Summary

In Vitro Diferenciación del Factor del Granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF) de ratón-producción de linfocitos de T (THGM)

Published: September 10, 2018
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para distinguir murino granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) linfocitos de células T CD4 + de ingenuo, incluyendo el aislamiento de las células CD4 + T de ingenuo, diferenciación de THGM, y Análisis de las células THGM diferenciadas. Este método puede ser aplicado a los estudios de la regulación y función de las células THGM.

Abstract

El factor del granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF)-producción de la célula de T helper (THGM) es un subconjunto de células helper T nuevamente identificado que predominantemente segrega GM-CSF sin producir interferón (IFN) γ o interleukin (IL) -17 y se encuentra a juega un papel esencial en la neuroinflamación autoinmune. Un método de aislamiento de ingenuo de células T CD4 + de una suspensión unicelular de esplenocitos y generación de células THGM de las células T CD4 + de ingenuo sería una técnica útil en el estudio de la inmunidad mediada por células T y enfermedades autoinmunes. Aquí describimos un método que distingue las de células T CD4 + ingenuo de ratón en células THGM promovidas por IL-7. El resultado de la diferenciación fue evaluado mediante el análisis de la expresión de citoquinas utilizando diferentes técnicas, entre ellas citoquinas intracelulares tinción combinada con citometría de flujo, una reacción en cadena en tiempo real cuantitativa de la polimerasa (PCR), y análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Utilizando el protocolo de diferenciación de THGM tal como se describe aquí, alrededor del 55% de las células expresan GM-CSF con una mínima expresión de IFNα o IL-17. La expresión predominante de GM-CSF de las células THGM más fue confirmada por el análisis de la expresión del GM-CSF, IFNα y IL-17 en los niveles de mRNA y proteína. Así, este método puede utilizarse para diferenciar ingenuo de células T CD4 + t cells GMH en vitro, que serán útiles en el estudio de la biología de la célula de THGM.

Introduction

De células T CD4 + helper (TH) son componentes esenciales del sistema inmune, teniendo papeles cruciales en la defensa del huésped frente a patógenos microbianos, en la vigilancia del cáncer y autoinmunidad1,2,3. Sobre la activación de células T del receptor (TCR), ingenuo de células T CD4 + se pueden distinguir en TH1, TH2, TH , reglamentarios o de 17 células de T (Treg) bajo la influencia de citocinas diferentes ambientes2,4, 5. recientemente, un nuevo subconjunto de células TH , que principalmente produce el GM-CSF, se identificó y nombró THGM6. La diferenciación de las células THGM es conducida por IL-7 a través de la activación de un transductor de señal y activador de la transcripción 5 (STAT5). Estas células expresan una gran cantidad de GM-CSF al mismo tiempo que una baja expresión de otros TH-célula citocinas firma como IFNγ y la IL-176. GM-CSF fue encontrado para desempeñar un papel crítico en el desarrollo de CD4 + neuroinflamación mediada por células T7,8. En comparación con las células autorreactivas T expresa IFNγ o con IL-17, GM-CSF-expresar T células transferido a tipo salvaje ratones (WT) causadas un inicio anterior de la enfermedad y mayor severidad de la enfermedad. Además, Csf2– / – células de T no pudieron inducir la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) después siendo transferido eventualmente a los destinatarios de la WT, mientras que las células T carente de IFNγ, IL-17A o retenido la capacidad de mediar EAE7. Por otra parte, un bloqueo de GM-CSF con anticuerpos neutralizantes mejoró EAE de severidad de la enfermedad8. Además, una deficiencia de STAT5 en células T en ratones resultó en una menor generación de THGM y, por tanto, en una resistencia de los ratones a EAE desarrollo6. Estos resultados subrayan la importancia de las células de T de GM-CSF-expresandoH en enfermedad autoinmune capensis. Por lo tanto, establecer un método para distinguir las células de T de GM-CSF-expresandoH de células T CD4 + de ingenuo sería importante en el estudio de la patogenia autoinmune neuroinflamación y la respuesta inmune mediada por células T. Sin embargo, un protocolo eficientemente genera células THGM de murino ingenuo que CD4 + no ha sido establecida.

Aquí presentamos un método que distingue las células de THGM murinas de células T CD4 + de ingenuo. Este protocolo describe el procedimiento entero, incluyendo la extracción del bazo de ratón, la preparación de una suspensión unicelular, la selección positiva de CD4, la célula activada por fluorescencia (FACS) de clasificación y la célula de TH diferenciación y análisis. Las T helper células diferenciadas, son analizadas por citoquinas intracelulares tinción combinada con citometría de flujo para determinar la expresión de citocinas a nivel unicelular, de una PCR cuantitativa en tiempo real para determinar la expresión de citoquinas a nivel de mRNA, y por ELISA para evaluar la expresión de citoquinas a nivel de la proteína. Este método puede ser aplicado a los estudios de Biología de la célula de THGM bajo varias condiciones, tales como EAE, donde GM-CSF juega un papel importante en la patogenesia.

Protocol

Todos los ratones utilizados en el presente Protocolo en el fondo genético de C57BL/6 y alojados en condiciones libres de patógenos específicas en la Universidad Nacional de Singapur. Todos los experimentos se realizaron utilizando protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad Nacional de Singapur. 1. reactivos y preparación de Material Preparar 500 mL de tampón fosfato salino (PBS) que contiene 2% de suero bovino fe…

Representative Results

Ingenua de células T CD4 + aisladas de dos ratones C57BL/6 machos de 8 semanas de edad se dividieron en tres porciones. Una porción de las células fue distinguida en las células de THGM siguiendo el protocolo descrito. Otra porción fue cultivado bajo una condición de THGM en presencia de anticuerpos anti-IL-4 (10 μg/mL) para probar la influencia de un bloqueo de la IL-4 en la diferenciación de THGM. La última parte fue cultivada bajo una condició…

Discussion

Aquí hemos descrito un protocolo de una diferenciación de THGM en vitro de las células del ratón ingenuo CD4 +, seguido de un análisis de las células diferenciadas para validar el método. De nota, bazo y ganglios linfáticos puede utilizarse para ingenuo CD4 + células de T de purificación y la diferenciación de THGM. La expresión de citocina determinada por citoquinas intracelulares tinción combinada con citometría de flujo mostró que alrededor del 55% de las células fueron i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por becas de la Universidad Nacional salud sistema de Singapur (Oct-12-2014 T1 y T1-2015 Sep-10).

Materials

RPMI 1640 Biowest L0500-500
FBS Heat Inactivated Capricorn FBS-HI-12A
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
10x PBS 1st Base BUF-2040-10 Diluted to 1x PBS in sterile water
EDTA 1st Base BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK buffer Biolegend 420301 diluted in sterile water
cell strainer SPL Life Sciences 93070
CD4 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-201
2-Mercaptoethanol Sigma M7522
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-303
1ml syringe Terumo SS+01T
Centrifuge Eppendorf Eppendorf 5810R
Sony SY3200 cell sorter Sony Sony SY3200 cell sorter
50ml conical centrifuge tube Greiner Bio-One 210261
15m conical centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
FACS tube Corning 352054
24 well cell culture plate Greiner Bio-One 662160
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0041-82
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) eBioscience 12-0251-82
anti-human/mouse CD44 APC eBioscience 17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC eBioscience 11-0621-85
Neubauer-improved counting chamber Marienfeld 640010
Hyclone Trypan Blue Solution GE healthcare Life Sciences SV30084.01
microscope Nikon Nikon Elipse TS100
Purified anti-mouse CD3e antibody Biolegend 100314
Purified hamster anti-mouse CD28 BD Biosciences 553295
Purified Rat anti-mouse IFNγ   eBioscience 16-7312-85
Purified anti-mouse IL-4 Antibody Biolegend 504102
Recombinant Mouse IL-7 Protein R&D system 407-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D system 406‑ML
recombinant human TGF-beta R&D system 240-B-010
PMA Merck Millipore 19-144
Ionomycin Sigma I0634
GolgiPlug protein transport inhibitor BD Biosciences 51-2301KZ
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set eBioscience 88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE eBioscience 12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A Biolegend 506908
APC anti-mouse IFN-gamma Biolegend 505810
GO Taq qPCR master mix Promega A6002
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! invitrogen 88-7334-88
Mouse IL-17A Uncouted ELISA invitrogen 88-7371-22

References

  1. Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
  2. Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
  3. Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets…Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
  4. Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
  5. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
  6. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
  7. Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
  8. El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
  9. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
  10. Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
  11. Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).

Play Video

Cite This Article
Lu, Y., Fu, X., Zhang, Y. In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. J. Vis. Exp. (139), e58087, doi:10.3791/58087 (2018).

View Video