Summary

Vitro Farklılaşma fare granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)-T yardımcı (THGM) hücreleri üreten

Published: September 10, 2018
doi:

Summary

Burada, fare granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T yardımcı (THGM) hücreleri yalıtım saf CD4 + T hücreleri, THGM, farklılaşma da dahil olmak üzere saf CD4 + T hücrelerden ayırt etmek için bir iletişim kuralı mevcut ve farklılaştırılmış THGM hücre analizi. Bu yöntem çalışmaları Yönetmeliğin ve THGM hücre işlevi uygulanır.

Abstract

Granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)-T yardımcı (THGM) hücresi üretim ağırlıklı olarak interferon (IFN) γ veya interlökin (IL) -17 üretmeden GM-CSF salgılar ve için bulunan yeni saptanan bir T yardımcı hücresi alt budur otoimmün neuroinflammation önemli bir rol oynamaktadır. Bir yöntem tecrit splenocytes bir tek hücreli askıya saf CD4 + T hücreleri ve THGM hücre üretimi saf CD4 + T hücreleri, T hücre-aracılı bağışıklık ve otoimmün hastalıklar içinde yararlı bir yöntem olacaktır. Burada THGM hücrelere IL-7 tarafından terfi fare saf CD4 + T hücreleri ayırır yöntemi açıklanmaktadır. Farklılaşma sonucu hücre içi sitokin akış sitometresi ile bir nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR), kombine boyama da dahil olmak üzere farklı yöntemlerle sitokinler ifade analizi tarafından değerlendirildi ve enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA). THGM farklılaşma Protokolü burada açıklandığı gibi kullanarak, hücreleri yaklaşık % 55’i IFNα veya IL-17 en az bir ifade ile GM-CSF ifade. GM-CSF THGM hücreleri tarafından baskın ifade daha fazla GM-CSF, IFNα ve IL-17 mRNA ve protein düzeylerinde ifade analizi tarafından doğrulandı. Böylece, bu yöntem saf CD4 + T hücreleri t ayırt etmek için kullanılabilirHGM hücreleri vitro, hangi THGM hücre biyolojisi çalışmada yararlı olacak.

Introduction

CD4 + T yardımcı (TH) hücreleri mikrobiyal patojenler karşı ana savunma, kanser gözetim ve otoimmünite1,2,3çok önemli rolleri olan bağışıklık sisteminin temel bileşenleridir. T hücre reseptör (TCR) etkinleştirme, üzerine saf CD4 + T hücreleri TH1, TH2 farklılaşmış, TH 17 veya düzenleyici T (Treg) farklı sitokin ni2,4, etkisi altında hücreleri. 5. son zamanlarda, ağırlıklı olarak GM-CSF üreten yeni hücre alt grubunu TH , tespit ve THGM6adında. THGM hücrelere farklılaşma sinyal dönüştürücü aktivasyonu ve bir aktivatör transkripsiyon 5 (STAT5) IL-7 tarafından tahrik edilmektedir. Bu hücreler diğer THdüşük bir ifade yaparken GM-CSF büyük miktarda hızlı-IFNγ ve IL-176gibi imza sitokinler hücre. GM-CSF CD4 + T hücre-aracılı neuroinflammation7,8gelişiminde önemli bir rol oynamaya bulundu. IFNγ – veya IL-17-ifade autoreactive T hücrelere kıyasla, GM-CSF-ifade T bir önceki hastalığı başlangıçlı ve daha yüksek hastalık şiddeti neden vahşi-türüne aktarılan (WT) fare hücreleri. IFNγ veya IL-17A eksik T hücreleri EAE7aracılık yeteneğini muhafaza, ancak buna ek olarak, Csf2– / – T hücreleri deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) ikna etmek WT alıcıya aktarılan adoptively sonra başarısız oldu. Ayrıca, GM-CSF nötralize antikorları kullanarak bir abluka EAE hastalık şiddeti8iyileştirmiştir. Ayrıca, STAT5 T hücrelerin farelerde eksikliği azalmış THGM üretimi ve bu nedenle, bir direnç farelerin EAE geliştirme6‘ sonuçlandı. Bu bulgular önemini GM-CSF-ifade TH hücre otoimmün neuroinflammatory hastalığında altını çiziyor. Böylece, saf CD4 + T hücreleri GM-CSF-ifade TH hücrelerden ayırt etmek için bir yöntem oluşturma otoimmün neuroinflammation ve T hücre-aracılı bağışıklık yanıtı patogenezinde çalışmada önemli olacaktır. Ancak, bir protokol bu verimli THGM hücreleri fare saf kurulmuştur CD4 + değil oluşturur.

Burada saf CD4 + T hücreleri fare THGM hücrelerden ayırır bir yöntem mevcut. Bu iletişim kuralı fareden dalak çıkarma, bir tek hücre süspansiyon, CD4 pozitif seçim, floresans aktif hücre (FACS) sıralama ve TH hücre hazırlanması da dahil olmak üzere tüm yordamı açıklar farklılaşma ve analiz. Farklılaştırılmış T yardımcı hücreleri tek hücre düzeyinde sitokin ifade mRNA düzeyinde belirlemek için nicel bir gerçek zamanlı PCR tarafından sitokin ifade belirlemek için akış sitometresi ile kombine boyama hücre içi sitokin tarafından incelenir ve protein düzeyinde sitokin ifade değerlendirmek için ELISA tarafından. Bu yöntem THGM hücre biyolojisi EAE, nerede GM-CSF patogenezinde önemli bir rol oynar gibi çeşitli koşullarda çalışmaları uygulanabilir.

Protocol

Bu protokol için kullanılan tüm fareler üzerinde C57BL/6 genetik arka plan vardı ve Singapur Ulusal Üniversitesi, patojen-Alerjik belirli koşullarda muhafaza. Tüm deneyler kurumsal hayvan bakım ve Singapur Ulusal Üniversitesi kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri kullanılarak yapıldı. 1. reaktif ve malzeme hazırlığı Fosfat tamponlu tuz (PBS) % 2 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) içeren 500 mL hazırlayın.<b…

Representative Results

İki 8-hafta-yaşlı erkek C57BL/6 fare izole naive CD4 + T hücreleri üç porsiyon ayrıldı. Hücrelerin bir kısmı açıklanan protokol sonrası THGM hücrelere farklı. Başka bir bölümü anti-IL-4 antikor (10 µg/mL) huzurunda bir THGM koşulda THGM farklılaşma Il-4 abluka etkisini test etmek için kültürlü. Son bölümü (3 µg/mL anti-CD3e, 1 µg/mL anti-CD28, 10 ng/mL TGFβ, 30 ng/mL Il-6, 10 µg/mL anti-IFNγ ve 10 µg/mL anti-IL-4) bir T…

Discussion

Burada bir iletişim kuralı yöntemi doğrulamak için farklılaştırılmış hücrelerin bir analizini tarafından takip fare saf CD4 + hücrelerden bir vitro THGM farklılaşma açıklanan. Not, dalak ve lenf bezleri saf CD4 + T hücre arıtma ve THGM farklılaşma için kullanılabilir. Hücre içi sitokin gösterdi ki hücreler yaklaşık % 55’i akış sitometresi ile kombine boyama tarafından belirlenen sitokin ifade indüklenen GM-CSF-ifade hücreleri (Şekil 1…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmada Singapur Ulusal Üniversitesi Sağlık sistemi (T1-2014 Ekim-12 ve T1-2015 Eylül-10) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

RPMI 1640 Biowest L0500-500
FBS Heat Inactivated Capricorn FBS-HI-12A
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
10x PBS 1st Base BUF-2040-10 Diluted to 1x PBS in sterile water
EDTA 1st Base BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK buffer Biolegend 420301 diluted in sterile water
cell strainer SPL Life Sciences 93070
CD4 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-201
2-Mercaptoethanol Sigma M7522
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-303
1ml syringe Terumo SS+01T
Centrifuge Eppendorf Eppendorf 5810R
Sony SY3200 cell sorter Sony Sony SY3200 cell sorter
50ml conical centrifuge tube Greiner Bio-One 210261
15m conical centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
FACS tube Corning 352054
24 well cell culture plate Greiner Bio-One 662160
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0041-82
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) eBioscience 12-0251-82
anti-human/mouse CD44 APC eBioscience 17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC eBioscience 11-0621-85
Neubauer-improved counting chamber Marienfeld 640010
Hyclone Trypan Blue Solution GE healthcare Life Sciences SV30084.01
microscope Nikon Nikon Elipse TS100
Purified anti-mouse CD3e antibody Biolegend 100314
Purified hamster anti-mouse CD28 BD Biosciences 553295
Purified Rat anti-mouse IFNγ   eBioscience 16-7312-85
Purified anti-mouse IL-4 Antibody Biolegend 504102
Recombinant Mouse IL-7 Protein R&D system 407-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D system 406‑ML
recombinant human TGF-beta R&D system 240-B-010
PMA Merck Millipore 19-144
Ionomycin Sigma I0634
GolgiPlug protein transport inhibitor BD Biosciences 51-2301KZ
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set eBioscience 88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE eBioscience 12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A Biolegend 506908
APC anti-mouse IFN-gamma Biolegend 505810
GO Taq qPCR master mix Promega A6002
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! invitrogen 88-7334-88
Mouse IL-17A Uncouted ELISA invitrogen 88-7371-22

References

  1. Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
  2. Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
  3. Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets…Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
  4. Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
  5. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
  6. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
  7. Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
  8. El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
  9. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
  10. Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
  11. Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).

Play Video

Cite This Article
Lu, Y., Fu, X., Zhang, Y. In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. J. Vis. Exp. (139), e58087, doi:10.3791/58087 (2018).

View Video