En høy gjennomstrømming grobunn-Lox aktivert Viral membran Fusion analysen for å identifisere hemmere av HIV-1 Viral membran Fusion

Summary

Vi beskriver en cellebasert analysen for å rapportere om HIV-1 fusion via uttrykk for grønne fluorescerende protein detectable av flyt cytometri eller fluorescens mikroskopi. Den kan brukes til å teste hemmere av viral inngang (spesielt på fusion trinn) i celle-fri og celle-til-celle systemer.

Abstract

Denne analysen er designet spesielt rapportere om HIV-1 fusion via uttrykk for grønne fluorescerende protein (GFP) oppdages av flyt cytometri eller fluorescens mikroskopi. En HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) genereres ved å sette inn grobunn recombinase i HIV-1 genomet mellom matrix og kapsid proteiner av Gag polyprotein. Dette resulterer i en emballasje av grobunn recombinase i viruspartikler, som deretter sluppet inn en Målcelle linje stabilt uttrykke en grobunn recombinase-aktivert røde fluorescerende protein (RFP) på GFP bytte kassett. I basale staten uttrykker denne kassetten RFP bare. Etter levering av grobunn recombinase i målcellen, den RFP, flankert av loxP avgifter, noe som resulterer i GFP uttrykk. Denne analysen kan brukes til å teste noen hemmere av viral inngang (spesielt på fusion trinn) i celle-fri og celle-til-celle systemer og har blitt brukt til å identifisere en klasse purinergic reseptor antagonister som roman hemmere av HIV-1 viral membran fusion.

Introduction

Behovet for romanen antiretroviral terapi har bedt utviklingen av høy gjennomstrømming skjermene hemmere av HIV-1 oppføring. Gag-iCre reporter analysen er utviklet for å identifisere hemmere av viral oppføringen ved fusion trinn i en celle til celle infeksjon systemet ved å måle spesielt viral membran fusjon med verten celle membran¹. En analysen ble utviklet til skjermen for romanen hemmere som fungerte spesielt i de tidlige stadiene av HIV-1 smitte opp til punktet av viral membran fusion. En utfordring å måle celle-celle infeksjon er at det første inoculum inneholder infiserte donor cellene og ininfected mål, så måle ny infeksjon er vanskelig å skille fra innsettingscellene. Det ideelle systemet ville innebære en heterologous gene markør som kan indusert ved initiering av en målet cellen infeksjon og finnes ikke i giveren cellen. En populær viral innhold blanding analysen basert på en viral protein-enzym fusion, BlaM-Vpr, kan være effektive, men har begrensninger for høy ytelse, celle-celle screening². Denne analysen omfatter en beta-lactamase (BlaM) reporter genet som er sammensmeltet med HIV-1 Vpr, pakket inn i virions og leveres til målcellene på viral membran fusion. Underlaget CCF2-AM er lastet inn i cytoplasma av målcellene og gjennomgår et fluorescens skifte på cleavage. CCF2-AM underlaget er dyrt og være uoverkommelige for høy gjennomstrømming skjermer. For å skille giver og målet celler, er det nødvendig å fargestoff-label målet befolkningen. Til slutt, protokollen krever flere vask og inkubasjon trinn som kan være plagsom og kostbare når testing stort antall forbindelser.

Gag-iCre analysen ble utviklet som en løsning på disse problemene, å utvikle en høy gjennomstrømming screening for hemmere av fusjon i celle til celle overføring. Dette systemet krever ikke substrat lastes inn celler. Analysen kan også brukes for celle-fri studier og tilpasses andre viral fusion studier med pseudo skrevet viruspartikler for HIV-1 Gag-iCre. HIV konv mediert celle-celle fusion analyser kan måle virus konv protein-mediert celle fusion, men disse ikke bruker faktiske viruspartikler som HIV-1 Gag-iCre analysen gjør^3,4,5. Denne analysen kan leses med flyt cytometri eller fluorescens mikroskopi. Det har blitt brukt til skjermen FDA biblioteket samt et lite bibliotek purinergic hemmere^1,6. Andre etterforskere har også identifisert purinergic hemmere i HIV-1 fusion bruker en tilpasset og optimert høy gjennomstrømming fusion analyse som overføring av virus-innkapslet beta-lactamase i cytoplasma^7,8 -rapporter .

Gag-iCre virus ble designet med en lignende tilnærming til Gag-iGFP virus, sette grobunn recombinase mellom matrise og kapsid, flankert av HIV-1 protease nettsteder⁹. Grobunn enzymet er laget som en forløper satt inn i den Gag polyprotein som modnes når HIV-1 protease aktiveres innen begynnende viruset partikkel. Grobunn levering er dermed avhengig for levering av innholdet i en protease-aktivert HIV-1-partikkel i en målet cellen via en viral membran fusion prosessen. To versjoner av protokollen tilbys her. Først bruker en HIV-1 infisert befolkning for å infisere målcellene, å studere direkte celle til celle overføring av HIV. Den andre versjonen bruker en celle-gratis virus for å studere en celle virusinfeksjon. Celle til celle overføring analysen tar 7 dager å fullføre dagen cellene er tint, eller 5 dager hvis cellene er allerede Tint og passaged. Cellen gratis infeksjon analysen kan utføres i 5 dager hvis cellene må være Tint og 3 dager hvis cellene er Tint og passaged. Instruksjoner gitt også generere en RG (rød til grønn) målet cellen linje i ønsket celle type (Hvis en eksisterende RG målet cellen linje ikke brukes) bruker en plasmider skapt av Clevers laboratorium¹⁰. Det anbefales at riktig biosikkerhet forholdsregler er tatt med viruset og virus-uttrykke cellene i denne analysen. Vi gjennomfører den smittsomme delen av denne analysen i BSL2 + vev kultur anlegg. Når cellene er faste, kan de bli analysert i standard flyt cytometri og mikroskopi fasiliteter.

Her beskriver vi anvendelsen av denne analysen til skjermen for romanen forbindelser som hemmer HIV-1 viral membran fusion (figur 1). Purinergic reseptorer er pro-inflammatoriske mediatorer. Vårt laboratorium har vist at ikke-selektive hemmere av purinergic reseptorer fungere som hemmere av HIV-1 viral membran fusion⁶. Vi rapporterer at bruken av denne analysen i høy gjennomstrømning kan identifisere romanen HIV-1 viral membran fusion hemmere. Vi viser at en inhibitor av purinergic klassen av reseptorer representerer en roman klasse av HIV-1 viral membran fusion hemmere.

Protocol

1. generasjon av målet cellelinjer

Merk: Dette trinnet er valgfritt. Hvis du bruker en eksisterende RG målet cellen linje, start på trinn 2.

1. Cotransfect en 70% confluent 10 cm plate av 293T celler¹¹ [i 10 mL av Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS)] med pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE¹⁰ og pCL-10A1¹² (emballasje plasmider) i en 1:1 ratio (20 µg totale) bruker kalsium-baserte transfection¹³.
2. Høste 10 mL av viral supernatant 48 timer etter transfection pipettering media fra platen inn i et 15 mL konisk rør og sentrifugering røret 3000 x g i 5 min på 23 ° C pellets noen celle rusk.
3. Knytte et 0,45 µm filter til en 10 mL sprøyte. Etter sentrifugering, ta hele supernatant og Legg i sprøyten. Kjøre utvalget gjennom til en ren 15 mL tube.
4. Aliquot filtrert viral nedbryting til passende størrelse (vanligvis 0,5-1 mL dele). Dette kan brukes umiddelbart i neste trinn eller kan fryses på-80 ° C og lagres.
5. Bruk 50-100 µL av viral nedbryting for å infisere en celle linje med valg i en 96-brønns plate. Kultur cellene på 37 ° C med 5% CO₂. RFP signalet skal vises i så snart 24 h under fluorescens mikroskop (40 X forstørrelse, 532 nm eksitasjon, 588 nm utslipp), men kan ta opptil 72 h.
   Merk: I disse eksperimentene, Jurkat celler ble brukt, men andre typer kan brukes også.
6. Velg transduced celler med puromycin ved å sette opp en rekke 10 brønner og legge puromycin til hver, etterlot minst 1 godt ubehandlet som en kontroll (bruk en rekke konsentrasjoner fra 0,5 µg/mL til 5 µg/mL, dette kan variere per celle type). Overvåke celle gjennomførbarheten (celle lysis skjer i celler uten puromycin motstand) i løpet av dagene forhold til ubehandlet kontroll og bruk en konsentrasjon av puromycin hvor bare RFP-uttrykke celler overleve.
   Merk: Velg konsentrasjonen hvor untransfected celler er drept mens transfekterte celler overleve.
7. Encellede flyt cytometri sortering eller en begrensende fortynning (se trinn 1.8-1,10), vokse kulturer stammer fra enkeltceller¹ å utvikle en klonal cellen linje (dette kan ta flere uker å vokse).
8. Hvis du bruker fortynning metoden, telle celler ved hjelp av en hemocytometer og fortynne prøve å ca 500 celler/mL.
9. I en 96-brønns plate, Pipetter 50 µL av cellen fortynning i 50 µL av media [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 10% FBS og 2% penicillin-streptomycin, hvis bruker Jurkat celler] og utføre 1:1 seriell fortynninger i 11 brønner som inneholder 50 µL av media. De beste resultatene, kan du utføre minst 10 gjentak.
10. Overvåke cellevekst via mikroskopi (40 X) av platen i en vev kultur inkubator (37 ° C med 5% CO₂) eller ca. 4 uker. Velg kulturer laveste puromycin konsentrasjonen med vekst (som sett via mikroskop, 40 X) for klonal kulturer.
11. Fryse dele sentrifugering 20 mL av kultur (500.000 celler/mL, telles med en hemocytometer) på 800 x g i 5 min på 23 ° C og resuspending det i 500 µL av FBS med 10% DMSO. Plassere det på-80 ° C med en celle frysepunktet beholder og lagre den deretter i flytende nitrogen.

2. celle-til-celle Virus smitte

1. Utarbeidelse av målcellene
   1. Tøvær en 500 µL hetteglass med Jurkat RG reporter celler ved å plassere den i en 37 ° C vannbad. Pipetter cellene fra ampullen i 10 mL av RPMI komplett medium og deretter virvel blandingen på 800 x g i 5 min på 23 ° C. Resuspend pellet i 20 mL av RPMI komplett medium i en T-75 bolle. Inkuber kolbe natten (37 ° C og 5% CO₂).
      Merk: RPMI komplett mediet inneholder RPMI 1640, 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 enheter/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin.
   2. Neste dag, Legg til 0,5 µg/mL av puromycin (1 µL av en 2 mg/mL aksje per 8 mL av media). Kultur du cellene samt opprettholde en tetthet av 200.000-800.000 celler/mL (telt via hemocytometer).
   3. Dagen før overføring analysen, dele cellene til 200 000-400 000 celler/mL i frisk RPMI medium som inneholder 0,5 µg/mL av puromycin.
2. Utarbeidelse av donor cellene
   1. Tine untransduced Jurkat celler og kultur dem i en T-75 bolle med 20 mL RPMI fullføre medium (som beskrevet i trinn 2.1), holde en tetthet av 200.000-800.000 celler/mL.
   2. Sentrifuge 7,500,000 celler (800 x g i 5 min) og resuspend dem i 120 µL nucleofection løsning V med supplement (se Tabell for materiale). Overføre cellene til en electroporation cuvette og legge 4,5 µg Gag-iCre¹ DNA. Transfect cellene (via electroporation-basert tilnærming, se Tabellen for materiale) bruker et passende program (f.eksS-18) og deretter øyeblikkelig overføre dem til 3 mL RPMI medium (med 10% FBS).
   3. At cellene å gjenopprette ved rugende dem over natten på 37 ° C med 5% CO₂.
   4. Neste morgen, sentrifuge cellene på 800 x g i 5 min på 23 ° C og resuspend dem i 3 mL RPMI komplett medium, slik at de 2 h å komme seg på 37 ° C (5% CO₂) før du fortsetter med analysen opplegget.
3. Co kultur
   1. Telle celler bruker en hemocytometer så spinn ned 50 000 celler (800 x g i 5 min på 23 ° C) per brønn å bli assayed (av både giver og målet celler). Resuspending 1 x 10⁶ celle/mL i RPMI komplett uten puromycin.
   2. I én plate, tilsett 25 µL av donor celle suspensjon hver brønn; en annen tallerken, Legg 25 µL av målcellene.
   3. I hver brønn, kan du legge til 25 µL av testen sammensatte fortynnet i RPMI komplett medium på riktig konsentrasjonen. Inkuber giver og målet cellene med sammensatte i 30 min.
      Merk: Konsentrasjonen vil variere per narkotika. Hvis det er en kjent IC₅₀, kan du bruke dette som et utgangspunkt, titrating over og under. Hvis IC₅₀ er ukjent, forberede en 200 µM lager en siste konsentrasjon av 10 µM.
   4. Etter forbehandling, kombinere donor cellene med målcellene ved pipettering innholdet av en plate i den andre og ruge celler for 40 timer i en vev kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO₂.
4. Flowcytometri
   1. Legg til paraformaldehyde (PFA) hver brønn til en siste konsentrasjon på 2%.
      Merk: For en 16% lager løsning er 14 µL per 100 µL godt.
   2. FORSIKTIG: PFA er skadelig for eksponert hud og øyne. Ha en labfrakk, hansker og vernebriller, og håndtere lager løsningen i sikkerhet hette.
   3. Les cellene i en flyt cytometer med mCherry og FITC-kanaler.
      Merk: Det er mulig å se 5-20% av celler uttrykke GFP over bakgrunnen i infiserte celler vs. infisert celler.
   4. Visualisere GFP signalet via fluorescens mikroskopi (40 X) på GFP-spesifikke kanaler (med et eksitasjon filter på 400 nm og et utslipp filter for 508 nm).

3. alternativ protokoll for en Cell-free virusinfeksjon

1. Utarbeidelse av målcellene
   1. Tøvær en 500 µL hetteglass med Jurkat RG reporter celler ved å plassere i en 37 ° C vannbad. Pipetter cellene fra ampullen i 10 mL av RPMI komplett medium og deretter virvel RPMI komplett middels på 800 x g i 5 min på 23 ° C. Resuspend pellet i 20 mL av RPMI komplett medium i en T-75 bolle. Inkuber kolbe natten (37 ° C og 5% CO₂).
   2. Neste dag, Legg til 0,5 µg/mL av puromycin (1 µL av en 2 mg/mL aksje per 8 mL av media). Kultur du cellene samt opprettholde en tetthet av 200.000-800.000 celler/mL (telt via hemocytometer).
   3. Dagen før overføring analysen, dele cellene til 200 000-400 000 celler/mL i frisk RPMI medium som inneholder 0,5 µg/mL av puromycin.
2. Produksjon av celle-gratis virus
   1. Transfect en 70% confluent 10 cm plate 293T celler¹¹ (i 10 mL av DMEM med 10% FBS) med 5 µg av Gag-iCre¹ plasmider med kalsium-baserte transfection¹³.
      Merk: Denne skalaen vil produsere 10 mL av viruset, som er nok for ca to til fire 96-brønns plater, avhengig av effektiviteten av transfection.
   2. Høste hele viral nedbryting på 48 timer av pipettering media fra platen inn i et 15 mL konisk rør og sentrifugering røret 3000 x g for 5 min til pellets alle celle rusk.
   3. Knytte et 0,45 µm filter til en 10 mL sprøyte. Etter sentrifugering, ta hele supernatant og Legg i sprøyten. Kjøre utvalget gjennom til en ren 15 mL tube.
   4. Bruk virus infisere målcellene umiddelbart (trinn 3.3) eller fryse og lagre viruset ved-80 ° C (Tin prøven nødvendig før bruk).
3. Infeksjon
   1. Telle RG Jurkat målet celler (fra trinn 3.1.3) bruker en hemocytometer og spinn ned 50 000 målet celler per brønn på 800 x g for 5 min, resuspending cellene på 1 x 10⁶ celler/mL i RPMI fullføre medium uten puromycin.
   2. Legg 25 µL av RG Jurkat målet celler i én plate, hver brønn; i en separat plate, legger du til 25 µL (2 ng) virus i hver brønn.
   3. I hver brønn, legge 25 µL av testen sammensatte, fortynnet i media på riktig konsentrasjonen. Inkuber cellene og viruset med sammensatte i 30 min.
      Merk: Test konsentrasjonen vil variere per narkotika. Hvis det er en kjent IC₅₀, kan du bruke dette som et utgangspunkt, titrating over og under. Hvis ukjent, klargjør en 200 µM lager medium for en siste konsentrasjon av 10 µM.
   4. Etter forbehandling, legge hele innholdet (50 µL) i virus/sammensatt blanding fra brønnene til målcellene og ruge alt for 40 timer i en vev kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO₂.
4. Flowcytometri
   1. Tilsett PFA hver brønn til en siste konsentrasjon på 2%.
      Merk: For en 16% lager løsning er 14 µL per 100 µL godt.
   2. Les cellene i en flyt cytometer med mCherry og FITC-kanaler. GFP signalet kan også være visualisert via fluorescens mikroskopi på GFP kanaler.
      Merk: Når kan forvente å se 5-20% av celler uttrykke GFP over bakgrunnen i infiserte celler vs. infisert cellene.

Representative Results

Infisert RG Jurkat celler utstilling lave bakgrunn GFP signal (0,3%) med en veldig sterk RFP signal (figur 2A, infisert kolonne). Infeksjon med Gag-iCre forårsaker en økning i GFP signal (24,9%), mens tilstedeværelsen av HIV-1 fusion hemmer AMD3100 (20 µM) hemmer utviklingen av signalet, bringe den til uninfected bakgrunn nivåer (0,34%). Når en inhibitor av en post fusion hendelsen den omvendte transkripsjon inhibitor AZT (2 µM) brukes, signalet påvirkes ikke vesentlig (23,5%), som angir at GFP signalet produsert av analysen er spesifikke for HIV-1 fusion. Figur 2B angir en doseavhengig hemming av Gag-iCre fusion med PPADS (100 µM), en ikke-selektive purinergic hemmer.

Figur 3 viser en sammenligning av celle-gratis HIV-1 viral membran fusion Gag-iCre analysen (figur 3A) og konvensjonen BlaM-Vpr analysen (figur 3B). En titrering Gag-iCre og BlaM-Vpr virus ble brukt til å spinoculate-en 2t lenge 1200 x g spinn av 96-brønns infeksjon plate i begynnelsen av infeksjonen å øke effektiviteten, RG Jurkat celler med Gag-iCre og Jurkat celler med BlaM-Vpr virus som tidligere beskrevet². 3 ng av viruset, begge Analyser tilbys et robust signal 64.7% (Gag-iCre) og 47,2% (BlaM-Vpr) av cellene var smeltet. På 0,3 ng av viruset, signalene ble 1,18% (Gag-iCre) og 2% (BlaM-Vpr). Disse data tyder på at Gag-iCre kan tilby et tilsvarende signal for viral fusion å veletablerte BlaM-Vpr analysen på en rekke virus konsentrasjoner.

Figur 1: kneble-iCre analysen oversikt. RG Jurkat celler er co inkubert med donor Jurkat celler transfekterte med HIV Gag-iCre. På viral membran fusion slippes grobunn til målcellene, som kan holde seg dsRed genet på loxP nettsteder tillate EGFP uttrykk, som resulterer i cellene fluorescing grønn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: representant resultater fra en celle-fri og en celle til celle Gag-iCre infeksjon. (A) Cell-free Gag-iCre fusion er hemmet av den fusion inhibitor AMD3100, men ikke av den omvendte transkripsjon inhibitor AZT. Disse skjermbildene viser infisert RG Jurkat celler, ubehandlet RG Jurkat celler 48 timer etter infeksjon og RG Jurkat celler 48t etter infeksjon men behandlet med AMD3100 eller AZT, som angitt. Den øvre panelene representerer fluorescerende micrographs på GFP kanalen, midterste panelene representerer fluorescerende micrographs på RFP kanalen, mens den nedre paneler representerer fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) data for utvalg vise GFP positivt av en prosent indikativ av fusion. Skala bar = 100 µm. Dette panelet er endret med tillatelse fra Esposito et al. ¹. (B) The HIV-1 viral membran fusion etter celle til celle infeksjon er hemmet av PPADS. RG Jurkat celler ble blandet med Jurkat celler transfekterte med HIV-1 Gag-iCre, og hemmere AMD3100 og PPADS ble testet for deres evne til å blokkere virus membran fusion på 100 µM, slik som vist i representant fluorescens-aktivert cellen sorter tomter. Dette tallet har blitt endret fra Swartz et al. ⁶. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: HIV Gag-iCre reporter signal kan sammenlignes med BlaM-Vpr. Disse skjermbildene viser resultatene av en FACS analyse av (A) RG celler spinoculated av en Gag-iCre virus og (B) Jurkat celler spinoculated med NL43 BlaM-Vpr, 16 h etter en 6 h infeksjon på angitte konsentrasjonen av viruset. Dette panelet er endret med tillatelse fra Esposito et al. ¹. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Gag-iCre analysen har vist seg for å være svært nyttig for screening narkotika kandidater som kan hemme fusion trinn i viral replikasjon. Når du utfører denne analysen, er de viktigste trinnene å få et godt signal like mest viral infeksjon analyser. Det første kritiske trinnet produserer høy titers av god kvalitet virus. Dette trinnet krever at 293T cellene er passaged ofte (minst 1 x hver 48 h) så de ikke blir overconfluent og clump sammen. I tillegg kan det være verdt å eksperimentere med forskjellige hva metoder, som noen forskere finner at kalsium-fosfat transfection gir bedre resultater, mens andre favorisere lipid-baserte reagenser. Tilsvarende er det andre avgjørende skrittet i denne protokollen å ikke la målet celler overgrow men å holde dem i eksponensiell vekstfase rett før infeksjon, som stasjonære fasen reduserer deres evne til å være infisert.

Gag-iCre analysen i forhold til veletablert BlaM-Vpr analysen², og tilbyr en substrat-fri analysen med nei nød å etiketten målcellene. Dette gjør det godt egnet for visse høy gjennomstrømming programmer¹. Dessuten gir analysen en permanent markør for viral oppføring selv om cellen blir latente, tilbyr noen mulighet til å studere latente infeksjon. Fremtidige studier for ventetid kan benytte dette systemet i mus hvor RG celler som har slått til grønt på grunn av Gag-iCre eksponering, men er ikke produktivt infisert, kan være isolert å studere celle populasjoner med latente virus eller nonproductive infeksjon. I tillegg til ventetid har analysen andre potensielle anvendelser. Det har vært vellykket utnyttet for pseudo-skrive med andre viral konvolutten proteiner som Ebola og VSV (upubliserte data), åpne opp potensialet for denne analysen identifisere fusion hemmere for en rekke virus på en tryggere måte enn arbeider med en live virus.

En potensiell begrensning av Gag-iCre analysen er at det tar en ekstra dag for signalet å utvikle sammenlignet BlaM-Vpr. I tillegg replikat Gag-iCre virus i sin nåværende tilstand kun for en enkelt syklus, hvilke arbeider for narkotikarelaterte screening under forholdene vi har beskrevet, men ville ikke være egnet for langsiktige studier eller vekst kurver. I fremtiden, vil nye versjoner av analysen bli gjort med forskjellige reporter signaler, for eksempel luciferase, slik at flere bruker. Videre screening av større sammensatte biblioteker vil trolig gi romanen hemmere bestemt fusion trinn av viral replikasjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).