여기, 우리가 순진한 CD4 + T 세포, 순진한 CD4 + T 세포, THGM의 차별화의 격리를 포함 하 여에서 murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T 도우미 (THGM) 세포를 분화 하는 프로토콜을 제시 하 고 차별화 된 THGM 셀의 분석. 이 메서드는 규칙의 연구 및 THGM 세포의 기능에 적용할 수 있습니다.
Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T 도우미 (THGM) 셀 생산은 주로 인터페론 (IFN) γ 또는 인터 루 킨 (IL)-17 생산 하지 않고 GM-CSF를 분 비 하 고 발견 된다 새로 확인된 된 T 도우미 셀 하위 집합 면역 neuroinflammation에 필수적인 역할을 재생 합니다. Splenocytes의 단일 세포 현 탁 액에서 순진한 CD4 + T 세포 및 THGM 순진한 CD4 + T 세포에서 세포 생성의 격리 하는 방법 T 세포 중재 면역과 면역 질환의 연구에 유용한 기술 될 것 이다. 여기는 일리노이-7에 의해 추진 THGM 셀으로 마우스 순진한 CD4 + T 세포를 구분 하는 방법에 설명 합니다. 분화의 결과 세포내 cytokine cytometry, 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)와 함께 얼룩을 포함 하 여 다른 기술을 사용 하 여 cytokines 식의 분석에 의해 평가 되었다 고 효소 연결 된 immunosorbent 분석 (ELISA) 프로토콜을 사용 하는 THGM 차별화 설명 여기, 세포의 약 55 %IFNα 또는 IL-17의 최소한의 표현으로 GM-CSF를 표현. GM-CSF THGM 세포의 주된 표현 추가 GM-CSF, IFNα, 및 mRNA와 단백질 수준에서 IL-17의 발현의 분석에 의해 확인 되었다. 따라서,이 메서드는 순진한 CD4 + T 세포 T로 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다HGM에서 생체 외에서세포는 THGM 세포 생물학의 연구에 도움이 될 것입니다.
CD4 + T 도우미 (TH) 세포는 미생물 병원 체에 대 한 호스트 방어, 암 감시, 그리고 면역1,2,3중요 한 역할을가지고 면역 시스템의 필수적인 구성 요소입니다. T 세포 수용 체 (TCR) 활성화, 순진한 CD4 + T 세포는 TH1, TH2로 분화 될 수 있다, TH 17, 또는 규제 T (Treg) 세포 다른 cytokine milieus2,4, 의 영향 5. 최근, 주로 GM-CSF 생산, TH 세포의 새로운 하위 집합 확인 되었고 THGM6라는. THGM 세포의 분화는 신호 변환기의 활성화 및 전사 5 (STAT5)의 활성을 통해 일리노이-7에 의해 구동 됩니다. 다른 TH의 낮은 표현 하면서 GM-CSF의 큰 금액을 표현 하는 이러한 세포-세포 IFNγ 및 IL-176등 서명 cytokines. GM-CSF는 CD4 + T 세포 중재 neuroinflammation7,8의 개발에 중요 한 역할을 발견 했다. IFNγ-또는 IL-17-표현 autoreactive T 세포에 비해, GM-CSF 표현 T 세포는 이전 질병 발병과 높은 질병 심각도 야생-타입에 전송된 (WT) 마우스. 또한, Csf2-/-T 세포 하지 못했습니다 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) 유도 adoptively WT 받는 사람에 게 전송 후 IFNγ 또는 IL-17A 부족 한 T 세포 EAE7을 중재 하는 기능을 유지 하는 반면. 또한, 중화 항 체를 사용 하 여 GM-CSF의 봉쇄 ameliorated EAE 질병 심각도8. 또한, 마우스에서 T 세포에 STAT5의 결핍 EAE 개발6저하 THGM 세대에서 그리고, 따라서, 생쥐의 저항에서 결과. 이러한 연구 결과 면역 neuroinflammatory 질병에서 GM-CSF 표현 TH 세포의 중요성을 밑줄. 따라서, GM-CSF 표현 TH 순진한 CD4 + T 세포에서 세포를 분화 하는 방법을 구축 면역 neuroinflammation 및 T 세포 중재 면역 응답의 pathogenesis의 연구에서 중요 한 것입니다. 그러나, 프로토콜을 효율적으로 THGM 세포에서에서 생성 murine 순진한 CD4 + 설립 되지 않았습니다.
여기 우리 순진한 CD4 + T 세포에서 murine THGM 셀을 구분 하는 방법 제시. 이 프로토콜에서 마우스 비장 추출, 단일 세포 현 탁 액, CD4 긍정적인 선택, 정렬 (FACS), 형광 활성화 된 세포 및 TH 세포의 준비를 포함 하 여 모든 절차에 설명 감 별 법 및 분석입니다. 차별화 된 T 보조 세포 mRNA 수준에서 cytokine 식을 결정 하려면 양적 실시간 PCR에 의해 단일 세포 수준에서 cytokine 식을 결정 하려면 cytometry 결합 얼룩이 지는 세포내 cytokine에 의해 분석 되 고 단백질 수준에서 cytokine 식 평가 하 일 라 여. 이 메서드는 THGM EAE, GM-CSF, 병 인에 중요 한 역할 등 다양 한 조건 하에서 세포 생물학의 연구에 적용할 수 있습니다.
여기 우리는 생체 외에서 THGM 차별화의 마우스 순진한 CD4 + 세포, 메서드를 확인 하기 위해 차별화 된 세포의 분석에 의해 뒤에서 프로토콜을 설명 합니다. 노트, 비장 및 림프절 순진한 CD4 + T 세포 정화와 THGM 차별화에 대 한 사용할 수 있습니다. 세포내 cytokine 얼룩 cytometry 셀의 약 55% 보여주었다 결합에 의해 결정 하는 cytokine 식 THGM 상태 (그림 1A</stron…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 싱가포르 국립 대학교 건강 시스템 (T1-2014 년 10 월-12 및 T1-2015 년 9 월-10)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
10X ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
1ml syringe | Terumo | SS+01T | |
Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
50ml conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
15m conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
FACS tube | Corning | 352054 | |
24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
Recombinant Mouse IL-6 | R&D system | 406‑ML | |
recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |