Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Biologisk kompatibilitet profil på biomaterial för ben

doi: 10.3791/58077 Published: November 16, 2018

Summary

Antalet nya biomaterial konstruerad för att reparera stora ben lesioner växer kontinuerligt med syftet att förbättra benläkning och övervinna komplikationer i samband med ben transplantation. Här presenterar vi en tvärvetenskaplig strategi för prekliniska biokompatibilitet testning av biomaterial för ben reparation.

Abstract

Stora oläkta frakturer är en stor utmaning i ortopedisk kirurgi. Även om auto- och allogen bone Transplanterad läderhud är utmärkta för healing sådana lesioner, finns det potentiella komplikationer med deras användning. Således, materiella forskare utvecklar syntetisk, biokompatibla biomaterial för att övervinna dessa problem. I denna studie presenterar vi en tvärvetenskaplig plattform för utvärdering av biomaterial för ben reparation. Vi kombinerade expertis från Ben cellbiologi och immunologi att utveckla en plattform inklusive i vitro osteoclast (OC) och osteoblast (OB) analyser och i vivo musmodeller av ben reparation, immunogenicitet och allergiframkallande egenskaper. Vi visar hur du utför experimenten, sammanfatta resultaten och rapportera om biomaterial biokompatibilitet. I synnerhet testat vi OB livskraft, differentiering, och mineralisering och OC livskraft och differentiering inom ramen för β-trikalciumfosfat fosfat (β-TCP) diskar. Vi testade också en β-TCP/kollagen (β-TCP/C) skum som är ett kommersiellt tillgängliga material som används kliniskt för ben reparation i en kritisk och medelstora calvarial ben defekt musmodell för att fastställa effekter på den tidiga fasen av benläkning. I parallella experiment utvärderat vi immun och allergiska reaktioner hos möss. Vårt förhållningssätt genererar en biologisk kompatibilitet profil av ett ben biomaterial med en rad parametrar som är nödvändiga för att förutsäga biokompatibiliteten biomaterial används för läkning och reparation hos patienter.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ben reparation är en komplex process som börjar med hematom bildas, inflammation, callus bildandet och sedan remodeling1,2. Bone regeneration potentiella är dock begränsad till storleken på det ben fraktur1,3. Exempelvis stora benbrott orsakad av trauma, cancer eller benskörhet kan inte läka och kallas oläkta frakturer. Dessa ben skador kräver ofta behandling att främja friska fysiologiska ben reparation och förnyelse. För närvarande autograft och transplantatavstötning ben transplantation är att närma sig av val4 med 2,2 miljoner ben ersättare förfaranden årligen5. Om dessa förfaranden har en hög framgång, kan det uppstå komplikationer, till exempel begränsad tillgång på ben, infektion, givare webbplats sjuklighet och avslag4. Nya alternativ för ben vävnadsteknik söks att möta dessa utmaningar.

Utformningen av biomaterial baserat på naturliga eller syntetiska polymerer, biokeramer eller metaller i kombination med celler och bioaktiva molekyler är på uppgång6. Vår nuvarande förståelse av fysiologiska ben läkning och helande i samband med biomaterial beror på flera faktorer såsom mekaniska egenskaper och flera lokala och systemiska faktorer inklusive celler från cirkulation och frakturstället7 ,8,9. Biomaterial för ben förnyelse syftar till att främja osteogenicity och osseointegration10 och är ett idealiskt biokompatibel, biologiskt nedbrytbara och porösa (främjande av cellmigration, syre och näringsämnen). De behöver också vara tillräckligt stark för att stödja frakturstället för att lindra smärta. Dessutom krävs inflammatoriska faktorer att starta läkningsprocessen. Dock om biomaterial inducerar överdriven inflammation och allergiska reaktioner, kan detta begränsa eller hindra ben healing11,12. Således är ett tvärvetenskapligt tillvägagångssätt nödvändigt att utvärdera biomaterial som utvecklats för ben reparation.

I denna studie presenterar vi en preklinisk utvärdering av representativt material, 1) Orthovita Vitoss skum som är ett kommersiellt tillgängliga spongiöst Bengraftsubstitut bestående av trikalciumfosfat består av nanometer-storlek ren β-trikalciumfosfat fosfat (β-TCP) partiklar och typ1 bovint kollagen (C) (β-TCP/C skum) och 2) β-TCP diskar. Här vi illustrera biokompatibilitet testning av dessa biomaterial som använder primära osteoblast (OB) och osteoclast (OC) analyser, en in-vivo -modell av ben reparation, immunologiska bedömning bestående av in vitro- T lymfocyter spridning och cytokin produktion, och i vivo immunogenicitet och allergiframkallande egenskaper, som tidigare rapporterats13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Förfaranden som var klar med BALB/c-möss följer alla riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur av det österrikiska ministeriet för utbildning, vetenskap och forskning och godkändes av kommittén för etik i det österrikiska ministeriet för utbildning, vetenskap och forskning.

1. primära mus OB kultur

  1. OB isolering från neonatal mus calvaria med enzymatisk nedbrytning
    1. Avliva 1 – 2 dagars gamla neonatala valpar (60 totalt) genom halshuggning och placera huvuden i en petriskål med steril 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    2. Håll huvudet i nacken på halsen och skära huden bort med hjälp av steril sax. Incisionsfilm calvarium av piercing det (cirka 0,1 – 0,3 mm) med en sax som sedan infogas under calvarium bakhuvudet vid basen av skallen och skär längs calvarial kant sidled från baksidan till framsidan ovanför öronen och sedan abov e näsryggen (figur 1).
    3. Inkubera dissekerade calvaria med 8 mL filter steriliseras matsmältningen (300 enheter/mL kollagenas typ IV och 2.14 enheter/mL dispase II upplöst i α-minst viktigt medium (α-MEM)) i en 50 mL konisk tub vid 37 ° C i 10 min i en skakande inkubator på 200 shakes / min.
    4. Kassera de första supernatanten och upprepa matsmältningen proceduren tre gånger med 8 mL matsmältningen. Samla in supernatanten som innehåller celler efter varje matsmältningen steg och lägga till en 50 mL konisk tub. Lagra 50 mL koniska röret med celler i en ice vattenbad tills förfarandet för matsmältningen (ca 40 min) är klar.
    5. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° C, Aspirera supernatanten (med en Pasteur-pipett som bifogas en vakuumpump) och resuspendera i 40 mL ben odlingsmedium (BGM) innehållande α-MEM med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin lösning. Lägg sedan till 10 mL cellsuspension 4 vävnadsodling tallrikar (10 cm).
    6. Odla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 tills sammanflödet (2 – 3 dagar).
    7. Vid sammanflödet, sug ut det gamla mediet och tvätta vävnadsodling plattorna en gång med 1 x PBS (37 ° C). Sedan aspirera PBS och tillsätt 2 mL av 1 x trypsin lösning innehållande 0,5% etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) till varje 10 cm vävnadsodling platta.
    8. Inkubera plattorna vid 37 ° C och 5% CO2 för 5 min 4 kultur och kontrollera sedan plattorna med ett inverterat ljusmikroskop att se till att cellerna är fristående från plasten. Sedan överföra alla cellsuspensioner (totalt 8 mL) till en 50 mL konisk tub innehållande 10 mL färsk BGM. Tvätta varje platta med 5 mL av färska BGM och överföra till samma 50 mL koniska rör.
    9. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° C, Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 16 mL färsk BGM. Förbereda 16 nya 10 cm vävnadsodling plattor (uppdelning 1:4) som innehåller 9 mL av BGM. Tillsätt 1 mL cellsuspension till varje platta.
    10. Upprepa steg 1.1.6. till 1.1.8.
    11. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° C, Aspirera supernatanten och återsuspendera i 10 mL färsk BGM. Räkna cellerna och beräkna cellkoncentrationen.
      Obs: Denna procedur genererar cirka 7,5 – 8,3 x 105 celler/pup.
    12. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° C, Aspirera supernatanten och återsuspendera i frysning medium innehållande 10% dimetyl sulfoxid (DMSO), 40% α-MEM och 50% FBS. Överföra 1,5 mL cellsuspension till 2 mL cryovials för sammanlagt 2 x 106 celler per injektionsflaska.
    13. Blixt frysa injektionsflaskorna i flytande kväve för långsiktig lagring i en tank med flytande kväve. Använda cellerna inom ett år för att garantera full funktionalitet. Använda dessa primära OBs för att bedöma spridning (steg 1.2), differentiering (ALP analyser: steg 1.4., 1.5.) och mineralisering (steg 1.6.) i närvaro av biomaterial. Använd dessa celler för mognaden av ben-märg-härledda OC prekursorer i samtidig kultur (steg 2.3).
  2. OB proliferation assay
    1. Preinkubera 14 mm diameter β-TCP diskar i 1 mL av BGM i en 24-väl suspension kultur plattan vid 37 ° C och 5% CO2 för 24 h innan du lägger till primära OBs. Använd standard vävnadsodling plattor för kontroller och suspension kultur plattor för biomaterial prover till Undvik cell fastsättning till plast.
    2. Aspirera före inkubering mediet och sedan Återsuspendera primära mus OBs i BGM. Lägga till 4.4 x 104 OBs cm2 på förhand ruvade β-TCP diskarna i en 24-väl suspension kultur plattan och för kontrollgruppen, till en 24-väl vävnadsodling platta (1 mL per brunn). OBs fäster vid vävnadsodling plattan eller biomaterial.
    3. Inkubera under 14 dagar vid 37 ° C och 5% CO2. Under inkubationstiden, ändra mediet efter 2 – 3 dagar och tillsätt 1 mL färsk BGM till varje brunn.
    4. För att bedöma OB spridning, överföra β-TCP diskarna på dag 7 och 14 till nya brunnar utesluta signalerna från de celler som odlas på suspension kultur plattan.
    5. Aspirera gamla medium, tillsätt 0,5 mL av BGM (37 ° C) och inkubera kultur plattorna under 30 minuter vid 37 ° C och 5% CO2. Lägg sedan till 55 µL 10 x cell spridning reagens (1:10 utspädning) direkt in i kulturen väl. För blanks, förbereda tre brunnar innehållande 0,5 mL av BGM och 55 µL av 10 x cell spridning reagens. Inkubera alla plattor under 30 minuter vid 37 ° C och 5% CO2.
    6. Ta ut och överföra 150 µL av supernatanten från varje brunn i en 96-väl svart plåt och läsa fluorescens med excitation vid 560 nm och utsläpp vid 590 nm. Subtrahera de tomma avläsningarna från provet avläsningarna.
  3. OB differentiering och mineralisering analyser
    1. Preinkubera 14 mm diameter β-TCP diskar i 1 mL av BGM i en 24-väl suspension kultur plattan vid 37 ° C och 5% CO2 för 24 h innan du lägger till OBs. Använd standard vävnadsodling plattorna för kontroller och suspension kultur plattor för biomaterial prover att undvika cell fastsättning till plast.
    2. Aspirera före inkubering mediet och sedan Återsuspendera primära mus OBs i BGM. Lägga till 8,8 x 104 OBs cm2 på förhand ruvade β-TCP diskarna i en 24-väl suspension kultur plattan och för kontrollgruppen, till en 24-väl vävnadsodling platta (1 mL per brunn). OBs fäster vid vävnadsodling plattan eller biomaterial provet.
    3. Ersätta BGM med 1 mL av osteogent mineralisering medium (MM) innehållande BGM, 50 µg/mL askorbinsyra och 5 mM β-glycerofosfat 24 h efter tillsats av OBs och Inkubera under 14 dagar vid 37 ° C och 5% CO2. Ändra på medellång varje 2-3 dagar med 1 mL nyberedd MM till varje brunn.
  4. OB differentiering bedöms av alkaliskt fosfatas (ALP) aktivitet från cell lysates
    1. För att mäta ALP aktivitet på dag 7 efter tillsats av MM, sug ut odlingssubstratet från brunnarna och tvätta sedan med 1 mL steril 1 x PBS (37 ° C). Aspirera försiktigt PBS för att tillåta bifogade cellerna att förbli på vävnadsodling plast eller biomaterial och frysa plattorna vid-80 ° C.
    2. Efter 24 h (eller upp till 2 veckor), Tina den kontroll vävnadsodling och biomaterial suspension kultur plåt vid rumstemperatur (RT) att förbereda för OB Lys. För biomaterial prover, överföra β-TCP diskarna i en ny suspension kultur plattan att utesluta cellerna kopplad till plattan. Lägga till 75 µL per brunn av 1 x lyseringsbuffert cell båda plattorna. Skaka plattorna för 5 min på en shaker vid 400 shakes/min.
    3. Över cellen lysate till en 0,5 mL mikrocentrifug rör och centrifugera vid 300 x g under 6 minuter på RT att avlägsna skräp. Tillsätt 50 µL prov cell lysate supernatanten i en 96-väl svart plåt och Lägg sedan till 50 µL av en lösning som består av 200 µM 6,8-difluor-4-methylumbelliferyl fosfat (DiFMUP) fluorogenic substrat upplöst i 2 x ALP buffert (pH 10) per brunn. Ställa in två tomma brunnar med 100 µL av en 1:1 lösning innehållande 1 x cell lyseringsbuffert och 2 x ALP buffert.
    4. Förbereda 8 referensstandarder med 100 μL/brunn med den 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) allt från 0,5 till 200 μM upplöst i 1:1 lösning innehållande 1 x cell lyseringsbuffert och 2 x ALP buffert att generera en standard referenskurva.
    5. Inkubera den svarta plåten vid 37 ° C i 15 min och sedan läsa fluorescensen med excitation vid 358 nm och utsläpp på 455 nm. Subtrahera de tomma avläsningarna från referensstandarder och prov avläsningar.
    6. Normalisera ALP enzymaktiviteten från den cell-lysates till den totala mängden protein med en kolorimetrisk test för proteinkoncentration. Förbereda bovint serumalbumin (BSA) protein referensstandarder på ett intervall från 0,05 – 2,5 µg/µL upplöst i 1 x lyseringsbuffert cell att generera en standardkurva.
    7. Förbereda prov cell lysates och BSA protein standarder i dubbletter. Tillsätt 5 µL prov cellen lysat eller 5 µL av BSA protein standard i en plattan med 96 brunnar och Lägg sedan till 25 µL av reagens A' och 200 µL av reagens B. uppsättning upp två tomma brunnar med 5 µL 1 x lyseringsbuffert cell. Inkubera plattorna vid RT för 15 min och sedan läsa absorbansen vid 690 nm. Subtrahera de tomma avläsningarna från referensstandarder och prov avläsningar.
  5. OB differentiering bedöms av färgning ALP i cellkultur
    1. Fläcken ALP i odlade OBs dag 7 efter tillsats av MM på en kontroll vävnadsodling plattan och biomaterial i en suspension kultur plattan.
    2. Aspirera odlingssubstratet från brunnarna och ersätta det med 0,5 mL av 1 x PBS (37 ° C). Aspirera PBS och fixa cellerna genom inkubering i 0,5 mL 10% buffrad formalin på RT för 1 min.
    3. Sug ut de 10% buffrad formalin med en engångsbruk Pipettera och tillsätt 0,5 mL av tvättbuffert (0,05% Tween20 i 1 x PBS).
    4. Lös en 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfat/nitro blue tetrazolium (Beneluxkonventionen/NBT) substrattablett i 10 mL av ultrarent vatten och skaka tills helt upplöst. Lösningen skyddas från ljus och används inom 2 h.
    5. Aspirera tvättbufferten och ersätta med 0,5 mL Beneluxkonventionen/NBT substratlösning och inkubera plattan på RT i mörkret för 10 min. Aspirera färglösningen och ersätta med 0,5 mL av tvättbuffert.
    6. Överför de färgade β-TCP-diskarna till en ny brunn och skanna ALP-färgade plattorna med en konventionell flatbäddsskanner till rekord ALP färgning.
  6. OB mineralisering bedömas genom färgning med Alizarin Red S (ARS)
    1. Aspirera odlingssubstratet från brunnarna som innehåller primära OBs 14 dagar efter tillsats av MM och skölj två gånger med 0,5 mL av 1 x PBS på RT. Aspirera PBS och fixa cellerna genom att tillsätta 0,5 mL 10% buffrad formalin lösning på RT i 10 min.
    2. Aspirera på 10% buffrad formalin med en engångsbruk Pipettera och tvätta två gånger med 0,5 mL av ultrarent vatten.
    3. Till de fasta OBs, lägga till 0,25 mL av 40 mM ARS färglösningen (pH 4,2) upplöst i ultrarent vatten och inkubera plattan på RT för 10 min på en shaker på 100 shakes/min.
    4. Aspirera färglösningen med en engångsbruk Pipettera och skölj med 1 mL av ultrarent vatten. Upprepa detta steg 5 – 10 gånger för att ta bort ospecifik färgning.
      Obs: Skölja lösningen bör vara utan färg.
    5. Aspirera ultrarent vatten och tillsätt 1 mL kall PBS. Inkubera plattan på RT för 10 min på en shaker på 100 shakes/min.
    6. Aspirera PBS, överföra de färgade β-TCP-diskarna till en ny brunn och skanna plattorna med en flatbäddsskanner till rekord mineralisering.
    7. Tillsätt 0,25 mL 10% cetylpyridinklorid natriumklorid och inkubera plattan på RT för 15 min på en shaker på 100 shakes/min att extrahera ARS färgämnet.
    8. Överföra supernatanterna i en 1,5 mL rör och centrifugera vid 17 000 x g i 5 min på RT.
    9. Lägg 10% cetylpyridinklorid natriumkloridlösning extrakt av med en utspädningsfaktor på 1:10 – 1:20 och proverna (300 µL) till en plattan med 96 brunnar inklusive två tomma brunnar som innehåller endast 10% cetylpyridinklorid klorid.
    10. Förbereda 7 ARS referensstandarder alltifrån 4 till 400 µM genom att späda ut 40 mM ARS färgning lösning (pH 4,2) med 10% cetylpyridinklorid natriumkloridlösning för att generera en standardkurva.
    11. Tillsätt 300 µL referensstandarden i dubbletter i plattan med 96 brunnar.
    12. Läs absorbansen av proverna, tomma, och referens standarder på 520 nm.
    13. Subtrahera de tomma avläsningarna från referensstandarder och prov avläsningar.

2. mus OB-OC samtidig kultur att härleda mogen OCs

  1. Förberedelse och sterilisering av nötkreatur kortikala benet skivor
    1. Rengöra segment av ben från den omgivande vävnaden och ta bort trabekulärt ben och benmärg.
    2. Torra ben vid 50 ° C under 24 h.
    3. Skiva benet i mindre bitar och skär det i skivor (ca 300 – 350 µm tjock) med en låg hastighet såg med diamant klinga.
    4. Skär 300 – 350 µm skivor i kvadratisk diskar (1 cm2).
    5. Rengör ben diskarna (1 cm2), sätta dem i en låsbar glasflaska och fyll på med destillerat vatten. Överföra fyllda glasflaskan i ett ultraljudsbad och Sonikera för 5 min. Upprepa detta tre gånger.
    6. Häll av destillerat vatten, lägga 70% etanol och Sonikera i 5 min.
    7. Häll av 70% etanol och ersätta med 100% etanol.
      Obs: Förvara ben skivor i 100% etanol vid 4 ° C i upp till 4 veckor.
    8. Bestråla ben skivor med UV-ljus för 15 min på varje sida under sterila förhållanden. Lagra steriliserad ben skivor i en steril kultur plattan på RT tills vidare användning.
  2. Isolering av benmärgen OC prekursorer
    1. Euthanize naiva 8 – 12 veckors gamla BALB/c möss använder en intraperitoneal (IP) injektion av en lösning av 200 mg/kg ketamin och 24 mg/kg xylazin.
    2. Isolera benmärgen OC prekursorer från mus lårbenet och tibiae.
    3. Ta bort benen med steril sax från närmaste punkt på kroppen på höftleden, klippa benen vid knä och fotled lederna och ta bort den mjuka vävnaden med steril skalpell och pincett. Avskurna epifyser. Spola ut och stänga av märgen med 1mL BGM i en 6 cm steril petriskål använder en 27G nål bifogas en 1mL spruta för att erhålla en cellsuspension.
    4. Lägga till cellsuspensionen i en 50 mL konisk tub, tvätta den 6 cm petriskål med 5 mL av BGM och överföra till samma 50 mL koniska rör. Centrifugera vid 350 x g vid 4 ° C i 5 min. Omsuspendera cellerna i OC differentiering medium (DM) som innehåller BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 och 1 µM prostaglandin E2 (1 mL per brunn).
      Obs: En BALB/c mus ger tillräckligt antal OC prekursorer för en 24-väl kultur plattan.
  3. Beredning av mus OB-OC samtidig kultur med biomaterial
    1. Preinkubera 14 mm diameter β-TCP diskar eller ben av nöt skivor (1 cm2) i 1 mL av BGM i en 24-väl suspension kultur plattan vid 37 ° C och 5% CO2 för 24 h innan du lägger till cellerna.
      Obs: Ben av nöt segment är en fysiologisk substrat kontrollgrupp för att studera OC differentiering i närvaro av biomaterial.
    2. Lägg till 8,8 x 104 celler/cm2 för primära OBs upphängd i BGM på biomaterial eller kontroll ben i en 24-väl suspension kultur plattan eller till en 24-väl vävnadsodling tallrik. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 för 24 h.
      Obs: OBs fäst plasten eller biomaterial eller nötkreatur ben.
    3. Lägga till färska isolerade benmärgen OC prekursorer till 24 h odlade primära OBs och kultur vid 37 ° C och 5% CO2 i 5 dagar. Ersätta mediet med nylagade OC DM varannan dag. Sedan fläcken OCs för tartrat-resistenta syra fosfatas (TRAP) att utvärdera OC differentiering.
  4. OC differentiering bedöms av TRAP färgning
    1. För att karakterisera mogen Multinucleära OCs, erhålls från steg 2.3.3, sug ut odlingssubstratet från kontrollplattan vävnadsodling och biomaterial suspension kultur plattan och tillsätt 1 mL 1 x PBS (37 ° C). Aspirera PBS och fixa cellerna genom inkubering i 1 mL 10% buffrad formalin lösning vid RT i 10 min.
    2. Aspirera 10% buffrad formalin lösningen med en engångsbruk Pipettera och tillsätt 1 mL 1 x PBS på RT. Upprepa detta steg tre gånger, sedan aspirera PBS, ersätta med 1 mL av TRAP buffert (pH 5) och inkubera plattorna vid 37 ° C i 30 min.
    3. Aspirera fälla bufferten och tillsätt 1 mL av 1:1 aceton och 100% etanol. Inkubera plattan på RT 30 s. snabbt aspirera aceton-etanolen lösning med en engångsbruk Pipettera och helt torka plattorna vid RT.
    4. För FÄLLAN färgning lösning, förbereda en 10 mg/mL stamlösning naftol-AS-MX fosfat i N, N-dimetylformamid, Lös 0,6 mg/mL snabbt röd violett salt i FÄLLAN buffert och tillsätt 0,1 mL naftol-AS-MX fosfat stamlösning till 10 mL snabbt röd violett salt i FÄLLAN buffert.
    5. Tillsätt 1 mL fälla färgning lösning och inkubera plattan vid 37 ° C i 10 min, sedan aspirera FÄLLAN färgning lösning och tillsätt 1 mL av ultrarent vatten för att stoppa reaktionen.
    6. Överför de β-TCP diskar och ben av nöt skivor efter färgning i en ny brunn, iaktta röd färgade OCs med ett ljusmikroskop (förstoring: 10 X) och räkna upp FÄLLAN + mogen OCs med tre eller fler kärnor.

3. kritiska-storlek mus Calvarial defekt modell

  1. Injicera buprenorfin 0,1 mg/kg subkutant (s.c.) i 8 - vecka-gammal BALB/c-möss för analgesi.
  2. Söva möss med en blandning av 100 mg/kg ketamin och 5 mg/kg i.p. xylazin, lägga till en gel eller salva i ögonen för att hålla dem fuktiga och Placera musen på en värmeplattan vid 37 ° C under hela förfarandet att förhindra hypotermi. Bedöma anestesi djupet av tå och svans nypa.
  3. Raka päls på huvudet mellan öronen och rengör ytan med 7,5% povidon jod lösning och 70% etanol.
  4. Gör en mittlinjen sagittala snitt på toppen av skallen mellan öronen med en steril skalpell att exponera calvarium och ta bort den HUVUDSKÅLSHINNA bindväv ovan rätt parietala ben genom att skrapa den med en skalpell.
  5. Skapa en kritisk storlek defekt i höger parietala ben med en steril dental trephine med en diameter på 4 mm (2000 rpm) under konstant bevattning med normal saltlösning notch rätt parietala ben och skär genom ectocortex och vissa endocortex.
  6. För att förhindra skador på dura mater, Använd en liten periost hiss att bryta igenom de återstående endocortex, lyft calvarial benet försiktigt och ta bort den med pincett. Resulterande felet bör vara cirkulär och cirka 3,5 mm i diameter.
  7. Fyll calvarial felet med pre blöt (steril 1 x PBS på RT) β-TCP/C skum med pincett.
  8. Förbereda ett lämpligt antal åldersmatchade, simulerade negativa kontroller med en tom defekt.
  9. För att hålla biomaterial på plats, sätta 0,5 µL av vävnad lim på kanten av defekten på två motsatta punkter.
  10. Nära huden med en icke-resorberbar sutur.
  11. Ren alla kirurgiska instrument med kall steriliserande att upprätthålla sterila förhållanden innan du utför nästa operation på en sövda mus.
  12. För postoperativ behandling, placera djuren på en torr och ren värmeplattan vid 37 ° C i området kirurgi för lämplig övervakning under återhämtningsperioden. Övervaka andningsfrekvens, kroppstemperatur och färgen på slemhinnor och ögon varje 10 min tills de vaknar.
  13. Överföra drivs medvetet mössen i en bur med mat och vatten separerade från övriga djur tills full återhämtning. Injicera 0,1 mg/kg buprenorfin s.c. för postoperativa smärtstillande behandling två gånger per dag för 72 h. avkastning återhämtat sig helt möss till sina burar.
  14. För att bestämma effektiviteten av biomaterial, avliva möss i.p. med en lösning av 200 mg/kg ketamin och 24 mg/kg xylazin.
  15. På 8 – 12 veckor efter implantationen, halshugga euthanized musen med vass sax.
  16. Fix decapitated mus huvudet i 30 mL 4,5% buffrad formalin lösning 1-2 veckor att garantera full genomträngning av fixeringsvätskan i vävnaden.
  17. Överföra huvuden till 70% etanol för långsiktig lagring vid 4 ° C i upp till ett år.
  18. Använd mikro beräknas tomografi (microCT) eller standardiserade undecalcified histologiska tekniker att utvärdera ben. Det är möjligt att använda microCT skanning på efter döden prover med hög upplösning (90 kV, 4 min) i 2D och 3D sagittal och frontal flygplan.
  19. För undecalcified histologi, torkar huvuden i stigande kvaliteter av etanol och bädda in i glykol metylmetakrylat.
  20. Skär glykol metylmetakrylat-embedded block med en diamant såg och slipa avsnitten till en tjocklek av cirka 80 – 100 µm.
  21. Utvärdera Lévai Leivo färgade ben sektioner för att identifiera nya ben bildandet14.

4. in Vitro immunsvar

  1. Euthanize naiva 8 - vecka-gammal BALB/c möss i.p. med en lösning av 200 mg/kg ketamin och 24 mg/kg xylazin.
  2. Placera musen på dess högra sida, rakar pälsen på vänster sida och rengör huden över vänster sida av buken med 70% etanol.
  3. Göra en 10 mm lång och 1 mm djupt snitt i huden på musen på vänster sida posteriort efter revbenen över magen med steril sax.
  4. Öppna huden och sedan utsätta bukhinnan. Gör en 10 mm lång och mindre än 1 mm djupa snitt i bukhinnan med sax under sterila förhållanden.
  5. Tryck magen proximalt att exponera mjälte.
  6. Håll mjälte försiktigt med steril pincett och ta bort det genom att skära den vävnaden och fartyg som bifogas nedan det.
  7. Placera intakt mjälte i en 50 mL tub innehållande 10 mL kallt 1 x steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
  8. Förbered en enda cellsuspension av malning mjälte med 2 steril pincett eller 2 sterila glasskivor.
  9. Ta bort skräp genom passering genom en steril 40 µm cell SIL med kall 1 x PBS hjälp kolven i en 1 mL spruta.
  10. Centrifugera den enda cellsuspensionen vid 300 x g i 10 minuter vid 4 ° C i en 50 mL konisk tub, aspirera och kasta bort supernatanten. Sedan Återsuspendera cellpelleten i 5 mL lyseringsbuffert röda blodkroppar (RBC).
  11. Inkubera cellsuspensionen i 14 min på RT och stoppa reaktionen genom att lägga till 45 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium.
  12. Centrifugera cellerna efter cell Lys vid 300 x g i 10 minuter vid 4 ° C och sedan Kassera supernatanten.
  13. Återsuspendera splenocytes i RPMI medium innehållande 10% Värmeinaktiverade FBS, 1% penicillin-streptomycin lösning, 0.1% gentamicin, 0,2% ß-merkaptoetanol och 1% icke-essentiella aminosyror.
  14. Preinkubera β-TCP/C skum i en 96-väl steril kultur plattan som innehåller RPMI medium för 24 h vid 37 ° C och 5% CO2 innan cellen sådd.
  15. Lägg till splenocytes på titrerad siffror, t.ex., 1,25 x 105, 2,5 x 105 och 5 x 105/well till brunnar i en 96 brunnar vävnadsodling tallrik innehållande RPMI medium och tillsatser, med eller utan pre ruvade β-TCP/C skummet.
  16. Lägg till 10 µg/mL concanavalin en (Con A) löses i medium för totalt 100 µL per brunn till lämpliga brunnar och sedan Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 för 72 h.
  17. Mäta cellproliferation med en Bromdeoxiuridin (BrdU) analys. Tillsätt 10 µL per brunn BrdU märkning lösning på 48 h i cellkultur och sedan Inkubera plattan för en ytterligare 24 h.
  18. På 72 h, samla supernatanten och förvaras vid-20 ° C tills vidare användning.
  19. Tillsätt 200 µL per brunn fixering lösning till varje brunn och sedan Inkubera i 30 min på RT. Aspirera fixering lösningen. Tillsätt 100 µL per brunn arbetslösning anti-BrdU antikropp och inkubera i 90 min.
  20. Aspirera antikropp lösningen, skölj brunnarna tre gånger med 200 – 300 µL per brunn av tvättlösningen och avlägsna tvättlösningen.
  21. Tillsätt 100 µL substratlösning och inkubera i 3 – 10 min vid RT och Mät absorbansen vid 450 nm.
  22. Mäta interleukin-1β (IL-1β), interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4) och interferon-γ (IFN-γ) i insamlade supernatanterna med hjälp av en standard ELISA.

5. hög genomströmning Intraperitoneal modell

  1. Söva kvinnliga 6-8-veckors gamla BALB/c-möss med en blandning av 100 mg/kg ketamin och 5 mg/kg i.p. xylazin och lägga till en gel eller salva i ögonen för att hålla dem fuktiga och Placera musen på en värmeplattan vid 37 ° C under hela förfarandet att förhindra hypotermi. Bedöma anestesi djupet av tå och svans nypa.
  2. Raka buk päls och rengör med 7,5% povidon jod lösning och 70% etanol.
  3. Gör ett 8 mm lång mittlinjen snitt genom huden längs linea alba. Gör ett litet snitt i bukhinnan med en skalpell.
  4. Plats steril fosfatbuffrad Koksaltlösning indränkt β-TCP/C skum transplantat (2 x 2 x 2 mm3) in i bukhålan eller utan tillsats av material för åldersmatchade sham kontroll möss.
  5. Sutur bukhinnan och huden med absorberbara och icke-resorberbar sutur, respektive.
  6. Ren alla kirurgiska instrument med kall steriliserande att upprätthålla sterila förhållanden innan du utför nästa operation på en sövda mus.
  7. För postoperativ behandling, placera djuren på en torr och ren värmeplattan vid 37 ° C i området kirurgi för lämplig övervakning under återhämtningsperioden. Övervaka andningsfrekvens, kroppstemperatur och färgen på slemhinnor och ögon varje 10 min tills de vaknar.
  8. Överföra drivs medvetet mössen i en bur med mat och vatten separerade från övriga djur tills full återhämtning. Återgå fullt återställda möss till sina burar.
    Obs: Denna procedur inducerar minimal smärta. Postoperativa smärtstillande behandling är oftast inte nödvändigt. Om den drivs djur visar tecken på smärta, injicerar 0,1 mg/kg buprenorfin s.c. eller en annan lämplig smärtstillande läkemedel för smärtlindring.
  9. Avliva möss 7 dagar efter implantation, med en lösning av 200 mg/kg ketamin och 24 mg/kg i.p. xylazin
  10. På 7 dagar efter implantation, lavage i bukhålan med 1 mL spruta med en 25 G nål för sammanlagt 3 mL kall PBS genom att hålla musen huvudet och du för in nålen i den vänstra nedre buksmärta kvadranten och sikta proximalt.
    Obs: Peritonealvätska bör fritt av röda blodkroppar.
  11. Centrifugera peritoneal lavage vätskan vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° C och samla peritonealvätska ska förvaras vid-20 ° C för ELISA mätningar av IL-1β, IL-2 och IL-4 cytokiner.
  12. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 mL PBS räkna peritoneal cellerna med trypan blå på en hemocytometer.
  13. Cytocentrifuge cellsuspension på 5 x 105 celler på objektglas, tillåta bilderna ska torka och fläcken för en differential cell sammanräkning.
  14. Använder ett ljusmikroskop, räkna minst 300 celler totalt och skilja mellan makrofager, neutrofiler, eosinofiler och lymfocyter.

6. subkronisk subkutan modell

  1. Söva kvinnliga 6 – 8 veckors gamla BALB/c-möss med en blandning av 100 mg/kg ketamin och 5 mg/kg i.p. xylazin, lägga till gel eller salva i ögonen för att hålla dem fuktiga och Placera musen på en värmeplattan vid 37 ° C under hela förfarandet att förhindra hypotermi. Bedöma anestesi djupet av tå och svans nypa.
  2. Placera musen på ryggen, raka buk päls och rengör rakad ytan med 7,5% povidon jod lösning och 70% etanol.
  3. Gör ett 8 mm lång mittlinjen snitt genom huden längs linea alba i buken med hjälp av en skalpell och sedan implantat PBS indränkt biomaterial (2 x 2 x 2 mm3) under huden eller lägga till några material för åldersmatchade sham kontroll möss.
  4. Suturera huden med en icke-resorberbar sutur.
  5. Ren alla kirurgiska instrument med kall steriliserande att upprätthålla sterila förhållanden innan du utför nästa operation på en sövda mus.
  6. För postoperativ behandling, placera djuren på en torr och ren värmeplattan vid 37 ° C i området kirurgi för lämplig övervakning under återhämtningsperioden. Övervaka andningsfrekvens, kroppstemperatur och färgen på slemhinnor och ögon varje 10 min tills de vaknar.
  7. Överföra drivs medvetet mössen i en bur med mat och vatten separerade från övriga djur tills full återhämtning. Återgå fullt återställda möss till sina burar.
    Obs: Denna procedur inducerar minimal smärta. Postoperativa smärtstillande behandling är oftast inte nödvändigt. Om den drivs djur visar tecken på smärta, injicerar 0,1 mg/kg buprenorfin s.c. eller en annan passande analgetikum.
  8. När du är redo att undersöka implanteringsstället, avliva möss i.p. med en lösning av 200 mg/kg ketamin och 24 mg/kg xylazin.
  9. Åtta veckor efter implantationen, punktskatter implanteringsstället med omgivande vävnad (1 cm2).
  10. Fixa vävnaden i 4,5% buffrad formalin lösning över natten, bädda in i paraffin och skär i 4 µm sektioner.
  11. Fläcken 4 µm paraffin-inbäddat vävnadssnitt med Hematoxylin och Eosin (H & E) för inflammation eller Massons trikrom för kollagen nedfall och fibros.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att bedöma β-TCP för dess effektivitet som ett biomaterial för ben reparation, använde vi in vitro- och in-vivo screeningmetoder. För det första, Vi mätte OB Svaren till β-TCP diskar jämfört med baslinjen medium ensam kontroller. Figur 2 visar OB livskraft i svar till β-TCP diskar på 7 och 14 dagar av kultur. Cellernas viabilitet mätt från metaboliskt aktiva celler i kultur brunnarna var samma för OBs med medium i vävnadsodling plast samt med β-TCP diskar som anger att denna biomaterial varken öka eller undertrycka OB spridning.

För att ytterligare utvärdera OBs, mätte vi ALP aktivitet som markör för differentiering genom kvalitativa och kvantitativa metoder. Figur 2 illustrerar ALP enzymaktivitet i kultur brunnar efter 7 dagar av kultur. OBs i brunnarna med medellång ensam hade baslinjen ALP aktivitet, medan i optimal mineralisering medium (MM) OBs hade intensiva ALP färgning, återspeglar en hög nivå av OB differentiering. Däremot pläterade OBs på β-TCP diskar differentierade mindre än de OBs inkuberas i MM. I en kvantitativ analys var ALP koncentrationen 77% högre för brunnarna som innehåller MM jämfört med baslinjen medium ensam, medan ALP koncentration var 40% lägre i cellerna odlade på β-TCP diskar jämfört MM kontroller. Även om dessa resultat visar att de celler som odlas på β-TCP diskar differentierade mindre än de med optimala förhållanden av plast med MM, differentierade de tillräckligt på biomaterial.

En annan kritisk funktion av OBs är deras förmåga att inducera mineralisering, som är ett viktigt steg i benläkning. Vi färgade odlade OB cellerna med ARS efter 14 dagar och fann att mineralisering var högre för MM kontroller jämfört med OBs odlade i medium ensam och på β-TCP diskar i kultur wells (figur 2). När vi mätte ARS koncentrationen, fann vi att kontrollerna MM var mer än 45% högre än gruppen β-TCP. Dessa uppgifter illustrerar de OBs odlade på plast i närvaro av MM mogen, skilja och mineralize bättre än de med medium ensam och på β-TCP diskar.

För att avgöra hur OCs bemöta β-TCP diskar, använde vi en culturing teknik som OBs odlas tillsammans med benmärg OC prekursorer följt av undersökningen av OC morfologi. OB-OC samtidig kulturer var observerade på 5 dagar och skilde sig väsentligt mellan cellerna odlas på plast med OC DM och cellerna odlas på ben skivor och β-TCP. På plast, OCs var stor och utbredd medan OCs på fysiologiska substrat var mindre, mindre-utspridda och oregelbundet formade (figur 3). För att kvantifiera OCs, vi räknas upp FÄLLAN + OCs och fann att det var högre siffror när inkuberas med β-TCP (1755 ± 21,41 cm2) jämfört med vävnadsodling kontroller (1140 ± 15,71 cm2) och ben skivor (709 ± 59.69 cm2), vilket tyder på förbättrad OC differentiering på β-TCP diskar (figur 3).

För att bestämma en kommersiellt tillgänglig β-TCP/C skum i vivo, använde vi en kritisk storlek calvarial defekt hos möss. Vi visar representativa histologiska sektioner som bearbetas av en undecalcified histologiska teknik med glykol metylmetakrylat inbäddning och Lévai Laczko färgning. MicroCT och histologi kan användas för att utvärdera ny benbildning inom området defekt. Här visar vi ett exempel med histologiska sektioner i figur 4. När kirurgiskt inducerad ben defekten lämnades tomma (sham), vi observerade ett tunt lager som täcker hela felet, men inga betydande benbildning var närvarande vid 12 veckor post-åtgärden bekräftar att skapade benfraktur kritisk storlek. Däremot när felet innehöll β-TCP/C skum, det fanns β-TCP/C skum rester omgiven av tät fibrös vävnad inklusive vissa blodkärl och inflammatoriska celler överbrygga defekten området utan bevis för benbildning.

För att utvärdera svaret främmande kropp, bedömde vi immunologiska och allergiska reaktioner till biomaterial, med hjälp av ett in vitro- test. Figur 5 visar att när naiva splenocytes inkuberades med medium ensam eller med β-TCP/C skum, inte svarade naiv mjälte cellerna av frodas eller producera IL-2, IL-4 och IFN-γ cytokiner. Däremot i ConA som innehåller kulturer, cellproliferation och cytokin produktion ökade med undantag av IL-1β. Cell Svaren var opåverkad när Co odlade med ConA och β-TCP/C skum jämfört med ConA ensam, vilket indikerar att β-TCP/C skum varken ökat eller minskat i vitro svaren.

För att avgöra huruvida β-TCP/C skum inducerad ett immunsvar i vivo , vi implanteras det 1) intraperitonealt och uppmätta inflammatoriska celler grevar och cytokin koncentrationer i peritoneal lavage vätska och 2) subkutant och utvärderas inflammation och fibros på histologiska delar av implanteringsstället. I tabell 1avslöjar cellen differentiell i peritoneal lavage vätska att det totala antalet inflammatoriska celler var betydligt högre i β-TCP/C skum implanteras möss jämfört med sham kontroller. Dessutom fanns det ökade antalet alla celltyper. I figur 6Afinns det högre koncentrationer av IL-1β, IL-2 och IL-4 cytokiner i β-TCP/C skum jämfört med sham kontroller. I β-TCP/C skum s.c. implanteras möss observerade vi en inflammatorisk reaktion med främmande kropp jätteceller H & E-färgade sektioner (figur 6B) och tecken på fibros på Masson's Trichrome målat sektioner (figur 6 c) vid 8 veckor. Däremot hade implanteringsstället sham kontroller minimal inflammation och ingen fibros (figur 6 c).

Figure 1
Figur 1: Calvaria borttagning för primär OB cell isolering diagrammet. Diagrammet visar hur man tar bort den calvarium med 4 skär (röd streckad linje) med böjd sax. Det första snittet är vinkelrät mot höger (R) ögonhålan från X1 till X 2, och andra är vinkelrät mot vänster (L) ögonhålan från X3 till X 4. Tredje snittet är att avskilja calvarium framtill från X4 till X 2 och fjärde snittet är att skilja på baksidan från X3 till X 1. Calvarium är då fri att tas bort. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: β-TCP-inducerad in vitro- OB differentiering och mognad. OB livskraft och spridning på dag 7 och 14 för cellerna odlade i medelstora ensam (staplar) eller β-TCP (öppen bar) (medelvärde ± SEM; n = 3). ALP aktivitet kvantifiering av cell lysates och normalisering till proteinhalten (µM DIFMU/µg protein, medelvärde ± SEM, n = 3) med representativa bilder som illustrerar ALP-färgade kultur brunnar från dag 7. Mineralisering kvantifieras från ARS-färgade kulturer av en cetylpyridinklorid klorid extraktionen metod visas som koncentrationen av ARS (µM ARS, medelvärde ± SEM, n = 3) med representativa ARS-färgade kultur brunnar på dag 14. Grupper inkluderar Ben odlingsmedium ensam (BGM); Mineralisering medium (MM); Β-TCP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: β-TCP-inducerad i vitro OC differentiering. Representativa mikrofotografier Visa TRAP + multinationella dag 5 efter samtidig odling mus OBs och benmärgen OC prekursorer. Endpoint analys av TRAP + Multinucleära celler (multinationella) visar det absoluta antalet TRAP + multinationella företags (≥3 kärnor) per cm2 (menar ± SEM, n = 3) ***p < 0,001. Grupper inkluderar OC differentiering medium ensam (DM); Ben; Β-TCP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: In vivo utvärdering av β-TCP/C skum ben grafter i en kritisk och medelstora calvarial defekt modell. Icke-läkande calvarial defekter skapade 8 - vecka-gammal kvinnlig BALB/c (n = 3) möss med en 4 mm dental trephine. Behandling för ingår simulerad kontroll (tom defekt) och defekter behandlas med β-TCP/C skum. Representativa histologiska sektioner beredd på 12 veckor efter implantationen. Formalin-fasta glykol metylmetakrylat-embedded vävnadssnitt (80 – 100 µm) färgas med Lévai Laczko dye. Mikrofotografier visas på låg (vänster) och hög (höger) förstoring. Svarta trianglar indikera ben defekten. Svart * betecknar benvävnad och vitt * refererar till β-TCP/C skum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: β-TCP/C skum-inducerad i vitro cell spridning och cytokin produktion. Splenocytes från naiva BALB/c-möss odlade i medium ensam, med β-TCP/C skum eller ConA. Supernatant cellproliferation (BrdU) och produktion av IL-1β, IL-2, IL-4 och IFN-γ (medium ensam ●, ConA ○, β-TCP/C skum ■, β-TCP/C skum och ConA □). Spridning resultat presenteras som medelvärdet av tre exemplar prover (OD ± SEM) i BrdU analysen och medelvärdet av dubbla prover (pg/mL ± SEM) för cytokin koncentration från två oberoende experiment. p < 0,05 anses vara betydande för biomaterial vs. medium och biomaterial och ConA vs. ConA ensam. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: In vivo immunsvaret hos β-TCP/C skum ben grafter i en snabb hög genomströmning i.p. och subkronisk musmodell. (A) kvinnliga BALB/c-möss implanterats i.p. med β-TCP/C skum eller utan tillsats av material (sham). Sju dagar senare, peritoneal lavage analyseras för cytokin koncentrationer (data presenteras som menar cytokin koncentrationer pg/mL ± SEM). Dessa data är representativa för två oberoende experiment (n = 5). p < 0,05 anses som betydande än med placebo. (B-C) Honmöss BALB/c (n = 5) implanteras s.c. med β-TCP/C skum eller utan tillsats av material (sham). Vid 8 veckor efter implantationen, hud från de implantationsställen färgad med H & E (B) och Massons trikrom (C) för att utvärdera inflammation och fibros, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Sham Vitoss
Cell räknas x 106 (% av totala celler)
Makrofager 1,240 ± 0,051 (88.1) 3.262 ± 0.380 (70,4) p < 0,001
Eosinofiler 0,120 ± 0,011 (8,5) 1.181 ± 0.254 (25,5) p < 0,01
Neutrofiler 0,002 ± 0,001 (0,2) 0,029 ± 0,011 (0,6) ns
Lymfocyter 0,048 ± 0,020 (3.2) 0.148 ± 0,041 (3,5) ns
Totala celltal 1,410 ± 0,066 4.620 ± 0.452 p < 0,001

Tabell 1: In vivo immunsvar av β-TCP/C skum ben grafter i en snabb hög genomströmning i.p. musmodell. Kvinnliga BALB/c-möss var implanterade i.p. med β-TCP/C skum eller utan material (sham). Sju dagar senare peritoneal lavage var erhållits och analyseras för antalet inflammatoriska celler och differentiell blodkroppar (data presenteras som menar cell räknas ± SEM). Dessa data är representativa för två oberoende experiment (n = 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här visar vi en sektorsövergripande strategi för preklinisk utvärdering av biokompatibilitet för representativa biomaterial utvecklats för ben förnyelse och reparation. Vi testade svaren från OBs, OCs, och den i vivo helande reaktion i en kritisk ben defekt modell i möss som in vitro och i vivo immunsvar. Vi syftar till att demonstrera hur analyserna fungerar och sammanfatta data och slutsatser härrör från granskningen av biomaterial. Vi visar att vår strategi genererar en värdefull profil av ben biomaterial biokompatibilitet.

Primär cell analyser användes för att utvärdera OB och OC funktion. OBs ansvarar för benbildning och fysiologiska reparation. De måste förbli livskraftig, differentiera och inducera mineralisering. I denna studie visar vi hur du utför analyser för cellernas viabilitet, ALP och ARS som markörer av fysiologiskt differentierade celler med kapacitet att mineralize. Kontrollerna för analyserna ingår medium ensam, vilket ger en originalplan och osteogent mineralisering medium (MM), vilket optimerad differentiering och mineralisering av OBs på plast. Den senare gruppen var en referens som är standard för biomaterial. För utvärdering av OC, odlade vi samarbete OBs och benmärg-derived OC prekursorer, differentierade prekursorer till Multinucleära celler, målat dem med fälla, ett osteoklastisk enzym som ofta används för att identifiera OCs in vitro-15 och sedan räknas upp cellerna använder ljusmikroskop. Dessa analyser är state-of-the-art och kräver inte ändringar. Vi noterade dock en begränsning som avser kvaliteten på isolerade primära OBs att mineralize. Bevarade OBs lagras i flytande kväve och används inom ett år för optimalt resultat.

OB fastsättning och aktiviteten var högre vävnadsodling plast än på β-TCP diskarna testade. När vi bedömt OCs, observerade vi förväntade skillnaderna mellan svaret på plast och ben, vilket är den fysiologiska substrat16. I jämförelse inducerade ben och β-TCP liknande morfologiska förändringar. FÄLLAN assay uppräkning av OCs svar till β-TCP diskar visade att siffrorna var signifikant skillnad mellan ben skivor och β-TCP. Β-TCP inducerad högre OC differentiering än på ben skivor. För OC differentiering är TRAP en väletablerad assay. Det fanns inga betydande ändringar behövs i denna metod. Men för att få bästa resultat, är det viktigt att inte Inkubera cellerna för länge, eller alla celler av monocytic ursprung blir TRAP-positiv.

För att lösa in-vivo svaret, använde vi β-TCP/C skum som en exemplarisk biomaterial eftersom det innehåller β-TCP, som användes i in vitro- analyser och kollagen och främjar ben healing13. Även om β-TCP/C skum är kommersiellt tillgängliga och används kliniskt för ben reparation17,18, det är bara en av många olika typer av material som skulle vara intressant att studera, t.ex., biphasic kalciumfosfat ( hydroxyapatit/β-TCP) samt som demineraliserat mänskliga ben i dessa analyser avgöra hur biologiska svar skiljer sig mellan material. För in-vivo svar, vi implanteras β-TCP/C skum i en kritisk och medelstora calvarial ben defekt hos möss och 12 veckor senare bedömde histologi och visade skillnaderna jämfört med sham kontroller. Det är också möjligt att utvärdera svaren med microCT som ger kostnadsfri information19. Defekten i sham kontroll möss hade ingen betydande benbildning, som förväntat, medan β-TCP/C skum inducerade en inflammatorisk reaktion, fibros och angiogenes, vilket är bevis på den tidiga fasen av benbildning. Denna metod har visats tidigare i JOVE20. Vårt tillvägagångssätt skilde dock i att vi använde en modifierad ”hiss” teknik med en periosteal hiss för att minska risken för skadade dura mater av trephine. Vi resonerade att dura mater spelar en betydande roll i läkningsprocessen av calvarial defekter genom att producera Osteogena celler och osteoinduktiv faktorer3,21,22,23. Särskilt påverkar material implanteras, storleken på den defekt, och metod för att skapa felet ben regenerering av calvarial defekter. En annan ändring i förfarandet inblandade stabiliseringen av biomaterial i calvarial felet med en biokompatibel vävnad lim som används rutinmässigt kliniskt för tillslutning av sår. Denna ändring garanteras att materialet i området defekt inte skulle förskjutas under läkningen.

Inflammation reglerar den tidiga fasen av benläkning, men för mycket inflammation och allergiska reaktioner kan minska reparation11. Perfekt immunsvaret mot biomaterial är att initiera en inflammatorisk kaskad som främjar benbildning. Vissa biomaterial kan dock orsaka en främmande kropp svar leder till en rad inflammatoriska signaler som orsakar fibros eller allergisk sensibilisering. I våra studier, vi utvärderade immunsvaret för β-TCP/C skum och fann att det inte var giftigt för naiva mjältceller och inte störa T lymfocyter expansion eller fungera (cytokin sekretion) när tillsätts kulturer med ConA. Β-TCP/C skum inducerad inflammation i intraperitoneal experimenten, och det fanns vissa tecken på en ökning av eosinofili och makrofager med samtidig ökning av Th1 - och Th2-typ cytokiner. I experiment som subkutan implantation, β-TCP/C skum också inducerad inflammation, men det fanns inga bevis för kronisk, destruktiva inflammatoriska eller allergiska reaktioner, vilket tyder på att β-TCP/C skum är biokompatibel. Dessa modeller ger information om immunsvaret mot biomaterial. För det första, in vitro- modellen behandlar effekten av biomaterial på naiva immunceller i närvaro av en mitogen att bevisa att det inte finns någon dämpning av mitogena responsen orsakas av biomaterial. För det andra intraperitoneal modellen ger en snabb 7 dagars avläsning av typ av immunsvar, t.ex., allergiska och inflammation såsom typ av infiltration av inflammatoriska celler och cytokin profil. För det tredje den subkutana, subkroniska modellen illustrerar vävnad svaret under en längre period, möjliggör utvärdering av kronisk inflammation, fibros, antikroppsnivåerna var och kan användas för att testa upprepad implantation för immunologiskt minne svaren. Dessa modeller har tidigare publicerats och visas här utan några modifieringar13. Det är viktigt att det finns lämpliga negativa och positiva kontroller för dessa modeller. Vi föreslår att utföra alla tre modeller för att undvika begränsningar av varje metod. Medan de modeller som visas är väl etablerad i andra områden i immunologi, är metoden för att testa biomaterial nyligen.

Sammanfattningsvis ger ben och immun analyser en biologisk kompatibilitet profil på ett biomaterial. För ben ge OB och OC svar på biomaterial preliminära uppgifter som är nödvändiga innan du utför komplicerade och dyra djurförsök och att följa 3R-principen. Immunologiska in vitro- analyser lämna uppgifter om antigen korsreaktivitet och cytotoxicitet, vilket även utesluter ytterligare djurförsök. De snabba hög genomströmning experiment ger resultat på inflammatoriska och cytokin svar (t.ex., typ av T-lymfocyter Svaren), medan subkronisk modellen är användbar på grund av data på varaktigheten av inflammation och potential för skadlig fibros. Denna roman tvärvetenskaplig strategi som inkluderar ben och immunsvar på biomaterial erbjuder en utmärkt pre-klinisk bedömning av biokompatibilitet för framtida tillämpningar i fältet material.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta forskningsprojekt har fått finansiering från EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) under lån avtal nr 263363.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42, (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125, (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14, (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64, (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3, (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19, (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15, (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076 (2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89, (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47, (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106, (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31, (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49, (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585 (2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8, (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9, (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6, (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112, (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29, (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65, (6), 486-493 (1999).
Biologisk kompatibilitet profil på biomaterial för ben
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).More

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter