Aqui, apresentamos um protocolo para diferenciar murino células auxiliares (THGM) T granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing de células T CD4 + de ingênuo, incluindo o isolamento de células T CD4 + de ingênuo, diferenciação de THGM, e análise de células THGM diferenciadas. Esse método pode ser aplicado aos estudos do regulamento e função das células THGM.
O fator de Granulócito-macrófago-colônia-estimulando (GM-CSF)-produzir células de T auxiliar (THGM) é um subconjunto de célula auxiliar de T recentemente identificado que predominantemente segrega GM-CSF, sem produzir o interferon (IFN)-γ ou interleucina (IL) -17 e encontra-se a desempenham um papel essencial no neuroinflammation auto-imune. Um método de isolamento de células T CD4 + de ingênua de uma suspensão de célula única de splenocytes e geração de células THGM de células T CD4 + de ingênuo seria uma técnica útil no estudo da imunidade mediada por células T e doenças auto-imunes. Aqui nós descrevemos um método que diferencia as células T CD4 + de ingênuo rato em células THGM promovidas pela IL-7. O resultado da diferenciação foi avaliado pela análise da expressão de citocinas, usando técnicas diferentes, incluindo citocinas intracelulares mancha combinada com citometria de fluxo, um quantitativo em tempo real cadeia da polimerase (PCR), e ensaios imunoenzimático (ELISA). Usando o protocolo de diferenciação THGM conforme descrito aqui, cerca de 55% das células expressa GM-CSF, com uma expressão mínima de IFNα ou IL-17. A expressão predominante de GM-CSF pelas células THGM foi confirmada pela análise da expressão de IFNα, GM-CSF e IL-17 a nível do mRNA e proteínas. Assim, este método pode ser usado para diferenciar ingênuo células T CD4 + THGM em vitro, células que serão úteis no estudo da biologia de pilha de THGM.
Células de CD4 + T auxiliar (TH) são componentes essenciais do sistema imunológico, tendo papéis cruciais na defesa do hospedeiro contra patógenos microbianos, na vigilância do câncer e em auto-imunidade1,2,3. Após a ativação do receptor (TCR) de células T, células T CD4 + de ingênuo podem ser diferenciadas em TH1, TH2, TH 17, ou regulamentar T (Treg) as células sob a influência de diferentes citocinas www.UniEthos.org.br2,4, 5. recentemente, um novo subconjunto de células TH , que produz predominantemente GM-CSF, foi identificado e nomeado THGM6. A diferenciação de células THGM é impulsionada por IL-7 através da ativação de um transdutor de sinal e um ativador de transcrição 5 (STAT5). Estas células expressam uma grande quantidade de GM-CSF, tendo uma baixa expressão de outros TH-célula assinatura citocinas como relato e IL-176. GM-CSF, verificou-se a desempenhar um papel crítico no desenvolvimento de CD4 + neuroinflammation mediada por células T7,8. Comparado ao relato – ou IL-17-expressando as células auto-reativas T, GM-CSF-expressando T células transferidos para o selvagem-tipo ratos (WT), causados um início de doença anterior e a maior severidade da doença. Além disso, as células T Csf2– / – não conseguiram induzir encefalomielite auto-imune experimental (EAE) depois enviaram transferidos para destinatários WT, Considerando que células T falta de relato ou IL-17A reteve a capacidade de mediar EAE7. Além disso, um bloqueio de GM-CSF, usando anticorpos neutralizantes amenizada EAE doença gravidade8. Além disso, uma deficiência de STAT5 em células T em camundongos resultou em uma geração THGM diminuída e, portanto, em uma resistência dos ratos a EAE desenvolvimento6. Estes resultados ressaltam a importância das células T GM-CSF-expressandoH na doença auto-imune MPTP. Assim, estabelecer um método para diferenciar as células T GM-CSF-expressandoH de células T CD4 + de ingênuo seria importante no estudo da patogênese de neuroinflammation auto-imune e respostas de imune mediada por células T. No entanto, um protocolo que eficientemente gera células THGM de murino naïve que CD4 + não foi estabelecida.
Aqui nós apresentamos um método que diferencia murino células THGM de células T CD4 + de ingênuo. Este protocolo descreve todo o processo, incluindo a extração do baço do mouse, a preparação de uma suspensão de célula única, a seleção positiva de CD4, a fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e a célula TH análise e diferenciação. As T auxiliar células diferenciadas são analisadas por citocinas intracelulares mancha combinada com citometria de fluxo para determinar a expressão de citocinas, a nível de célula única, por um PCR quantitativo em tempo real para determinar a expressão de citocinas no nível de mRNA, e por ELISA para avaliar a expressão de citocinas no nível de proteína. Esse método pode ser aplicado aos estudos de biologia de célula THGM sob várias condições, tais como a EAE, onde o GM-CSF desempenha um papel importante na patogênese.
Aqui descrevemos um protocolo de uma diferenciação de THGM em vitro de células de rato naïve CD4 +, seguida de uma análise das células diferenciadas para validar o método. Digno de nota, tanto o baço e linfonodos pode ser usados para ingênuo purificação de células T CD4 + e THGM diferenciação. A expressão de citocinas, determinada pela coloração de citocinas intracelulares combinado com citometria de fluxo mostraram que cerca de 55% das células foram induzidas a se tornar …
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi suportado por subvenções provenientes da Universidade Nacional saúde sistema de Cingapura (T1-2014 Oct-12 e T1-2015 Sep-10).
RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
10X ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
1ml syringe | Terumo | SS+01T | |
Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
50ml conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
15m conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
FACS tube | Corning | 352054 | |
24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
Recombinant Mouse IL-6 | R&D system | 406‑ML | |
recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |