Summary

体外小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (gm-CSF) 的分化--生成 t 辅助器 (tHgm) 细胞

Published: September 10, 2018
doi:

Summary

在这里, 我们提出了一种区分小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子产生的 t 型CD4+ t 细胞, 包括天真的 CD4+ t 细胞的分离, th基因的分化和差异性 TH基因细胞的分析。该方法可用于转基因细胞的调节和功能研究.

Abstract

粒-巨噬细胞集落刺激因子 (gm-csf) 生产的 t 帮助器 (tHGM) 细胞是一个新发现的 t 辅助细胞子集, 主要分泌的 GM-脑脊液不产生干扰素 (干扰素) γ或白细胞介素 (IL)-17, 并发现在自身免疫性 neuroinflammation 中起重要作用。从单纯的 CD4+ t 细胞中分离出单纯的脾和 tH基因 CD4+ t 细胞, 是研究 t 细胞介导免疫和自身免疫性疾病的有效方法。这里我们描述了一种方法, 将小鼠天真 CD4+ t 细胞与 IL-7 促进的 tH基因细胞区分开来。用不同的方法分析细胞因子的表达, 包括细胞内细胞因子染色结合流式细胞术、定量实时聚合酶链反应 (PCR), 对分化结果进行评估, 并酶联免疫吸附测定法 (ELISA)。根据这里所描述的 THgm 分化协议, 大约55% 的细胞表达了 IFNα或 IL-17 的最小表达。通过对基因型脑脊液、IFNα和 IL-17在 mRNA 和蛋白质水平上表达的分析, 进一步证实了转基因脑脊液的主要表达。因此, 该方法可用于体外诱导单纯 CD4+ t 细胞与 th基因细胞的分离, 对转基因细胞生物学研究有一定的参考价值。

Introduction

CD4+ (tH) 细胞是免疫系统的重要组成部分, 在宿主防御微生物病原体、癌症监测和自身免疫性123中具有重要作用。在 t 细胞受体 (TCR) 激活, 天真的 CD4+ t 细胞可以被区分为t h1,t h2, th 17, 或调节 t (Treg) 细胞在不同的细胞因子环境传道2,4,5. 最近, 发现了一种主要生产 gm-CSF 的 th细胞的新子集, 并命名为 gm6。IL-7 通过激活信号传感器和转录激活剂 5 (STAT5) 来驱动 THGM 细胞的分化。这些细胞表达了大量的 GM-脑脊液, 同时低表达其他 TH细胞特征因子, 如 IFNγ和 IL-176。在 CD4+ T 细胞介导的 neuroinflammation78的发展中, 基因型脑脊液被发现发挥了关键作用。与 IFNγ或 IL-17-expressing 自身反应性 t 细胞相比, 转基因脑脊液表达 t 细胞转移到野生型 (小鼠) 导致早期疾病发作和更高的疾病严重性。此外, Csf2细胞没有诱导实验性自身免疫脑脊髓炎 (EAE) 后被过继转输转移到脑细胞受体, 而缺乏 IFNγ或 IL-17A 的 T 淋巴细胞保留了调解 EAE7的能力。此外, 使用中和抗体对 GM-CSF 的封锁改善了 EAE 疾病严重程度8。此外, 小鼠 t 细胞中 STAT5 的缺失导致了转基因一代的减少, 因此, 在小鼠对 EAE 发展6的抵抗力。这些发现强调了 GM-脑脊液表达 TH细胞在自身免疫性 neuroinflammatory 疾病中的重要性。因此, 建立一种从天真的 CD4+ t 细胞中鉴别 GM-脑脊液表达 tH细胞的方法, 对于研究自身免疫 neuroinflammation 和 T 细胞介导的免疫应答的发病机制具有重要意义。然而, 从小鼠天真的 CD4+ 有效地产生 TH基因电池的协议尚未建立。

在这里, 我们提出了一种方法, 区分小鼠 tHGM 细胞从天真的 CD4+ t 细胞。该协议描述了整个过程, 包括从小鼠中提取脾脏、单细胞悬浮液的制备、CD4 阳性选择、荧光活化细胞分选和 TH细胞。分化和分析。用细胞内细胞因子染色结合流式细胞仪对分化的 T 辅助细胞进行分析, 以确定单细胞水平的细胞因子表达, 采用定量实时 PCR 方法测定 mRNA 水平的细胞因子表达, 并通过 ELISA 对蛋白质水平的细胞因子表达进行评估。该方法可应用于 EAE 等不同条件下的转基因细胞生物学研究中, 其在发病机制中起着重要作用。

Protocol

所有在本议定书中使用的老鼠都是在 C57BL/6 的遗传背景下, 并被安置在新加坡国立大学特定的无病原体条件下。所有实验都使用新加坡国立大学机构动物保育和使用委员会批准的协议进行。 1. 试剂和材料制备 制备500毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 含2% 胎牛血清 (血清) 和1毫米乙二胺四乙酸 (EDTA)。注意: 在整个过程中保持缓冲区在冰的最佳效果。 准备50毫升完整的 …

Representative Results

从两个8周大的雄性 C57BL/6 小鼠中分离出的朴素 CD4+ T 细胞分为三部分。在描述的协议之后, 细胞的一部分被区分成 THGM 细胞。另一部分是在 thgm 条件下培养的 anti-IL-4 抗体 (10 µg/毫升), 以测试 IL-4 封锁的影响, 在分化的 thgm。最后一部分是培养在 TH17 分化条件 (3 µg/毫升 anti-CD3e, 1 µg/毫升 anti-CD28, 10 ng/毫升 TGFβ, 30 ng/毫升 IL-6, 10 µg/毫升反 IFNγ…

Discussion

在这里我们描述了一个从小鼠天真的 CD4+ 细胞的体外TH基因分化的协议, 其次是对分化细胞的分析, 以验证该方法。注意, 脾脏和淋巴结均可用于幼稚的 CD4+ t 细胞纯化和 tH基因的分化。细胞内细胞因子染色与流式细胞术相结合的细胞因子表达表明, 在 gm (图 1A) 下, 约有55% 的神经细胞被诱导成为 gm-脑脊液表达细胞。与 th17 分化条件下的细…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项研究得到新加坡国立大学卫生系统 (T1-2014 Oct-12 和 T1-2015 Sep-10) 赠款的支持。

Materials

RPMI 1640 Biowest L0500-500
FBS Heat Inactivated Capricorn FBS-HI-12A
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
10x PBS 1st Base BUF-2040-10 Diluted to 1x PBS in sterile water
EDTA 1st Base BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK buffer Biolegend 420301 diluted in sterile water
cell strainer SPL Life Sciences 93070
CD4 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-201
2-Mercaptoethanol Sigma M7522
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-303
1ml syringe Terumo SS+01T
Centrifuge Eppendorf Eppendorf 5810R
Sony SY3200 cell sorter Sony Sony SY3200 cell sorter
50ml conical centrifuge tube Greiner Bio-One 210261
15m conical centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
FACS tube Corning 352054
24 well cell culture plate Greiner Bio-One 662160
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0041-82
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) eBioscience 12-0251-82
anti-human/mouse CD44 APC eBioscience 17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC eBioscience 11-0621-85
Neubauer-improved counting chamber Marienfeld 640010
Hyclone Trypan Blue Solution GE healthcare Life Sciences SV30084.01
microscope Nikon Nikon Elipse TS100
Purified anti-mouse CD3e antibody Biolegend 100314
Purified hamster anti-mouse CD28 BD Biosciences 553295
Purified Rat anti-mouse IFNγ   eBioscience 16-7312-85
Purified anti-mouse IL-4 Antibody Biolegend 504102
Recombinant Mouse IL-7 Protein R&D system 407-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D system 406‑ML
recombinant human TGF-beta R&D system 240-B-010
PMA Merck Millipore 19-144
Ionomycin Sigma I0634
GolgiPlug protein transport inhibitor BD Biosciences 51-2301KZ
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set eBioscience 88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE eBioscience 12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A Biolegend 506908
APC anti-mouse IFN-gamma Biolegend 505810
GO Taq qPCR master mix Promega A6002
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! invitrogen 88-7334-88
Mouse IL-17A Uncouted ELISA invitrogen 88-7371-22

References

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Cite This Article
Lu, Y., Fu, X., Zhang, Y. In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. J. Vis. Exp. (139), e58087, doi:10.3791/58087 (2018).

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