Efferocytosis, fagocyterende fjernelse af apoptotiske celler, er forpligtet til at opretholde homøostase og lettes ved receptorer og signalering veje, der giver mulighed for anerkendelse, engulfment og internalisering af apoptotiske celler. Heri, præsenterer vi en Fluorescens mikroskopi protokol til kvantificering af efferocytosis og aktivitet af efferocytic signaling veje.
At studere regulering af efferocytosis kræver metoder, der kunne nøjagtigt kvantificere optagelsen af apoptotiske celler og sonde til signalering og cellulære processer, der styrer efferocytosis. Denne kvantificering kan være vanskelige at udføre som apoptotiske celler er ofte efferocytosed stykkevis, således nødvendiggør metoder, der kan præcist afgrænse mellem efferocytosed del af et apoptotiske mål versus resterende unengulfed cellular fragmenter. Den metode beskrevet heri udnytter dual-mærkning tilgange for at nøjagtigt kvantificere dynamikken i efferocytosis og efferocytic kapacitet af efferocytes såsom makrofager. Cytosol af cellen apoptotiske er mærket med en celle-tracking farvestof til at aktivere overvågning af alle apoptotiske celle-afledte materialer, mens overflade biotinylation af cellen apoptotiske giver mulighed for differentiering mellem internaliseret og ikke internaliseret apoptotiske celle fraktioner. Efferocytic kapaciteten af efferocytes bestemmes ved at tage fluorescerende billeder af levende eller faste celler og kvantificere mængden af bundne versus internaliseret mål, differentieret ved streptavidin farvning. Denne tilgang giver flere fordele over metoder såsom flowcytometri, nemlig den nøjagtige afgrænsning af efferocytosed versus efferocytosed apoptotiske celle fraktioner, evnen til at måle efferocytic dynamics af live-celle mikroskopi, og den kapacitet til at udføre undersøgelser af cellulær signalering i celler, der udtrykker fluorescently mærket transgener. Kombineret, tjene de metoder, der er skitseret i denne protokol som grundlag for en fleksibel eksperimenterende tilgang, der kan bruges til at nøjagtigt kvantificere efferocytic aktivitet og afhøre cellulær signalering veje aktive under efferocytosis.
Apoptose, eller programmeret celledød er en stærkt reguleret fysiologisk proces, der forekommer i de fleste flercellede organismer og er afgørende for deres udvikling og homøostase1. Ud over at være involveret i normal cellefornyelsen og fosterudviklingen, apoptose giver mulighed for fjernelse af inficerede eller beskadiget celler fra væv og kan udløses i reaktion på infektion, inflammation, kræft, og også af lægelige indgreb såsom strålebehandling eller steroider1. Apoptotiske celler udsætte “spise-mig” signaler på deres celleoverfladen, som er anerkendt af receptorer på en vifte af professionelle og ikke-professionelle fagocytter, kollektivt benævnt “efferocytes”. Engagement i disse receptorer inducerer optagelse og nedbrydning af cellen apoptotiske af efferocyte gennem en proces kendt som efferocytosis2,3. Fosfatidylserin er bedst karakteriseret spise-mig signal drivende efferocytosis. Det er normalt begrænset til den indre folder af plasma membran, med apoptose aktivering en lipid-scramblase, som forstyrrer denne membran asymmetri, dermed udsætte phosphatidylserin på celle overflade4. Fosfatidylserin er fundet på den ekstracellulære overfladen af nogle ikke-apoptotiske celler, såsom modne makrofager og aktiveret blodplader. Disse celler er imidlertid ikke efferocytosed på grund af tilstedeværelsen af “ikke spise mig” signaler, såsom CD47, på deres celle overfladen5,6,7. Udsatte phosphatidylserin genkendes af en bred vifte af efferocytic receptorer udtrykt ved efferocytes. Binding af disse receptorer til phosphatidylserin, aktiveres enten direkte eller gennem støtte af opsonins, signaling veje, der fremmer engulfment af cellen apoptotiske i en membran-bundet vacuole betegnes efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome sikringer sekventielt med endosomes og lysosomer, som leverer de molekylære maskineri for at forsure efferosome og forringe apoptotiske celle cargo13,14. Når nedbrudt, apoptotiske celle-afledte materialer der handles til genanvendelse endosome — en proces, der begrænser immunrespons mod apoptotiske celle-afledte antigener, og som kan give mulighed for genvinding af næringsstoffer fra apoptotiske celle13, 15. En fejl i efferocytosis medfører nedsat clearance af apoptotiske celler; disse uncleared celler underkastes i sidste ende sekundær nekrose. Nekrotiske celler frigive pro-inflammatoriske cytosole indholdet, patogener og autoantigens i det ekstracellulære miljø, således køre en række infektiøse, inflammatoriske og autoimmune sygdomme16,17. Sammen, apoptose og efferocytosis lette fjernelsen af døende og døde celler og giver mulighed for vedligeholdelsen af væv homøostase.
Undersøger de underliggende efferocytosis molekylære mekanismer kræver metoder, der giver en klar kvantificering af apoptotiske celle optagelse. Denne kvantificering kompliceres af det faktum, at i modsætning til andre optagelse mekanismer såsom endocytose og fagocytose18,19, efferocytosis ikke kan resultere i engulfment af intakt målcellen, resulterer i den stykkevise optagelse af cellen apoptotiske efferocyte20. Protokollen beskrevet heri beskriver en i vitro efferocytosis analyse der giver præcise afgrænsning af den internaliseret versus ikke-internaliseret dele af individuelle apoptotiske celler og kan være kombineret med en række faste celle og Live-celle mikroskopi metoder. Traditionelle fagocytose assays tilføje antistoffer specifikke for fagocyterende målet i slutningen af forsøget for at mærke ikke internaliseret mål, hvor det som vores metode adskiller sig ved mærkning apoptotiske målet med kovalent knyttet biotin21 , 22. mens apoptotiske celle specifikke antistoffer kan bruges i denne analyse, biotinylation tilgangen giver mulighed for enhver protein-bærende mål skal være mærket og undgår potentielle problemer med sekundær antistof krydsreaktivitet hvis immunfarvning udføres . Specifikt, skitsere vi forberedelse af apoptotiske Jurkat celler, der har været dual-farves med både en celle tracking farvestof og biotin. Cellen tracking farvestof giver mulighed for apoptotiske celle-afledte materialer skal være spores under efferocytosis, paa overfladen biotinylation giver mulighed for forskelsbehandling af internaliseret fra ikke-internaliseret dele af efferocytosed apoptotiske celler. Vi beskriver også kultur og forberedelse af J774.2 og THP-1 cellelinjer til brug som murine og menneskelige efferocytes, monocyt-afledte M2 makrofager som et eksempel på primær celle efferocytosis og Jurkat celler til brug som efferocytic mål. Disse metoder kan let anvendes på andre cellelinjer eller primærelementer, målceller under enhver form for celledød (fx apoptose, nekrose og necroptosis) og micron mellemstore efterligner, som simulere apoptotiske celler gennem lipid belægninger eller belægning med ligander specifikke for en efferocytic receptor af interesse.
Den metode, der er skitseret i denne protokol har flere fordele i forhold til flow flowcytometri baseret metoder almindeligvis anvendes i feltet23,24. Ved direkte imaging phagocyt-apoptotiske celle interaktion, kombineret med tydelig mærkning af både samlede og ikke internaliseret apoptotiske cellestof, kan kvantitative foranstaltninger af efferocytosis gøres. Desuden begrænser brugen af pH-ufølsom fluorophores konfunderende faktorer såsom undertrykkelsen af FITC og normal god landbrugspraksis fluorescens på lysosomale pH, der tilintetgør nogle alternative metoder25. Endelig, mens ikke beskrevet i detaljer, disse metoder kan være ansat ved hjælp af efferocytes at udtrykke fluorescently mærket transgener, eller med efter fiksering immunfarvning, at give mulighed for kvantificering af signalering molekyle aktivitet og overvågning af de cellulære processer under efferocytosis.
De metoder, der er skitseret i denne protokol aktiverer imaging og kvantificering af dynamiske efferocytic processen, brug af både fast-celle og live-celle tilgange. Disse tilgange giver flere fordele sammenlignet med almindeligt ansat flow flowcytometri-baserede metoder23,24. Brugen af inside-out farvning med faste prøver giver en mere robust og nøjagtig kvantificering af hastigheden og omfanget af efferocytosis — ja, mange flow flowcytometri-baserede metod…
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev finansieret af canadiske institutter for sundhed Research (CIHR) opererer Grant MOP-123419, naturvidenskab og Engineering Research Rådet af Canada Discovery Grant 418194, og en Ontario Ministeriet for forskning og Innovation tidlige Research Award til BH. DGW bidrog nogle af billederne præsenteres, at optimering af protokoller og skrivning af håndskriftet; Han blev finansieret af et pump-priming tilskud fra university of Liverpool. CY er finansieret af en Vanier Graduate stipendium og CIHR MD/PhD Studentship. De finansielle organer spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
RPMI 1640 Media | Wisent | 3500-000-EL | |
DMEM Media | Wisent | 319-005-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
PBS | Wisent | 311-010-CL | |
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72290-08 | Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture |
Staurosporine | Cayman Chemical | 81590 | Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution) |
Annexin V-Alexa 488 | ThermoFisher | R37174 | |
EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
CellTrace FarRed | ThermoFisher | C34572 | |
CellTrace Orange | ThermoFisher | C34851 | |
Hoescht 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
FITC-Streptavadin | ThermoFisher | SA1001 | |
Lympholyte-poly cell sepration medium | Cedarlane Labs | CL5071 | |
Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 200-04 | |
Recombinant Human IL-4 | Peprotech | 300-25 | |
J774.2 Macrophage Cell Line | Sigma-Aldrich | 85011428-1VL | |
THP-1 Human Monocyte Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
Jurkat T Cell Line | ATCC | TIB-152 |