सिंगल सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा Efferocytosis की ठहराव
Summary
Efferocytosis, अपोप्तोटिक कोशिकाओं के phagocytic हटाने, homeostasis बनाए रखने के लिए आवश्यक है और रिसेप्टर्स और संकेत रास्ते है कि मान्यता, समाई, और internalization कोशिकाओं के अपोप्तोटिक के लिए अनुमति देने के द्वारा की सुविधा है. साथ ही, हम efferocytosis के ठहराव और efferocytic संकेतन रास्ते की गतिविधि के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
efferocytosis के विनियमन का अध्ययन तरीकों कि सही अपोप्तोटिक कोशिकाओं की तेज मात्रा में और संकेतन और सेलुलर प्रक्रियाओं है कि नियंत्रण efferocytosis जांच करने में सक्षम है की आवश्यकता है । इस ठहराव अपोप्तोटिक कोशिकाओं के रूप में प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो सकता है अक्सर efferocytosed piecemeal कर रहे हैं, इस प्रकार necessitating तरीकों जो सही रूप से एक चित्रित लक्ष्य के efferocytosed भाग के बीच अपोप्तोटिक कर सकते हैं बनाम अवशिष्ट अनजाना सेलुलर टुकड़े. यहां उल्लिखित दृष्टिकोण दोहरे लेबलिंग दृष्टिकोण को सही ढंग से efferocytosis और efferocytes की efferocytic क्षमता जैसे मैक्रोफेज की गतिशीलता को बढ़ाता है । अपोप्तोटिक कोशिका के cytosol को सभी अपोप्तोटिक सेल-व्युत्पन्न सामग्रियों की निगरानी को सक्षम करने के लिए एक सेल ट्रैकिंग डाई के साथ लेबल है, जबकि अपोप्तोटिक सेल की सतह biotinylation आंतरिक और गैर-आंतरिक के बीच विभेद के लिए अनुमति देता है अपोप्तोटिक कक्ष भिन्न होते हैं. efferocytes की efferocytic क्षमता रहते है या निर्धारित कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियों को लेकर और आंतरिक लक्ष्य बनाम बंधे की मात्रा बढ़ाता है, के रूप में streptavidin धुंधला द्वारा विभेदित द्वारा निर्धारित किया जाता है । इस दृष्टिकोण ऐसे प्रवाह cytometry के रूप में तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है, अर्थात् गैर के सटीक विefferocytosed बनाम efferocytosed अपोप्तोटिक कोशिका भिन्न, जीने के द्वारा efferocytic गतिशीलता को मापने की क्षमता-सेल माइक्रोस्कोपी, और क्षमता की कोशिकाओं में सेलुलर संकेतन के अध्ययन करने के लिए फ्लोरोसेंट-transgenes लेबल व्यक्त । संयुक्त, इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तरीकों एक लचीला प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है कि सही efferocytic गतिविधि और सेलुलर संकेत efferocytosis के दौरान सक्रिय रास्ते पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए आधार के रूप में सेवा करते हैं ।
Introduction
Apoptosis, या क्रमादेशित कोशिका मृत्यु, एक अत्यधिक विनियमित शारीरिक प्रक्रिया है कि सबसे कोशिकीय जीवों में होता है और उनके विकास और homeostasis1के लिए महत्वपूर्ण है । सामांय सेल कारोबार और भ्रूण विकास में शामिल होने के अलावा, apoptosis ऊतकों से संक्रमित या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के उन्मूलन में सक्षम बनाता है और संक्रमण के जवाब में ट्रिगर किया जा सकता है, सूजन, कैंसर, और भी चिकित्सा हस्तक्षेप द्वारा जैसे रेडियोथेरेपी या स्टेरॉयड1. अपोप्तोटिक कोशिकाओं का पर्दाफाश “खाओ मुझे” उनके सेल सतह जो पेशेवर और गैर पेशेवर फ़ैगोसाइट की एक सीमा पर रिसेप्टर्स द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे है पर संकेत, सामूहिक रूप से “efferocytes” के रूप में जाना जाता है । इन रिसेप्टर्स की सगाई एक efferocytosis2,3के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के माध्यम से efferocyte द्वारा अपोप्तोटिक कोशिका के ऊपर उठाना और क्षरण लाती है । Phosphatidylserine सबसे अच्छा विशेषता खाने मुझे efferocytosis ड्राइविंग संकेत है । यह आम तौर पर प्लाज्मा झिल्ली के भीतरी पत्रक तक ही सीमित है, apoptosis के साथ एक लिपिड scramblase जो इस झिल्ली विषमता को बाधित सक्रिय, इस प्रकार सेल4सतह पर phosphatidylserine उजागर. Phosphatidylserine कुछ नॉन-अपोप्तोटिक कोशिकाओं की extracellular सतह पर पाया जाता है, जैसे परिपक्व मैक्रोफेज और एक्टिवेट प्लेटलेट्स । हालांकि, इन कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण efferocytosed नहीं कर रहे हैं “मुझे न खाओ” सिग्नल, जैसे CD47, अपने सेल सतह पर5,6,7. उजागर phosphatidylserine efferocytic रिसेप्टर्स efferocytes द्वारा व्यक्त की एक सरणी द्वारा मांयता प्राप्त है । phosphatidylserine करने के लिए इन रिसेप्टर्स के बंधन, या तो सीधे या opsonins की सहायता के माध्यम से, संकेत मार्ग है कि एक झिल्ली में अपोप्तोटिक कोशिका की समाई को बढ़ावा देने के vacuole efferosome8करार सक्रिय, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome endosomes और lysosomes है, जो आणविक efferosome acidify करने के लिए आवश्यक मशीनरी उद्धार और अपोप्तोटिक सेल कार्गो13,14नीचा के साथ अनुक्रमिक फ़्यूज़ । एक बार नीचा दिखाया, अपोप्तोटिक सेल सामग्री प्राप्त रीसाइक्लिंग endosome-एक प्रक्रिया है जो अपोप्तोटिक सेल-एंटीजन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं सीमा की तस्करी कर रहे हैं, और जो अपोप्तोटिक सेल13से पोषक तत्वों की वसूली के लिए अनुमति दे सकता है, 15. अपोप्तोटिक कोशिकाओं की ख़राब निकासी में efferocytosis परिणामों में विफलता; ये अस्पष्ट कोशिकाओं अंततः माध्यमिक परिगलन से गुजरना । इस प्रकार संक्रामक, भड़काऊ और स्व-प्रतिरक्षित रोगों की एक सीमा ड्राइविंग, extracellular वातावरण में सूजन कोशिकाओं जारी समर्थक भड़काऊ cytosolic सामग्री, रोगजनकों, और प्रतिजनों16,17। साथ में, apoptosis और efferocytosis मरने और मृत कोशिकाओं को हटाने की सुविधा और ऊतक homeostasis के रखरखाव के लिए अनुमति देते हैं ।
आणविक तंत्र अंतर्निहित efferocytosis की जांच विधियों कि अपोप्तोटिक सेल के एक स्पष्ट ठहराव प्रदान की आवश्यकता है । इस ठहराव तथ्य यह है कि इस तरह के endocytosis और phagocytosis18,19, efferocytosis के रूप में अंय कार्रवाई तंत्र के विपरीत बरकरार लक्ष्य कोशिका की समाई में परिणाम नहीं हो सकता है, piecemeal में जिसके परिणामस्वरूप से जटिल है के अपोप्तोटिक सेल ने efferocyte20. इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल में एक इन विट्रो efferocytosis परख है कि आंतरिक बनाम गैर व्यक्तिगत अपोप्तोटिक कोशिकाओं के आंतरिक भागों के सटीक विरेखांकन प्रदान करता है और तय की एक किस्म के साथ संयुक्त किया जा सकता है वर्णन-सेल और लाइव सेल माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण । पारंपरिक phagocytosis परख प्रयोग के अंत में phagocytic लक्ष्य के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी जोड़ने के क्रम में गैर-आंतरिक लक्ष्य है, जहां के रूप में हमारे विधि लेबलिंग से अलग है covalently के साथ अपोप्तोटिक लक्ष्य-से जुड़े बायोटिन21 , 22. जबकि अपोप्तोटिक सेल विशिष्ट एंटीबॉडी इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है, biotinylation दृष्टिकोण किसी भी प्रोटीन असर लक्ष्य के लिए अनुमति देता है लेबल और माध्यमिक एंटीबॉडी पार-जेट के साथ संभावित मुद्दों से बचा जाता है अगर immunostaining किया जाता है . विशेष रूप से, हम अपोप्तोटिक Jurkat कोशिकाओं है कि दोहरी गया है दोनों एक सेल ट्रैकिंग डाई और बायोटिन के साथ दाग की तैयारी रूपरेखा । सेल ट्रैकिंग डाई अपोप्तोटिक सेल के लिए अनुमति देता है व्युत्पंन सामग्री efferocytosis के दौरान ट्रैक किया जा करने के लिए, जबकि सतह biotinylation गैर से आंतरिक के भेदभाव के लिए अनुमति देता है efferocytosed अपोप्तोटिक कोशिकाओं के आंतरिक भागों । हम भी murine और मानव efferocytes, monocyte-व्युत्पन्न M2 मैक्रोफेज के उदाहरण के रूप में प्राथमिक सेल efferocytosis, और Jurkat के रूप में उपयोग के लिए कोशिकाओं efferocytic लक्ष्य के रूप में उपयोग के लिए 774.2 और THP-1 सेल लाइनों की संस्कृति और तैयारी का वर्णन । इन तरीकों को आसानी से अंय कोशिका लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है, कोशिका मृत्यु के किसी भी रूप (जैसे apoptosis, परिगलन और necroptosis) के दौर से गुजर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए, और माइक्रोन के आकार की नकल करने के लिए जो लिपिड कोटिंग्स के माध्यम से अपोप्तोटिक कोशिकाओं अनुकरण या लाइगैंडों के साथ कोटिंग ब्याज की एक efferocytic रिसेप्टर के लिए विशिष्ट.
इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विधि आमतौर पर23,24क्षेत्र में इस्तेमाल किया प्रवाह cytometry आधारित तरीकों पर कई फायदे हैं । द्वारा सीधे इमेजिंग phagocyte-अपोप्तोटिक सेल संपर्क, दोनों कुल और गैर आंतरिक अपोप्तोटिक सेल सामग्री के स्पष्ट लेबलिंग के साथ संयुक्त, efferocytosis के मात्रात्मक उपाय किया जा सकता है । इसके अलावा, पीएच असंवेदनशील fluorophores के उपयोग की सीमा ऐसी lysosomal पीएच में FITC और GFP प्रतिदीप्ति के दमन के रूप में कारकों को ढूंढने कि कुछ वैकल्पिक तरीकों25को मिला । अंत में, जबकि विस्तार से वर्णित नहीं है, इन तरीकों को efferocytes का उपयोग कर नियोजित किया जा सकता है फ्लोरोसेंट-लेबल transgenes, या पद निर्धारण immunostaining के साथ, संकेतन अणु गतिविधि और की निगरानी के ठहराव के लिए अनुमति देने के लिए efferocytosis के दौरान सेलुलर प्रक्रियाओं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विधियों इमेजिंग और गतिशील efferocytic प्रक्रिया के ठहराव सक्षम करें, दोनों निश्चित-कक्ष और लाइव-सेल दृष्टिकोण का उपयोग कर । इन तरीकों पर आमतौर पर कार्यरत प्रवाह cytometry-23,<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडा के संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था (CIHR) आपरेटिंग अनुदान-१२३४१९, प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा डिस्कवरी अनुदान ४१८१९४ परिषद, और एक ओंटारियो अनुसंधान और नवाचार के प्रारंभिक अनुसंधान के मंत्रालय बिहार को पुरस्कार । DGW प्रस्तुत छवियों के कुछ योगदान दिया, प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए और पांडुलिपि के लेखन के लिए; वह लिवरपूल विश्वविद्यालय से एक पंप भड़काना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया । CY एक वाणी स्नातक छात्रवृत्ति और CIHR एमडी द्वारा वित्त पोषित है/ अनुदान एजेंसियों के अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।
Materials
| RPMI 1640 Media | Wisent | 3500-000-EL | |
| DMEM Media | Wisent | 319-005-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| PBS | Wisent | 311-010-CL | |
| 18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72290-08 | Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture |
| Staurosporine | Cayman Chemical | 81590 | Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution) |
| Annexin V-Alexa 488 | ThermoFisher | R37174 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| CellTrace FarRed | ThermoFisher | C34572 | |
| CellTrace Orange | ThermoFisher | C34851 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| FITC-Streptavadin | ThermoFisher | SA1001 | |
| Lympholyte-poly cell sepration medium | Cedarlane Labs | CL5071 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL-4 | Peprotech | 300-25 | |
| J774.2 Macrophage Cell Line | Sigma-Aldrich | 85011428-1VL | |
| THP-1 Human Monocyte Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| Jurkat T Cell Line | ATCC | TIB-152 |
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