Kvantifisering av Efferocytosis av encellede fluorescens mikroskopi

Summary

Efferocytosis, phagocytic fjerning av apoptotisk celler, er nødvendig for å opprettholde homeostase og er tilrettelagt av reseptorer og signalveier at for anerkjennelse, engulfment og internalisering av apoptotisk celler. Her presenterer vi en fluorescens mikroskopi protokoll for kvantifisering av efferocytosis og aktiviteten til efferocytic signalveier.

Abstract

Studere regulering av efferocytosis krever metoder som er nøyaktig kvantifisere opptaket av apoptotisk celler og undersøke signalnettverk og cellulær prosessene som styrer efferocytosis. Denne kvantifisering kan være vanskelig å utføre apoptotisk celler er ofte efferocytosed stykkevis, dermed nødvendiggjør metoder som kan nøyaktig avgrense mellom den efferocytosed delen av en apoptotisk mål mot gjenværende unengulfed mobilnettet fragmenter. Tilnærmingen skissert heri utnytter dual-merking tilnærminger til å tallfeste nøyaktig dynamikken i efferocytosis og efferocytic antall efferocytes som makrofager. Stoffer til apoptotisk-cellen er merket med en celle-sporing fargestoff aktivere overvåking av alle apoptotisk celle-avledet materiale, mens overflaten biotinylation apoptotisk cellen tillater differensiering mellom internalisert og ikke-internalisert apoptotisk celle fraksjoner. Efferocytic kapasitet på efferocytes bestemmes av tar fluorescerende bilder av live eller fast celler og kvantifisere mengden bundet versus internalisert mål, som atskilte av streptavidin flekker. Denne tilnærmingen gir flere fordeler sammenlignet med metoder som flowcytometri, nemlig nøyaktig avgrensning av ikke-efferocytosed mot efferocytosed apoptotisk celle fraksjoner, muligheten til å måle efferocytic dynamics live-celle mikroskopi, og kapasitet til å utføre studier av mobilnettet signalering i celler som uttrykker fluorescently-merket effekter av transgener. Kombinert, tjene metodene som er nevnt i denne protokollen som grunnlag for en fleksibel eksperimentelle tilnærming som kan brukes til nøyaktig kvantifisere efferocytic aktivitet og undersøke mobilnettet signalveier aktive under efferocytosis.

Introduction

Apoptose, eller programmert celledød, er en sterkt regulert fysiologisk prosess som skjer i de fleste multicellular organismer og er avgjørende for deres utvikling og homeostase¹. I tillegg til å være involvert i normal celle omsetning og embryonale utvikling, apoptose gjør fjerning av infiserte eller skadede celler fra vev og kan utløses svar på infeksjon, betennelse, kreft, og også av medisinske tiltak for eksempel strålebehandling eller steroider¹. Apoptotisk celler avsløre “spise-meg” signaler på celleoverflaten deres som gjenkjennes av reseptorer på en rekke profesjonelle og ikke-profesjonell phagocytes, kollektivt referert til som “efferocytes”. Engasjement i disse reseptorene induserer opptak og nedbrytning av apoptotisk cellen ved efferocyte gjennom en prosess som kalles efferocytosis^2,3. Fosfatidylserin er best preget spise-meg signal kjøring efferocytosis. Det er vanligvis begrenset til indre heftet av plasma membranen, med apoptose aktivere en lipid scramblase som forstyrrer denne membranen asymmetri, dermed utsette fosfatidylserin på celle overflaten⁴. Fosfatidylserin finnes på ekstracellulære overflaten av noen ikke-apoptotisk celler, for eksempel eldre makrofager og aktivert blodplater. Disse cellene er imidlertid ikke efferocytosed av «ikke spise meg» signaler, for eksempel CD47, på deres cellen overflaten^5,6,7. Utsatte fosfatidylserin gjenkjennes av en rekke efferocytic reseptorer uttrykt av efferocytes. Binding av disse reseptorene til fosfatidylserin, aktiverer enten direkte eller ved hjelp av opsonins, signalveier som fremmer engulfment til apoptotisk-cellen i en membran-bundet vacuole kalt efferosome^{8, 9 , 10 , 11 , 12}. efferosome sikringer sekvensielt med endosomes og lysosomer, som leverer den molekylære maskineriet å surheten i efferosome og svekke apoptotisk cellen Last^13,14. Når degradert, apoptotisk celle-avledet materiale smugles til gjenvinning endosome – en prosess som begrenser immunreaksjoner mot apoptotisk celle-avledet antigener, og som kan tillate for utvinning av næringsstoffer fra den apoptotisk celle^{13, 15}. Feil i efferocytosis fører til svekket klarering av apoptotisk celler. disse innskuddet cellene gjennom til slutt sekundære nekrose. Nekrotisk celler slipper pro-inflammatoriske cytosolic innholdet, patogener og autoantigens i det ekstracellulære miljøet, dermed kjørte en rekke infeksiøs, provoserende og autoimmune sykdommer^16,17. Sammen apoptose og efferocytosis lette fjerning av døende og døde celler og tillate for vedlikehold av vev homeostase.

Undersøker molekylære mekanismer underliggende efferocytosis krever metoder som gir en klar kvantifisering av apoptotisk celle opptak. Denne kvantifisering er komplisert av det faktum at i motsetning til andre opptaket mekanismer som endocytose og fagocytose^18,19, efferocytosis ikke kan resultere i engulfment av intakt målcellen, noe som resulterer i stykkevis opptaket apoptotisk cellen av efferocyte²⁰. Protokollen beskrevet her beskriver i vitro efferocytosis analysen som gir nøyaktige avgrensning av den internalisert versus ikke-internalisert deler av personlige apoptotisk celler og kan kombineres med en rekke fast-celle og Live-celle mikroskopi tilnærminger. Tradisjonelle fagocytose analyser legge antistoffer spesifikke phagocytic målet på slutten av eksperimentet for å merke ikke-internalisert mål, mens vår metode forskjellig merking apoptotisk målet med covalently er koblet biotin^{21 , 22}. mens apoptotisk celle spesifikke antistoffer kan brukes i denne analysen biotinylation tilnærmingen gir noe protein-bærende mål merkes og unngår potensielle problemer med sekundær antistoff kryssreaktivitet hvis immunostaining er utført . Spesielt skissere vi utarbeidelsen av apoptotisk Jurkat celler som har vært dobbelt-farget med både celle sporing fargestoff og biotin. Cellen sporing fargestoff tillater apoptotisk celle-avledet materiale sporet under efferocytosis, mens overflaten biotinylation tillater diskriminering av internalisert fra ikke-internalisert deler av efferocytosed apoptotisk celler. Vi beskriver også kultur og utarbeidelse av J774.2 og THP-1 linjer for bruk som murine og menneskelig efferocytes, monocytt-avledet M2 makrofager som et eksempel på primære cellen efferocytosis og Jurkat celler for bruk som efferocytic mål. Disse metodene kan lett brukes på andre linjer eller primære celler, målcellene gjennomgår noen form for celledød (f.eks apoptose, nekrose og necroptosis) og mikron-størrelse imiterer som simulere apoptotisk celler gjennom lipid belegg eller belegg med ligander gjelder for en efferocytic reseptor rundt.

Metoden skissert i denne protokollen har flere fordeler sammenlignet med flyt cytometri basert metoder som vanligvis brukes i feltet^23,24. Ved direkte imaging phagocyte-apoptotisk celle samhandling, kombinert med Fjern merking av både total og ikke-internalisert apoptotisk celle materiale, kan kvantitative tiltak av efferocytosis gjøres. Videre begrenser bruk av pH-ufølsom fluorophores forvirrende faktorer som undertrykkelse av FITC og GFP fluorescens ved lysosomale pH som forundrer noen alternative metoder²⁵. Til slutt, mens ikke beskrevet i detalj, disse metodene kan brukes med efferocytes uttrykke fluorescently-merket effekter av transgener, eller med post fiksering immunostai-, å tillate for kvantifisering Signalering molekyl aktivitet og oppfølging av den cellulære prosesser under efferocytosis.

Protocol

Samling av blod fra friske frivillige ble godkjent av helse vitenskap forskning etikk styret av University of Western Ontario. Venipuncture ble utført i samsvar med retningslinjene i Tri-rådet policyutsagnet på menneskelig forskning. 1. kultur og utarbeidelse av THP-1 Monocyte celle linjen Kultur THP-1 reaksjoner som en suspensjon kultur i T25 flasker på 37 ° C + 5% CO2. Celler bør dyrkes i 5 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% fosterets Bovine …

Representative Results

Natten kultur av Jurkat celler med 1 µM staurosporine gir apoptose av > 95% av celler som kan bekreftes med Annexin V flekker (figur 1). Andre celletyper, kan brukes av disse eksperimentene, men konsentrasjonen av staurosporine og staurosporine behandling varighet må være optimalisert for hver celle linje. For pålitelig gjenkjenning og kvantifisering av efferocytosis, > 80% av cellene skal apoptotisk før du legger dem til i efferocytes. Andre indusere av…

Discussion

Metodene som er nevnt i denne protokollen Aktiver bildebehandling og kvantifisering av dynamisk efferocytic prosessen, bruke både fast-celle og live-celle tilnærminger. Disse metodene har flere fordeler sammenlignet med vanlig ansatt flyt cytometri-baserte metoder^23,24. Bruk av innsiden ut flekker med fast prøver gir en mer robust og nøyaktig kvantifisering av hastighet og omfanget av efferocytosis-faktisk mange flyt cytometri-baserte metoder bare etiketten a…

Materials

RPMI 1640 Media	Wisent	3500-000-EL
DMEM Media	Wisent	319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness	Electron Microscopy Sciences	72290-08	Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine	Cayman Chemical	81590	Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium	Cedarlane Labs	CL5071
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 Macrophage Cell Line	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line	ATCC	TIB-202
Jurkat T Cell Line	ATCC	TIB-152