Summary

Kvantifisering av Efferocytosis av encellede fluorescens mikroskopi

Published: August 18, 2018
doi:

Summary

Efferocytosis, phagocytic fjerning av apoptotisk celler, er nødvendig for å opprettholde homeostase og er tilrettelagt av reseptorer og signalveier at for anerkjennelse, engulfment og internalisering av apoptotisk celler. Her presenterer vi en fluorescens mikroskopi protokoll for kvantifisering av efferocytosis og aktiviteten til efferocytic signalveier.

Abstract

Studere regulering av efferocytosis krever metoder som er nøyaktig kvantifisere opptaket av apoptotisk celler og undersøke signalnettverk og cellulær prosessene som styrer efferocytosis. Denne kvantifisering kan være vanskelig å utføre apoptotisk celler er ofte efferocytosed stykkevis, dermed nødvendiggjør metoder som kan nøyaktig avgrense mellom den efferocytosed delen av en apoptotisk mål mot gjenværende unengulfed mobilnettet fragmenter. Tilnærmingen skissert heri utnytter dual-merking tilnærminger til å tallfeste nøyaktig dynamikken i efferocytosis og efferocytic antall efferocytes som makrofager. Stoffer til apoptotisk-cellen er merket med en celle-sporing fargestoff aktivere overvåking av alle apoptotisk celle-avledet materiale, mens overflaten biotinylation apoptotisk cellen tillater differensiering mellom internalisert og ikke-internalisert apoptotisk celle fraksjoner. Efferocytic kapasitet på efferocytes bestemmes av tar fluorescerende bilder av live eller fast celler og kvantifisere mengden bundet versus internalisert mål, som atskilte av streptavidin flekker. Denne tilnærmingen gir flere fordeler sammenlignet med metoder som flowcytometri, nemlig nøyaktig avgrensning av ikke-efferocytosed mot efferocytosed apoptotisk celle fraksjoner, muligheten til å måle efferocytic dynamics live-celle mikroskopi, og kapasitet til å utføre studier av mobilnettet signalering i celler som uttrykker fluorescently-merket effekter av transgener. Kombinert, tjene metodene som er nevnt i denne protokollen som grunnlag for en fleksibel eksperimentelle tilnærming som kan brukes til nøyaktig kvantifisere efferocytic aktivitet og undersøke mobilnettet signalveier aktive under efferocytosis.

Introduction

Apoptose, eller programmert celledød, er en sterkt regulert fysiologisk prosess som skjer i de fleste multicellular organismer og er avgjørende for deres utvikling og homeostase1. I tillegg til å være involvert i normal celle omsetning og embryonale utvikling, apoptose gjør fjerning av infiserte eller skadede celler fra vev og kan utløses svar på infeksjon, betennelse, kreft, og også av medisinske tiltak for eksempel strålebehandling eller steroider1. Apoptotisk celler avsløre “spise-meg” signaler på celleoverflaten deres som gjenkjennes av reseptorer på en rekke profesjonelle og ikke-profesjonell phagocytes, kollektivt referert til som “efferocytes”. Engasjement i disse reseptorene induserer opptak og nedbrytning av apoptotisk cellen ved efferocyte gjennom en prosess som kalles efferocytosis2,3. Fosfatidylserin er best preget spise-meg signal kjøring efferocytosis. Det er vanligvis begrenset til indre heftet av plasma membranen, med apoptose aktivere en lipid scramblase som forstyrrer denne membranen asymmetri, dermed utsette fosfatidylserin på celle overflaten4. Fosfatidylserin finnes på ekstracellulære overflaten av noen ikke-apoptotisk celler, for eksempel eldre makrofager og aktivert blodplater. Disse cellene er imidlertid ikke efferocytosed av «ikke spise meg» signaler, for eksempel CD47, på deres cellen overflaten5,6,7. Utsatte fosfatidylserin gjenkjennes av en rekke efferocytic reseptorer uttrykt av efferocytes. Binding av disse reseptorene til fosfatidylserin, aktiverer enten direkte eller ved hjelp av opsonins, signalveier som fremmer engulfment til apoptotisk-cellen i en membran-bundet vacuole kalt efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome sikringer sekvensielt med endosomes og lysosomer, som leverer den molekylære maskineriet å surheten i efferosome og svekke apoptotisk cellen Last13,14. Når degradert, apoptotisk celle-avledet materiale smugles til gjenvinning endosome – en prosess som begrenser immunreaksjoner mot apoptotisk celle-avledet antigener, og som kan tillate for utvinning av næringsstoffer fra den apoptotisk celle13, 15. Feil i efferocytosis fører til svekket klarering av apoptotisk celler. disse innskuddet cellene gjennom til slutt sekundære nekrose. Nekrotisk celler slipper pro-inflammatoriske cytosolic innholdet, patogener og autoantigens i det ekstracellulære miljøet, dermed kjørte en rekke infeksiøs, provoserende og autoimmune sykdommer16,17. Sammen apoptose og efferocytosis lette fjerning av døende og døde celler og tillate for vedlikehold av vev homeostase.

Undersøker molekylære mekanismer underliggende efferocytosis krever metoder som gir en klar kvantifisering av apoptotisk celle opptak. Denne kvantifisering er komplisert av det faktum at i motsetning til andre opptaket mekanismer som endocytose og fagocytose18,19, efferocytosis ikke kan resultere i engulfment av intakt målcellen, noe som resulterer i stykkevis opptaket apoptotisk cellen av efferocyte20. Protokollen beskrevet her beskriver i vitro efferocytosis analysen som gir nøyaktige avgrensning av den internalisert versus ikke-internalisert deler av personlige apoptotisk celler og kan kombineres med en rekke fast-celle og Live-celle mikroskopi tilnærminger. Tradisjonelle fagocytose analyser legge antistoffer spesifikke phagocytic målet på slutten av eksperimentet for å merke ikke-internalisert mål, mens vår metode forskjellig merking apoptotisk målet med covalently er koblet biotin21 , 22. mens apoptotisk celle spesifikke antistoffer kan brukes i denne analysen biotinylation tilnærmingen gir noe protein-bærende mål merkes og unngår potensielle problemer med sekundær antistoff kryssreaktivitet hvis immunostaining er utført . Spesielt skissere vi utarbeidelsen av apoptotisk Jurkat celler som har vært dobbelt-farget med både celle sporing fargestoff og biotin. Cellen sporing fargestoff tillater apoptotisk celle-avledet materiale sporet under efferocytosis, mens overflaten biotinylation tillater diskriminering av internalisert fra ikke-internalisert deler av efferocytosed apoptotisk celler. Vi beskriver også kultur og utarbeidelse av J774.2 og THP-1 linjer for bruk som murine og menneskelig efferocytes, monocytt-avledet M2 makrofager som et eksempel på primære cellen efferocytosis og Jurkat celler for bruk som efferocytic mål. Disse metodene kan lett brukes på andre linjer eller primære celler, målcellene gjennomgår noen form for celledød (f.eks apoptose, nekrose og necroptosis) og mikron-størrelse imiterer som simulere apoptotisk celler gjennom lipid belegg eller belegg med ligander gjelder for en efferocytic reseptor rundt.

Metoden skissert i denne protokollen har flere fordeler sammenlignet med flyt cytometri basert metoder som vanligvis brukes i feltet23,24. Ved direkte imaging phagocyte-apoptotisk celle samhandling, kombinert med Fjern merking av både total og ikke-internalisert apoptotisk celle materiale, kan kvantitative tiltak av efferocytosis gjøres. Videre begrenser bruk av pH-ufølsom fluorophores forvirrende faktorer som undertrykkelse av FITC og GFP fluorescens ved lysosomale pH som forundrer noen alternative metoder25. Til slutt, mens ikke beskrevet i detalj, disse metodene kan brukes med efferocytes uttrykke fluorescently-merket effekter av transgener, eller med post fiksering immunostai-, å tillate for kvantifisering Signalering molekyl aktivitet og oppfølging av den cellulære prosesser under efferocytosis.

Protocol

Samling av blod fra friske frivillige ble godkjent av helse vitenskap forskning etikk styret av University of Western Ontario. Venipuncture ble utført i samsvar med retningslinjene i Tri-rådet policyutsagnet på menneskelig forskning. 1. kultur og utarbeidelse av THP-1 Monocyte celle linjen Kultur THP-1 reaksjoner som en suspensjon kultur i T25 flasker på 37 ° C + 5% CO2. Celler bør dyrkes i 5 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% fosterets Bovine …

Representative Results

Natten kultur av Jurkat celler med 1 µM staurosporine gir apoptose av > 95% av celler som kan bekreftes med Annexin V flekker (figur 1). Andre celletyper, kan brukes av disse eksperimentene, men konsentrasjonen av staurosporine og staurosporine behandling varighet må være optimalisert for hver celle linje. For pålitelig gjenkjenning og kvantifisering av efferocytosis, > 80% av cellene skal apoptotisk før du legger dem til i efferocytes. Andre indusere av…

Discussion

Metodene som er nevnt i denne protokollen Aktiver bildebehandling og kvantifisering av dynamisk efferocytic prosessen, bruke både fast-celle og live-celle tilnærminger. Disse metodene har flere fordeler sammenlignet med vanlig ansatt flyt cytometri-baserte metoder23,24. Bruk av innsiden ut flekker med fast prøver gir en mer robust og nøyaktig kvantifisering av hastighet og omfanget av efferocytosis-faktisk mange flyt cytometri-baserte metoder bare etiketten a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble finansiert av kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) opererer Grant MOPP-123419, naturvitenskap og Engineering Research Council for Canada Discovery Grant 418194, og en Ontario departementet for forskning og innovasjon tidlig forskning prisen til BH. DGW bidro noen av bildene presentert, optimalisering av protokollene og skrivingen av manuskriptet; Han ble finansiert av en disposisjon stipend fra Universitetet i Liverpool. CY er finansiert av en Vanier Graduate Scholarship og CIHR MD/PhD Studentship. Virkemiddelapparat ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.

Materials

RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529 (2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. , 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863 (1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004 (2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964 (2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -. Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).

Play Video

Cite This Article
Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

View Video