Biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterialien für Knochenregeneration
Summary
Die Anzahl der neue Biomaterialien für die Reparatur von großen Knochenläsionen entwickelt wird laufend erweitert, mit dem Ziel zu verbessern, Knochenheilung und Komplikationen im Zusammenhang mit Knochentransplantation überwinden. Hier präsentieren wir Ihnen eine multidisziplinäre Strategie zu Testzwecken vorklinischen Biokompatibilität von Biomaterialien für die Knochen-Reparatur.
Abstract
Großen Pseudarthrose Knochenbrüche sind eine große Herausforderung in der orthopädischen Chirurgie. Obwohl Auto und allogene Knochentransplantate ausgezeichnet zur Heilung solcher Läsionen sind, gibt es mögliche Komplikationen mit deren Einsatz. So entwickeln die Materialwissenschaftler synthetische, biokompatible Biomaterialien um diese Probleme zu überwinden. In dieser Studie stellen wir eine multidisziplinäre Plattform für die Bewertung der Biomaterialien für Knochen-Reparatur. Wir kombinieren Fachwissen aus Knochenbiologie und Immunologie, einschließlich in-vitro- Osteoklasten (OC) und Osteoblasten (OB) Assays und in Vivo Mausmodelle der Knochen-Reparatur, Immunogenität und Allergenität Plattform zu entwickeln. Wir zeigen, wie die Experimente durchführen, Zusammenfassung der Ergebnisse und Bericht über Biomaterial Biokompatibilität. Insbesondere haben wir OB Lebensfähigkeit, Differenzierung, und Mineralisierung und OC Lebensfähigkeit und Differenzierung im Rahmen der β-Tricalcium Phosphat (β-TCP) Festplatten getestet. Wir testeten ebenfalls einen β-TCP/Kollagen (β-TCP/C)-Schaum ist ein handelsübliches Material klinisch für Knochen-Reparatur in eine kritische Größe calvarial Knochen-defekt-Maus-Modell verwendet, um festzustellen, die Auswirkungen auf die frühe Phase der Knochenheilung. In parallelen Experimenten haben wir immun und allergische Reaktionen bei Mäusen ausgewertet. Unser Ansatz erstellt eine biologische Verträglichkeit Profil von Knochen Biomaterial mit einer Reihe von Parametern für die Vorhersage der Biokompatibilität von Biomaterialien für die Knochenheilung und Reparatur bei Patienten erforderlich.
Introduction
Knochen-Reparatur ist ein komplexer Prozess, der mit Hämatombildung, Entzündung beginnt, Kallus, Bildung und dann Umbau1,2. Knochenregeneration Potenzial ist jedoch beschränkt auf die Größe der Knochenbruch1,3. Zum Beispiel große Knochenbrüche verursacht durch ein Trauma, Krebs oder Osteoporose können nicht heilen und Pseudarthrose Knochenbrüche bezeichnet werden. Diese Knochenveränderungen erfordern oft Behandlung gesunde physiologische Knochen Reparatur und Regeneration zu fördern. Derzeit Autotransplantation und Allograft Knochen-Transplantation ist der Ansatz der Wahl4 mit 2,2 Millionen Knochen Ersatzverfahren jährlich5. Obwohl diese Verfahren eine hohe Erfolgsquote haben, möglicherweise gibt es Komplikationen, z. B. begrenzte Verfügbarkeit von Knochen, Infektion, Spender Website Morbidität und Ablehnung4. Neue Alternativen für das Bone Tissue Engineering werden gesucht, um diese Herausforderungen zu bewältigen.
Das Design von Biomaterialien, basierend auf natürlichen oder synthetischen Polymeren, Biokeramik oder Metalle in Verbindung mit Zellen und bioaktiven Moleküle ist auf dem Aufstieg6. Unser gegenwärtige Verständnis der physiologischen Knochen heilen und Heilung im Zusammenhang mit Biomaterialien hängt von mehrere Faktoren wie mechanische Eigenschaften und mehrere lokale und systemische Faktoren, einschließlich der Zellen aus dem Verkehr und Frakturstelle7 ,8,9. Biomaterialien für Knochenregeneration Osteogenicity und Osseointegration10 fördern und sind im Idealfall biokompatibel, biologisch abbaubar und poröse (Förderung der Zellwanderung, Sauerstoff und Nährstoffe). Sie müssen auch stark genug zur Unterstützung der Frakturstelle, Schmerzen zu lindern. Darüber hinaus sind entzündliche Faktoren erforderlich, um den Heilungsprozess einzuleiten. Jedoch wenn das Biomaterial übermäßige Entzündungen und allergische Reaktionen induziert, könnte dies zu begrenzen oder hemmen Knochenheilung11,12. So ist ein interdisziplinärer Ansatz notwendig, Biomaterialien entwickelt für Knochen-Reparatur zu bewerten.
In dieser Studie stellen wir eine prä-klinischen Bewertung der repräsentativen Materialien (1) Orthovita Vitoss, den Schaum, der im Handel erhältlichen Spongiosa Graft Ersatz bestehend aus Tricalcium Phosphat ist bestehend aus nanometergroßen reines β-tricalcium Phosphat (β-TCP) Teilchen und bovinen Kollagen Typ1 (C) (β-TCP/C-Schaum) und 2) β-TCP-Festplatten. Hier wir illustrieren Biokompatibilität testen diese Biomaterialien mit primären Osteoblasten (OB) und Osteoklasten (OC) assays, eine in Vivo Modell von Knochen zu reparieren, eine immunologische Bewertung bestehend aus in-vitro- Vermehrung der T-Lymphozyten und Produktion von Zytokinen und in Vivo Immunogenität und Allergenität, wie bereits berichtet13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir einen multidisziplinären Ansatz für die präklinische Bewertung der Biokompatibilität für repräsentative Biomaterialien für die Knochenregeneration und Reparatur entwickelt. Wir testeten die Antworten der OBs, OCs, und die in Vivo heilende Reaktion in einer kritischen Knochendefekt Modell bei Mäusen als auch in Vitro und in Vivo Immunantworten. Wir wollten zeigen, wie die Assays arbeiten und fassen die Daten und Schlussfolgerungen aus der Untersuchung von Biomaterialien. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Forschungsprojekt wird finanziell von der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms (RP7/2007-2013) unter Grant Agreement Nr. 263363.
Materials
| Biomaterials | |||
| β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) | Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures. | ||
| Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) | Orthovita | 2102-1405 | |
| Mouse osteoblast culture | |||
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| ALP assay buffer (2x) pH 10.4 | Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10. | ||
| Bone growth medium (BGM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin | ||
| Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate | Thermo Scientific | C7027 | Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. |
| Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | A13261 | |
| Collagenase type IV from clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DC protein assay kit II | Bio Rad | 5000112 | DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Steril-filter DMSO before usage. |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | E12020 | EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C9002 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MEM alpha medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| Osteogenic mineralization medium (MM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate | ||
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Sigma-Aldrich | B5655 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15400054 | Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free | VWR | L0970-500 | |
| Wash buffer | Add 0.05% Tween20 to 1x PBS. | ||
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 1.08816 | |
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G5422 | |
| 24-well suspension culture plate | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 96-well black plate | Greiner bio-one | 655076 | |
| 96-well transparent plate | Greiner bio-one | 655001 | |
| Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2-Incubator: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Cryovial 2 mL | Greiner bio-one | 122263 | |
| Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 10462200 | For sterile filtration of enzyme solution. |
| Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo | Epson | ||
| Infinite M200 Pro microplate reader | Tecan | ||
| Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL | VWR | 20901-505 | |
| Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL | VWR | 21008-959 | |
| Shaker Swip (orbital and horizontal) | Edmund Buehler | ||
| Shaking incubator GFL3032 | GFL | 3032 | |
| Single-use pipet: serum pipet | Greiner bio-one | 612301 | |
| Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps) | |||
| Tissue culture plate (10 cm) | Greiner bio-one | 664960 | |
| Mouse osteoblast-osteoclast co-culture | |||
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma-Aldrich | 17936 | 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%) |
| Acetone | VWR Chemicals | 22065.327 | |
| Bone growth medium (BGM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin | ||
| Distilled water | Carl Roth | 3478.4 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | VWR Chemicals | 20821.365 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Fast red violet LB salt | Sigma-Aldrich | F3381 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| MEM alpha Medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Naphthol AS-MX phosphate | Sigma-Aldrich | N4875 | |
| Osteoclast differentiation medium (DM) | α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 | ||
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Cayman Chemical Company | 9003016 | 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%) |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S8640 | |
| Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel) | |||
| TRAP buffer pH 5.0 | Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5. | ||
| Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free | VWR | L0970-500 | |
| 24-well suspension culture plate | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2-Incubator: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) | Buehler | ||
| Isomet low-speed saw | Buehler | ||
| Petri dish (6 cm) | Greiner bio-one | 628,161 | |
| Screw cap glass bottle 20 mL | Carl Roth | EXY4.1 | |
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Single-use pipet: serum pipet | Greiner bio-one | 612301 | |
| Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' | Henry Schein Animal Health | 9003340 | |
| Mouse calvarial defect model | |||
| Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) | Richter Pharma AG | ||
| Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) | Fresenius Kabi | ||
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4.5% buffered formalin | Carl Roth | 2213.6 | |
| Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL | B. Braun Surgical | 1050060 | |
| Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
| Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 9003630 | |
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Sterile disposable scalpel (Figur 20) | Henry Schein Animal Health | 9008957 | |
| Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 16929000 | |
| Handpiece type S-II | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 30056000 | |
| Trephine, diameter 4 mm | Hager&Meisinger GmbH | 229040 | |
| Irrigation tubing set 2.2 m | W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH | 4363600 | |
| Periosteal elevator 2 mm / 3 mm | Henry Schein Animal Health | 472683 | |
| Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm | Henry Schein Animal Health | 300715 | |
| In vitro immune responses | |||
| Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit | Sigma-Aldrich | 11647229001 | The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. |
| Concanavalin A (ConA) | MP Biomedicals | 150710 | |
| Culture medium splenocytes | RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids | ||
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| Gentamicin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15750037 | |
| Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Mouse IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
| Mouse IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
| Mouse INF-γ ELISA MAX Standard | BioLegend | 430801 | |
| Non-essential amino acids solution | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse | BD Bioscience | 555899 | |
| RPMI 1640 medium, HEPES | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 52400025 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 50 mL conical tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 96-well tissue culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| Centrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| Cell strainer 40 µm | BD Bioscience | 352340 | |
| Infinite M200 Pro microplate reader | Tecan | ||
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Sterile surgical instruments (forceps, glass slides) | |||
| High throughput intraperitoneal model | |||
| Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Mouse IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
| Mouse IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit | Thermo Scientific | 9990700 | For differential cell count. |
| Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Hemocytometer: Neubauer chamber | Carl Roth | PC72.1 | |
| Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Resorbable suture: Polysorb | Covidien | SL-5628 | |
| Shandon centrifuge for cytopsin | Thermo Scientific | ||
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 | |
| Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Subchronic subcutaneous model | |||
| Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Cold sterilant: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Eye ointment: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4.5% buffered formalin | Carl Roth | 2213.6 | |
| Heating plate: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Single-use sterile syringe 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Sterile gauze swabs | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder) | |||
| Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 | |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
- Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
- O’Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
- Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
- Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
- Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
- Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
- Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules?. Injury. 38, S11-S25 (2007).
- Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076 (2015).
- Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
- El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
- Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
- Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
- Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices–a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585 (2016).
- Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
- Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
- Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
- Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
- Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).
