800 x g durante 5 min, resuspender las células en 1 x 10⁶ células/mL de RPMI completo medio sin puromicina.
   2. En una placa, añadir 25 μl de células de Jurkat RG blanco a cada bien; en un plato aparte, añada 25 μl (2 ng) virus a cada pocillo.
   3. A cada pocillo, añadir 25 μl de la prueba compuesta, diluido en los medios de comunicación en la concentración adecuada. Incubar las células y el virus con el compuesto durante 30 minutos.
      Nota: La concentración de prueba variará por drogas. Si tiene un conocido IC₅₀, utilícela como punto de partida, valorar arriba y abajo. Si desconocido, preparar un medio común de 200 μm para una concentración final de 10 μm.
   4. Tras el pretratamiento, añadir todo el contenido (50 μL) de la mezcla de virus/compuesto de los pozos a las células diana e incubar todo durante 40 horas en una incubadora a 37 ° C con 5% CO₂de cultivo de tejidos.
4. Citometría de flujo
   1. Añadir PFA a cada pozo a una concentración final de 2%.
      Nota: Para una solución stock de 16%, esto es 14 μl 100 μl.
   2. Leer las células en un citómetro de flujo con mCherry y canales de FITC. La señal GFP también puede ser visualizados mediante microscopía de fluorescencia en los canales de la GFP.
      Nota: Una vez puede esperar 5 – 20% de las células que expresan GFP sobre el fondo en el de las células infectadas vs. las células no infectadas.

Representative Results

Células de Jurkat RG no infectadas exhiben un bajo nivel de señal de fondo GFP (0.3%) con una señal muy fuerte de la RFP (figura 2A, columna no infectada). La infección con mordaza-iCre provoca un aumento en la señal GFP (24,9%), mientras que la presencia del inhibidor de la fusión del VIH-1 AMD3100 (20 μm) inhibe el desarrollo de esta señal, llevándola a niveles de fondo no infectada (0,34%). Cuando un inhibidor de un evento de la fusión tales como el inhibidor de la transcripción reversa AZT (2 μm) se utiliza, la señal no es afectada significativamente (23,5%), indicando que la señal GFP producida por el análisis es específico de fusión de VIH-1. Figura 2B indica una inhibición dependiente de la dosis de fusión Gag-iCre con PPADS (100 μm), un inhibidor no selectivo purinérgicos.

Figura 3 indica una comparación de célula libre fusión de membrana viral VIH-1 mediante el ensayo de Gag-iCre (Figura 3A) y el ensayo de Convención BlaM-Vpr (figura 3B). Una titulación de virus Gag-iCre y BlaM-Vpr fue utilizado para spinoculate, un giro de g largo 1.200 x 2 h de la placa de 96 pocillos infección al comienzo de la infección para aumentar su eficiencia — células de Jurkat RG con mordaza-iCre y Jurkat células con el virus de BlaM-Vpr como descrito previamente². En 3 ng de virus, ambos ensayos ofrecieron una señal robusta del 64.7% (Gag-iCre) y 47.2% (BlaM-Vpr) de las células fueron fundidos. En 0.3 ng del virus, las señales eran 1.18% (Gag-iCre) y 2% (BlaM-Vpr). Estos datos sugieren que la mordaza-iCre puede ofrecer una señal comparable para la fusión viral para el ensayo de BlaM-Vpr establecida en un rango de concentraciones de virus.

Figura 1: Resumen de ensayo de Gag-iCre. Células Jurkat RG se incuban conjuntamente con donante células de Jurkat transfectadas con VIH Gag-iCre. Sobre la fusión de la membrana viral, la Cre se libera en las células diana, que pueden unirse el dsRed gene en los sitios loxP para permitir la expresión de EGFP, dando por resultado las células fluorescentes verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Representante resulta de una libre y una infección de célula a célula Gag-iCre. (A) sin células fusión Gag-iCre es inhibida por el inhibidor de fusión AMD3100, pero no por el inhibidor de la transcripción reversa AZT. Estos paneles muestran células Jurkat RG no infectadas, no tratadas células Jurkat RG 48 h después de la infección y células de Jurkat RG 48 h después de la infección pero trataron con AMD3100 o AZT, como se indica. Los paneles superiores representan imágenes fluorescentes en el canal GFP, los paneles mediados representan imágenes fluorescentes en el canal RFP, mientras que los paneles inferiores representan células activado por fluorescencia ordenar datos (FACS) para muestras con GFP positivas de un porcentaje de fusión. Barra de escala = 100 μm. Este panel ha sido modificado con permiso de Esposito et al. ¹. fusión de la membrana viral (B) el VIH-1 después de la infección de célula a célula es inhibida por PPADS. Células Jurkat RG se mezclaron con las células de Jurkat transfectadas con HIV-1 Gag-iCre, y los inhibidores de AMD3100 y PPADS fueron probados por su capacidad para bloquear fusión de membrana viral en 100 μm, como se muestra en las parcelas de clasificador representante celular activado por fluorescencia. Esta figura ha sido modificada desde Swartz et al. ⁶. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: señal de VIH Gag-iCre reportero es comparable a BlaM-Vpr. Estos paneles muestran los resultados de un análisis FACS de RG (A) spinoculated de las células con un virus Gag-iCre y células de Jurkat (B) spinoculated con NL43 BlaM-Vpr, 16 h después de una infección de 6 h a la concentración indicada del virus. Este panel ha sido modificado con permiso de Esposito et al. ¹. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El ensayo de Gag-iCre ha demostrado para ser muy útil para la detección de candidatos de drogas que pueden inhibir el paso de la fusión de la replicación viral. Al realizar este ensayo, los pasos más importantes para obtener una buena señal son similares a ensayos más virales de la infección. El primer paso crítico es producción de altos títulos de virus de buena calidad. Este paso requiere que las células 293T son pasados con frecuencia (al menos 1 x cada 48 h) para que no se convierten en overconfluent y agruparse. Además, puede ser vale la pena experimentar con métodos de transfección diferentes, como algunos investigadores que transfección del fosfato de calcio da mejores resultados, mientras que otros favorecen a base de lípidos reactivos. Asimismo, el otro paso crítico en este protocolo es no dejar que el destino de las células cubran pero para mantenerlos en la fase de crecimiento exponencial justo antes de la infección, como la fase estacionaria reduce su capacidad de ser infectados.

Comparado con el bien establecido BlaM-Vpr ensayo², el ensayo de Gag-iCre ofrece un ensayo libre de sustrato sin necesidad de células de la blanco de la etiqueta. Esto lo hace idóneo para ciertas aplicaciones de alto rendimiento¹. Además, el análisis proporciona un marcador permanente para la entrada viral incluso si la celda se convierte en latente, que ofrece algunas posibilidades para el estudio de infección latente. Futuros estudios de latencia pueden utilizar este sistema en ratones donde células RG que cambia a verde debido a la exposición de Gag-iCre, sin embargo, no son productivamente infectado, podrían ser aisladas para el estudio de las poblaciones de células con un virus latente o infección no productiva. Además de latencia, el ensayo tiene otras aplicaciones potenciales. Se ha utilizado con éxito para pseudo-mecanografiar con otras proteínas de la envuelta viral Ebola como VSV (datos no publicados), abriendo la posibilidad de que este análisis identificar inhibidores de la fusión de una variedad de virus de manera más segura que trabajando con un vivo virus.

Una limitación potencial del ensayo iCre Gag es que toma un día adicional para la señal para el desarrollo, comparado con el BlaM-Vpr. Además, el virus Gag-iCre en su estado actual sólo se replica para un solo ciclo, que trabaja para la detección de drogas en las condiciones que han descrito, pero no sería adecuado para estudios a largo plazo o las curvas de crecimiento. En el futuro, nuevas versiones de la prueba se realizará con señales diferentes reportero, como luciferase, permitiendo para una amplia variedad de usos. Además, la proyección de grandes bibliotecas compuestas será probable rendimiento nuevos inhibidores específicos de la etapa de fusión de la replicación viral.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).